野外采集标本中人埃立克体16S rRNA基因扩增方法及应用

本文应用特异引物 ,通过多对半巢式PCR从采自内蒙古大兴安岭的蜱标本中扩增出人粒细胞埃立克体和查菲埃立克体的 16SrRNA全基因 ,一方面提供了这 2种埃立克体存在于中国的证据 ,另一方面为今后进行埃立克体病的病原、媒介和宿主的调查研究提供了一个可行的方法。并从一只大林姬鼠的脏器中检测到EC

人乳腺癌c-myc基因扩增与年龄和转移能力相关性探讨

用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析法检测了２５例乳腺癌组织中ｃ－ｍｙｃ基因的拷贝数及多态性，发现其中１２例（４８％）有ｃ－ｍｙｃ基因的扩增，长度分别为１３ｋｂ和２３ｋｂ。高龄患者中（≥４５岁），ｃ－ｍｙｃ扩增的阳性率（１１／１６，６８％）高于成年患者（＜４５岁）（１／９，１０％，Ｐ＜０．０５），同时证实，腋窝淋巴结转移出现ｃ－ｍｙｃ扩增的比例（１２／１７，７０％）明显高于无腋窝淋巴结转移者（１／８，１２％，Ｐ＜０．０５）。结果表明，ｃ－ｍｙｃ基因扩增与乳腺癌腋窝淋巴结转移及高龄状态发病有密切关系。我们认为，ｃ－ｍｙｃ经扩增方式激活在更年期女性乳腺癌发生过程中可能起着重要的作用。

喉癌及癌旁组织中癌基因扩增的研究

东北地区是我国喉癌高发病区,为研究喉癌发生的机制,我们用打点杂交法对26例喉癌及其部分癌旁组织中c-myc、c-Ha-ras及c-erb B_2三种癌基因的扩增进行了观察。结果表明,三种癌基因在肿瘤组织中均有扩增;c-myc扩增率为84％(22/26),平均扩增了4倍;C—Ha—ras扩增率为61％(16/26),平均扩增3倍;c—erb B_2扩增率为50％(13/26),平均扩增2倍。癌旁组织中,三种癌基因扩增显著,其中c-Ha-ras的扩增高出肿瘤组织的5倍(P<0.01)。伴有肿瘤复发和转移的病例,其c-Ha-ras、c-erb B_2基因的扩增也有增高趋势。实验结果提示,不仅c-Ha-ras和c-erb B_2基因扩增与喉癌诱发、复发及转移密切相关,同时c-Ha-ras基因扩增的强度可作为追踪喉癌复发风险的线索。

262例中国人黑色素瘤C-KIT基因扩增分析

目的分析中国人黏膜、肢端和非肢端皮肤黑色素瘤C-KIT基因扩增情况。方法采用Real-timeQuantita-tivePCRSYBRgreen染料法检测262例中国人恶性黑色素瘤(MM)C-KIT基因拷贝数变异;存在C-KIT基因扩增的病例,采用PCR扩增和基因测序的方法检测其第9、11、13、17和18外显子突变情况,免疫组化方法检测CD117表达情况。结果 21例患者肿瘤组织中C-KIT基因存在明显扩增,黏膜、肢端和非肢端皮肤黑色素瘤C-KIT基因扩增比例分别为10.20%(10/98)、8.24%(7/85)和5.06%(4/79);其中2例C-KIT基因扩增同时伴突变;C-KIT基因扩增与CD117表达无明显相关性。结论在中国两种最常见的黑色素瘤亚型肢端和黏膜黑色素瘤患者中,部分患者黑色素瘤组织存在C-KIT基因扩增,提示针对这种扩增的特异靶向药物有可能成为该类患者个体化治疗的选择。

胃癌c－myc，c－erbB－2，EGFR癌基因扩增、共扩增及其临床相关性研究

应用斑点杂交技术（ＤｏｔＢｌｏｔ）分析５０例胃癌中癌基因ｃ－ｍｙｃ，ｃ－ｅｒｂＢ－２．ＦＧＦＲ扩增。结果４４％的胃癌存在至少一个癌基因扩增，其中ｃ－ｍｙｃ扩增率２２％（扩增２～６倍），ｃ－ｅｒｂＢ－２１４％（扩增２～７倍），ＦＧＦＲ１６％（扩增２～９倍）。发现了４例癌基因共扩增。扩增与胃癌临床相关性研究表明，癌基因扩增与肿瘤的恶性程度存在相关性，累积有更多扩增事件的病例预后更为不良。

