论非法植入基因编辑、克隆胚胎罪保护法益

随着世界范围内基因编辑技术的发展,人类有了攻克遗传疾病的希望。但是“基因编辑婴儿”案的出现,使我们必须思考如何通过法律来防范基因编辑技术对人类生活的冲击。在刑法规制层面,准确把握非法植入基因编辑、克隆胚胎罪的保护法益是进一步思考的前提。既往的研究将该罪法益限定为人性尊严、医疗秩序或人类遗传安全,但这并非真正的适格法益,无助于法益机能的发挥。合理界定该罪法益的方向应当是综合分析规范目的、法益性质、价值判断以及行为对象。基于以上方法,将非法植入基因编辑、克隆胚胎罪的保护法益确定为人类遗传基因具有合理性。该法益界定一方面明确了“情节严重”的类型,另一方面可以作为出罪事由的判定标准,划定了犯罪行为与科研行为的界限。

非法植入基因编辑胚胎罪的法益构造与规范适用

非法植入基因编辑胚胎罪的保护法益存在着人类尊严、胚胎权利、科研伦理、公共安全、卫生管理秩序和人类遗传安全等诸多观点。然而,非法植入基因编辑胚胎的行为并非必然造成受试者和胚胎的生命健康损害,也不宜将过于抽象和浮动变化的客体界定为法益。因此,非法植入基因编辑胚胎罪的法益应为“人类基因安全”为宜。该法益为集体法益,无法被还原为个人法益,具有独立的存在价值。该罪为抽象危险犯,应对“情节严重”予以明确,并将基因编辑行为对人类基因安全这一法益的侵害紧迫性作为“情节严重”的实质判断标准,以限制法益前置化保护对国家刑罚权的扩张。

滥用基因编辑技术的刑法应对与司法认定——以《刑法》第336条之一为视角

滥用基因编辑技术行为的社会危害决定了其入罪的必然性和合理性,但是其入罪历程一波三折,相关条文在两次审议中都进行了相应修改。从立法本义出发,非法植入基因编辑、克隆胚胎罪的保护法益并非不确定的风险,当前也不存在具体可违反的秩序法益,应将其界定为以人类胚胎为载体的生命健康以及人格尊严。作为行为犯,该罪的既遂应以植入行为完成为标准。同时,本罪的成立还需在行为完成的基础上考虑情节是否达到严重的程度。

CRISPR基因编辑技术加速蔬菜作物遗传改良

现代生物技术,特别是基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术,对作物遗传改良产生了深远影响。本文综合分析了CRISPR/Cas基因编辑系统的组成、机制,综述了基因编辑技术在蔬菜作物基因功能验证和作物遗传改良方面取得的突破性进展,及其在蔬菜作物如番茄、西瓜、甘蓝、胡萝卜和黄瓜等中的应用。CRISPR/Cas基因编辑系统是目前应用最广泛的基因编辑系统,为了加深对CRISPR/Cas基因编辑系统的了解、促进其在蔬菜作物改良中的重要作用,本研究探讨了影响遗传转化效率的因素,提出了提高转化效率的策略,讨论了当前技术的局限性,如作物转化再生难度和基因型的依赖性。本文强调,筛选易于遗传转化的品种、开发高效的植物转化和再生系统,以及创造更高效、精确和多功能的基因编辑工具是未来研究的关键方向。

基于CRISPR/Cas9的棉花GhbHLH71基因编辑突变体的分析

碱性/螺旋-环-螺旋(basic/helix-loop-helix,bHLH)转录因子在植物的生长发育、次生代谢、信号转导、逆境胁迫等方面起重要的调控作用。棉花GhbHLH71基因c DNA全长996 bp,编码331个氨基酸残基,蛋白序列中含有保守的bHLH结构域,属于bHLH转录因子家族成员。实时荧光定量分析结果表明,GhbHLH71基因在棉花纤维快速伸长期3~12 DPA (days post anthesis,DPA)相对高表达,暗示其主要在棉花纤维发育过程中发挥作用。构建该基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体进行了棉花遗传转化,T_0代再生株经过Cas9基因的PCR检测以及靶位点突变情况检测分析,获得6个T_0代基因编辑突变体。T_1代不同突变株系在棉花生长发育期的表型性状与对照相比无明显差异,但成熟纤维的长度与对照相比皆明显变短。T_2代突变株系可以稳定遗传T_1代株系纤维变短的表型。其中4#和8#株系连续2代的纤维长度与对照相比缩短比率皆达20%以上,表明GhbHLH71基因的突变主要影响了棉花纤维细胞的伸长。本研究为深入了解棉花中bHLH转录因子的生物学功能以及棉花纤维发育的分子机制提供了一定的参考。

“藕断丝连”的CRISPR/Cas:基因编辑中靶点滞留的作用与挑战

成簇规律间隔短回文重复(clustered regulation interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白质(CRISPR-associated protein,Cas)系统被广泛应用于基因组编辑、转录调控以及细胞实时成像等,并已在农业、工业和医学等领域展示出巨大的应用潜力。该技术的应用取决于CRISPR/Cas的五大属性:靶向、解旋、切割、滞留和旁切。本综述将主要以化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR/Cas9为例,聚焦于CRISPR/Cas的滞留属性,梳理相关进展,讨论其在基因编辑技术开发中的应用与挑战。

非法植入基因编辑、克隆胚胎罪的解释学审视——对立法批判论的回应

非法植入基因编辑、克隆胚胎罪设立后,学界存有部分反对观点认为本罪分则位置及实行行为的规定存在问题。基于解释论的立场,本罪保护法益为基因库安全、人性尊严以及公共卫生管理秩序,立法通过对形式法益的保护一并实现了对实质法益的保护,且公共卫生管理秩序是主要法益,故本罪在刑法分则中的体系位置无可厚非。因为“植入人或动物子宫”的行为是实现生殖系基因编辑或生殖性克隆目的的必经阶段,所以本罪实行行为的规定在技术层面上彻底断绝了被基因编辑、克隆的细胞发育成存活个体的机会,从而达到了对该犯罪行为规制的立法目的。

农业基因编辑产品检测动态及发展趋势

基因编辑技术是重要的生物育种技术之一。随着生物育种产业化的高速发展,农业基因编辑产品呈现快速增长态势,然而其标识溯源检测技术的研发速度难以匹配知识产权保护和安全监管的需求,严重制约了产业的发展,亟需研发与现行检测体系相适应的基因编辑产品检测技术与方法。从主要的基因编辑系统和技术优势、靶点编辑类型着手,分析了不同类型基因编辑产品检测技术的特征和优缺点,提出了检测技术创新、检测与评价技术融合、监管技术体系细化三方面建议,以期为农业基因编辑产品标识、溯源技术研究提供参考,为完善我国农业生物技术产品监管体系提供技术支撑。