血液病念珠菌感染基因扩增检测技术建立及临床应用

目的 针对血液病真菌感染日益严重趋势 ,建立念珠菌基因扩增技术并应用于临床。方法 本研究应用Lyticase破真菌壁提取DNA ,采用二对引物分别对白色念珠菌EO3 12 5bpDNA和念珠菌细胞色素P4 5 0L1A12 4 3bpDNA进行基因扩增 ;并分别对白色念珠菌标准株、临床样本株、其他念珠菌和不同细菌菌株进行基因扩增特异性比较 ,同时应用该技术检测血液病患者痰液和血液中念珠菌。结果 基因扩增显示EO3 12 5bpDNA只有标准株和临床样本白色念珠菌阳性 ,细胞色素P4 5 0L1A12 4 3bpDNA具有念珠菌种的特异性 ,临床血液和痰液标本检测阳性率显著提高 ,与临床病情一致。结论 血液病念珠菌感染基因扩增技术敏感性、特异性显著增强 ,而且耗时显著缩短 。

基因扩增分析(PCR)仪温控系统的研究与应用

分析了基因扩增分析(PCR)仪的工作原理及提高PCR仪温度控制精度的技术,详细讨论了温度控制系统的软硬件设计,研制了一种新颖的PCR温度控制系统。

一种改进的SON-PCR基因扩增方法

单侧寡聚核苷酸嵌套PCR(single oligonucleotide nested PCR,SON-PCR)是一种简便易行的由已知序列克隆其侧翼序列的方法,但该法的第二轮PCR反应引发效率低,而且得到的产物两端含相同的引物序列,不可直接测序.针对该问题,将第二轮PCR改进为两段式扩增,即先以单侧嵌套引物引发5′端做选择性线性扩增,然后再加入第一轮引物特异引发3′端,使特异性和效率都得到很大提高,并可用PCR产物直接测序.分别用已报道的和改进的SON-PCR法克隆Botrytis cinerea羟甲基戊二酰CoA还原酶基因侧翼序列,后者获得期望结果,证明改进的SON-PCR方法行之有效.国内外尚未见同类报道.

c－erbB－2基因扩增与胃癌预后的关系

应用差异聚合酶链反应方法，检测９０例胃癌（早期胃癌３０例）组织中ｃ－ｅｒｂＢ－２基因扩增情况，以探索该基因扩增与胃癌预后关系及临床应用价值。结果表明，２２．２％（２０／９０）胃癌组织中存在ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增，其与淋巴结转移关系密切（Ｐ＜０．０５）；而与肿瘤组织学类型及浸润深度无关。在胃癌原发灶及对应受侵淋巴结中，两者ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增无明显差异。生存期分析显示，ｃ－ｅｒｂＢ２扩增者预后差，５年生存期短（Ｐ＜０．０５），其中在３０例早期胃癌中，有４例ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增，５年内死亡２例，全部为扩增者．本文结果提示ｃ－ｅｒｂＢ－２检测可能有助于胃癌预后判断及在早期胃癌中进行高危组别筛选。

细菌分离与基因扩增确诊水貂出血性肺炎

经细菌分离培养与小鼠接种实验,从急性死亡、鼻孔流血和剖检表现为出血性肺炎的急性死亡水貂脏器中分离获得可使小鼠死亡的革兰阴性,单个、成双或呈短链状的中等大小杆菌。应用绿脓杆菌16S核糖体DNA引物进行PCR扩增与序列分析,得到与预期片段大小相一致的片段,经序列测定证明与假单胞菌属的绿脓杆菌16S核糖体DNA序列相一致。药敏试验表明该细菌对氟苯尼考敏感,临床应用该药后疫情得到迅速控制。