CRISPR/Cas9技术高效制备山羊SOCS2基因编辑胚胎

旨在设计、筛选高效编辑山羊胚胎生长负调控因子SOCS2基因的sgRNA,为通过SOCS2基因编辑创制快长型山羊奠定技术基础。本研究利用在线网站对山羊SOCS2基因SH2结构域保守序列设计2条sgRNA,构建表达载体,体外转录获得sgRNA及Cas9 mRNA;体外检测sgRNA+Cas9蛋白切割靶DNA的效率;在此基础上将屠宰场山羊卵巢分离培养的442个孤雌胚胎进行分组,2个试验组显微注射sgRNA和Cas9 mRNA混合物,对照组注射超纯水,以单个囊胚全基因组DNA扩增产物为模板,PCR扩增靶区域并测序鉴定,发生编辑的样本进行T-A克隆测序检测编辑形式;根据在线网站预测,每条sgRNA选择5个错配数最少的潜在脱靶位点进行脱靶检测。结果表明,在SOCS2基因83和96号氨基酸密码子附近区域获得2条sgRNA并成功构建表达载体,体外转录获得高质量sgRNA和Cas 9 mRNA;两条sgRNA均可引导Cas9蛋白在体外完全切割靶DNA;SOCS2-sg-83对胚胎的编辑效率为94.1%,160个T-A克隆中有152个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为95.0%,其中81.3%发生了移码突变,9.4%的克隆缺失83号氨基酸密码子,累计90.6%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除;SOCS2-sg-96对胚胎的编辑效率为50.0%,80个T-A克隆中有70个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为87.5%,移码突变概率为75.0%,5.0%的克隆缺失了96号氨基酸密码子,累计80.0%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除。另外,在所有已编辑胚胎中均未发现脱靶。综上,SOCS2-sg-83可实现山羊胚胎SOCS2基因的高效、精准编辑和敲除,为高效制备SOCS2基因敲除山羊,培育快长型肉用山羊奠定了技术基础。

CRISPR/Cas基因编辑及其新兴技术在丝状真菌研究中的系统应用

丝状真菌(filamentous fungi)具有独特的形态和细胞构造,与人类健康和工农业生产息息相关,对这类生物资源的开发和利用高度依赖高效的基因编辑平台。然而,由于丝状真菌复杂多样的遗传背景,使用传统的基因编辑技术较难实现大范围的基因编辑,极大地妨碍了丝状真菌的遗传学研究。CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein)技术的出现,打破了这一困境,促进了不同种属和不同来源的丝状真菌的基因编辑,为丝状真菌的基础和应用研究带来了革命性的突破。本文简述了CRISPR/Cas系统的作用机理、分类及基于CRISPR的各种新型技术,归纳总结了丝状真菌中现有的CRISPR/Cas9系统功能组分、多种新兴CRISPR/Cas技术在丝状真菌中的应用现状以及海洋真菌中的CRISPR/Cas技术的应用情况。最后,对CRISPR/Cas系统在丝状真菌中应用进展缓慢、编辑效率低和脱靶效应等问题以及针对这些问题的潜在解决方法进行总结和展望,以期为不同类型的丝状真菌基因编辑平台的构建提供参考。

肠道类器官基因编辑技术的研究进展

肠道类器官是一种新兴的实验模型,具有模拟体内器官结构和功能的特性,广泛用于肠道疾病与功能变化的研究。近年来,研究者们将基因编辑与肠道类器官结合,为探究疾病的发生机制和研发针对性的治疗手段提供了可能。本篇综述旨在回顾基因编辑技术在肠道类器官中的应用,并探讨其在疾病建模、药物研发等领域的发展前景。

CRISPR/Cas9基因编辑系统在作物抗性品种选育中的应用

CRISPR/Cas9基因编辑技术因周期短、效率及精确度高、载体构建简单等优点,成为目前作物抗性品种选育的最佳分子育种工具。概述了CRISPR/Cas9基因编辑系统的基本原理,分析总结了该系统在作物抗旱性、抗盐性、抗冷性、抗重金属盐及抗除草剂品种选育中的应用,以期为进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术选育更多优质作物抗性品种提供参考。

CRISPR/Cas9基因编辑技术在羊育种功能基因验证中的应用研究进展

基因编辑技术是一种对目的基因进行特定修饰的技术,被广泛应用于生物育种、疾病模型构建等研究领域。CRISPR/Cas9系统由重复和间隔单元组成的CRISPR阵列和一个Cas基因座位组成,能够对生物体性状进行目的基因定点编辑,具有简单、精确且高效的特点。CRISPR/Cas9基因编辑技术通过引入基因敲除、基因敲入、缺失、点突变和单核苷酸突变等不同形式的修饰广泛应用于畜禽的基因编辑,以研究畜禽关键基因功能,从而加速性状改良。相较于猪、鸡等其他畜禽,CRISPR/Cas9技术对羊的研究相对滞后。文章重点阐述了CRISPR/Cas9基因编辑技术在羊育种功能基因验证中的应用,对其在产肉性状、纤维性状、泌乳性状和人类疾病模型等方面的应用研究进展及前景进行了简要概述,以期为我国羊产业的可持续发展提供参考。

基因编辑猪在异种肝脏移植中的研究进展

肝移植是治疗终末期肝病的唯一确切有效选择,目前供肝资源严重匮乏已成为肝移植发展的最大障碍,异种肝脏移植为解决这一问题开辟了新思路。猪在遗传学、解剖结构、器官大小、营养代谢及生理生化特征方面与人的相似性较大,是异种肝脏移植的理想供体来源。随着基因编辑技术的进步,基因编辑猪在异种肝脏移植领域中的研究与应用快速发展,为解决肝脏供需失衡问题提供了可行性。

不同毛色ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊皮肤组织中黑色素分布及ASIP蛋白的表达定位

为了研究ASIP基因在中国美利奴细毛羊被毛颜色形成过程中的作用机制,试验分别选取体况良好的3只野生型纯白色中国美利奴细毛羊,20只纯白色、8只棕色和10只黑色ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊背部的皮肤组织,通过H.E.染色对比样本皮肤组织结构及黑色素分布差异;采用免疫组织化学染色检测ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊白色、棕色、黑色3种皮肤组织中ASIP蛋白的表达定位情况。结果表明:野生型与ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊的皮肤均由表皮、真皮、皮下结缔组织3部分组成,且表皮层最薄,各毛色皮肤结构组成无差异;黑色素颗粒主要分布于黑色、棕色ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊皮肤组织的毛囊、毛干中,且黑色较棕色皮肤组织中分布的黑色素颗粒更为密集,而在白色被毛的野生型和ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊皮肤组织中均未发现黑色素颗粒;ASIP蛋白在白色被毛的ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊的表皮、毛囊外根鞘、毛乳头周围的毛基质中大量存在,在棕色、黑色皮肤组织中几乎不存在。说明ASIP蛋白在特定部位的表达情况与ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊的白色被毛毛色的发生相关。

基因编辑及全基因组选择技术在水稻育种中的应用展望

水稻是我国主要的粮食作物。由于我国人多地少的现状,长期以来水稻的育种目标是以产量为导向。我国科研人员通过协同攻关实现了水稻育种技术突破,矮化育种和杂交水稻育种技术的利用促进了水稻产量两次大的飞跃。随着我国消费者生活水平的提高以及极端天气出现的频次上升,水稻育种对品质、抗性与耐逆等也提出了更高要求。目前,生物技术正在不断革新,特别是基因编辑和全基因组选择育种技术的迅速发展,为高产优质多抗耐逆的水稻新品种选育提供强有力支持,推动着我国水稻生产向绿色可持续发展。本文就基因编辑技术和全基因组选择技术在水稻高产优质、抗病虫、耐逆及杂种优势育种应用中的新进展进行简述,旨在为高效培育能够满足市场需求的水稻新品种提供一些育种思路。

基于CRISPR/LanCas9的水稻基因编辑系统的开发和优化

【目的】在水稻中建立CRISPR/LanCas9和CRISPR/SLanCas9基因编辑系统,扩展CRISPR/Cas基因编辑工具箱。【方法】将来自动物乳酸杆菌KCTC 3501的LanCas9进行密码子优化,并且进一步通过蛋白融合重组LanCas9和SpCas9的活性结构域形成嵌合体SLanCas9,分别构建CRISPR/LanCas9和CRISPR/SLanCas9编辑工具;以OsWRKY45、OsCPK4、OsCPK6、OsCPK7、OsMPK8、OsGSK3、OsGSK4为靶基因,在NGG PAM或者NAG PAM设计20 nt或者24 nt的sgRNA,通过水稻遗传转化,检测分析其编辑效率。【结果】LanCas9在水稻中可以识别NGG PAM,结合20 nt的sgRNA编辑效率更高,对OsWRKY45基因的编辑效率为25.00%;融合的SLanCas9不仅能够识别NGG PAM,在NAG PAM位点也有一定的编辑效率,在不同PAM位点的编辑效率分别可达100%和39.58%。此外,SLanCas9还具有多重基因编辑能力,在NGG PAM位点的多重基因编辑效率高达74.07%。【结论】开发了具有自主知识产权的新型CRISPR/LanCas9和CRISPR/SLanCas9基因编辑技术。