宫颈鳞状上皮病变中EGFR蛋白表达及基因扩增的临床意义

目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)蛋白在宫颈鳞状上皮内瘤变和鳞状细胞癌中的表达及基因扩增,并评估其在宫颈癌发生、发展和预后中的价值。方法分别应用免疫组化EnVision法和荧光原位杂交(FISH)技术检测75例宫颈各种病变组织中的EGFR蛋白表达、基因扩增及基因拷贝数的变化,其中慢性宫颈炎10例,低级别鳞状上皮内瘤变(CIN)16例,高级别CIN 25例,宫颈癌24例。结果 EGFR在高级别CIN和宫颈癌中的阳性表达率分别是76%和79.17%,而在慢性宫颈炎和低级别CIN中的阳性表达率分别是10%和43.75%。高级别CIN和鳞癌中的基因扩增阳性率为25%,而慢性宫颈炎和低级别CIN中的阳性率为3.33%。42例EGFR阴性或低等阳性病例中FISH检测出26例(61.9%)二倍体和11例(26.2%)三倍体,而20例EGFR中等或强阳性病例中却有13例(65%)为多倍体或单纯EGFR基因扩增;所有EGFR基因扩增病例的蛋白表达均为中～强(+)。结论 EGFR可能参与了宫颈癌的发生,并且是宫颈癌发生的早期事件。EGFR蛋白过表达可能由EGFR基因扩增或基因拷贝数增加所致。

有机磷抗性致倦库蚊种群中酯酶基因扩增的定量分析

致倦库蚊Culexqinquefasciatus是丝虫病的主要传染媒介。通过生物测定、单个蚊虫酯酶α2和 β2基因拷贝数分析和酯酶 β基因序列比较 ,分析了抗性水平、抗性相关基因在种群中的分布及其基因拷贝数等的抗性分子特征。应用快速PCR仪(real timequantitativePCRs)直接检测库蚊中酯酶基因和mRNA拷贝数。结果显示 :上海致倦库蚊对对硫磷的抗性LC50 为8 12 ,酯酶活性升高是上海致倦库蚊种群对有机磷杀虫药剂产生抗性的主要机理。编码致倦库蚊酯酶 β的氨基酸序列同编码尖音库蚊酯酶B1的氨基酸序列相比同源性为 98% ;同致倦库蚊酯酶B2氨基酸序列相比同源性为 10 0 % ,同环蹶库蚊酯酶B3氨基酸序列相比同源性为 90 % ,上海致倦库蚊中酯酶α和 β基因均扩增。有机磷抗性的上海和PellRR蚊虫种群中单个蚊虫酯酶α2和β2定量基因拷贝数均不同 ,其同一蚊虫个体的酯酶α2比酯酶 β2基因的拷贝数高 ,但没有明显的规律性 ,酯酶结构基因的扩增是上海致倦库蚊种群对有机磷杀虫药剂抗性的主要机理 ,估计在野外种群的杂合个体中存在多种调控机制。

禽大肠杆菌O_2、O_(78)菌株外膜蛋白A基因扩增及序列分析

根据Genbank中大肠杆菌K 12外膜蛋白A基因的核苷酸序列设计引物,从禽大肠杆菌O2、O78及它们的融合株O2,78(ChlrNorr)中分别扩增得到外膜蛋白A基因(ompA),进行序列测定及分析发现3个菌株的ompA均由2276nt组成,核苷酸序列完全相同,只有一个大的开放性阅读框(ORF),长1041bp,编码由346个氨基酸组成的前外膜蛋白A(pro OmpA),前21个氨基酸残基组成信号肽,成熟的OmpA由325个氨基酸残基组成,相对分子质量为37000.其氨基酸序列也完全相同.从基因水平上证明了禽大肠杆菌O2和O78菌株存在相同的外膜蛋白A抗原.

胃癌c－erbB－2蛋白高表达及其与c－erbB－2基因扩增的关系

胃癌ｃ－ｅｒｂＢ－２蛋白高表达及其与ｃ－ｅｒｂＢ－２基因扩增的关系黄焰，宋廷惠，蒋彦永，陆应麟，陈立军关键词胃癌，ｃ－ｅｒｂＢ－２，高表达，扩增中国图书分类号Ｒ７３５．２生长因子受体类癌基因ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增或高表达已发现与部分胃癌的恶性发展密切相...

基因扩增联合测序法对痰标本分离的60株真菌病原学鉴定

目的:应用PCR扩增真菌ITS2区基因,结合基因测序法对痰标本中分离的60株真菌进行病原学鉴别。方法:收集痰标本分离的真菌菌落60份及2种真菌标准菌株(白色念珠菌,烟曲霉菌)培养菌落,分别提取基因组DNA,半巢式PCR扩增ITS2区,扩增产物经测序后,结果与NCBI基因库中的核酸序列进行比对,确定致病菌的种属,并对其分布特征进行分析。结果 :2种真菌标准菌株的ITS2区基因序列比对结果与种属一致。痰标本中60株真菌测序鉴定结果为:曲霉菌属24株(其中烟曲霉菌17例、黑曲霉菌3例、黄曲霉菌2例、土曲霉菌1例、变色曲霉1例),青霉菌属3株(小刺青霉菌1株、娄地青霉菌1株、产黄青霉菌1株),念珠菌属29株(白色念珠菌20株、热带念珠菌3株、近平滑念珠菌2株、光滑念珠菌2株、鲁西坦念珠菌1株、季也蒙毕赤酵母菌1株),其它丝状菌还有暗孢节菱孢菌2株,淡紫拟青霉菌1株和串珠状赤霉菌1株。结论:基因测序法能快速、简便、准确地鉴别痰培养的真菌种属,为本地区呼吸道真菌性疾病病原菌流行病学调查及个性化治疗奠定基础。

环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌的研究

目的建立藤黄微球菌的环媒恒温基因扩增检测方法。方法基于藤黄微球菌23S rRNA基因部分序列设计1套(共4条)能够识别6个区域的特异性引物;优化扩增条件;评估该方法的特异性与敏感性。结果用7个参考株和大肠埃希菌等8种其他临床病原菌检验本检测法,成功地建立了环媒恒温基因扩增(LAMP)检测法。结论环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌快速、灵敏高、特异性强。

带前馈补偿的基因扩增反应高精度温控系统

介绍了基于半导体制冷器的基因扩增反应高精度温度控制系统。系统设计中,针对基因扩增反应热循环过程的自身特点和系统模型的惯性特征,采用了带前馈补偿的复合控制算法来改善控制性能。试验结果表明,包括前馈、PID及Bang-Bang控制在内的复合控制策略提高了热循环升降温速率和稳态控制精度,性能指标明显优于传统PID控制。

FISH检测乳腺癌HER2基因扩增及临床病理关系的研究

目的:探讨荧光原位杂交(FISH)检测原发性乳腺癌组织中HER2基因扩增与临床病理的关系。方法:收集2007年11月至2009年8月手术切除的乳腺癌组织标本105例,采用FISH方法检测HER2基因扩增情况,分析其与临床病理的关系,同时比较FISH与免疫组化(IHC)检测结果的相关性。结果:105例乳腺癌中共有39例HER2基因扩增,阳性率为37.1%(39/105),其扩增与HER2蛋白过表达、组织学分级、雌激素和孕激素受体(均P<0.05)状态有关;FISH与IHC两种方法检测HER2结果密切相关(rs=0.680,P<0.05)。结论:HER2基因扩增与乳腺癌发生发展及临床预后密切相关,可作为乳腺癌治疗的理想靶点。

髓母细胞瘤中表皮生长因子受体的表达及基因扩增分析

目的 研究表皮生长因子受体在髓母细胞瘤中的蛋白表达及基因水平的扩增情况,从而分析二者关系。方法 对48例髓母细胞瘤标本进行免疫组化染色,同时进行差异多聚酶链反应,放射自显影后根据其信号强弱来判断基因的扩增情况。结果48例髓母细胞瘤中有7例表皮生长因子受体呈阳性表达（14.58％）,其中成人6例,儿童1例;差异多聚酶链反应未显示表皮生长因子受体有基因水平的异常扩增。结论 表皮生长因子受体蛋白的过度表达存在于髓母细胞瘤,尤以成人为主,但其机制可能与基因的异常扩增无关。