基于小型化Cas蛋白的CRISPR/Gal4BD-Cas供体适配基因编辑系统研究

在哺乳动物细胞中,利用同源引导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因编辑策略能够实现精准的点编辑和敲入,但是HDR的低效性严重制约了该策略在精准医疗和分子设计育种中的应用。鉴于HDR机制所需的供体DNA模板不能自主募集到基因组双链断裂(double-stranded break,DSB)处,本课题组提出了供体适配系统(donor adapting system,DAS)的概念并开发出CRISPR/SpCas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统。由于SpCas9蛋白分子较大,与Gal4BD适配器结合不利于表达、病毒载体包装及活体递送等过程,因此本研究进一步采用两种小型化Cas蛋白——路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源SlugCas9变体SlugCas9-HF与氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)源AsCas12a,开发了新型的CRISPR/Gal4BD-SlugCas9和CRISPR/Gal4BD-AsCas12a供体适配基因编辑系统。通过SSA活性报告实验初步证明了Gal4BD与SlugCas9、AsCas12a N-端融合对其打靶活性影响较小。通过HDR效率报告实验进行功能验证并优化供体设计方案,结果表明:对于CRISPR/Gal4BD-AsCas12a DAS,适配器结合序列(binding sequence,BS)与供体5′-端融合(BS-dsDNA)效果较好;对于CRISPR/Gal4BD-SlugCas9 DAS,则BS与供体3′-端融合(dsDNA-BS)较佳。最终,利用CRISPR/Gal4BD-SlugCas9 DAS对HEK293T细胞中的EMX1、NUDT5、AAVS1三个基因位点分别实现了24%、37%、31%的精准编辑,相比对照组得到了显著提高。本研究为供体适配基因编辑系统的进一步优化提供了参考和借鉴,为后续动物分子设计育种应用研究提供了新的基因编辑工具。

利用CRISPR/Cas9基因编辑片段敲除技术创制玉米多样化等位变异

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制等位变异已经成为众多植物中增加种质资源多样性的重要手段。提高玉米等谷物中类胡萝卜素含量是发展中国家解决维生素A缺乏症的一种经济方法。本研究以玉米中调控类胡萝卜素合成的基因crtRB1为研究对象,利用双靶标片段缺失性基因编辑技术,在原生质体中对crtRB1的启动子顺式元件进行片段敲除,获得了具有片段缺失和InDel(插入或缺失)的多样化等位变异,这为在玉米中实现稳定的crtRB1启动子元件的缺失突变奠定了基础,对启动子元件的功能研究和玉米的品质改良具有重要意义。

基于CRISPR/Cas9技术的全基因组基因编辑MDCK细胞文库的构建

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先靶向犬全基因组设计合成转录sgRNA的DNA文库,并将DNA文库全部克隆于lentiCRISPR v2慢病毒转移载体上,高通量测序结果显示文库覆盖度高、均一性良好。将质粒文库和慢病毒包装系统质粒共转染293T细胞,收取含慢病毒样病毒的上清液感染MDCK细胞,在最适浓度嘌呤霉素筛选下,收集嘌呤霉素抗性细胞,冻存于-80℃,提取一部分细胞的基因组,通过PCR扩增转录sgRNA的DNA,将PCR产物插入到T载体后,挑取单克隆菌落,测序表明细胞文库中转录的sgRNA具有较好的覆盖度。本实验成功构建了犬全基因组范围转录sgRNA的质粒文库,并成功构建了MDCK细胞全基因组范围的基因编辑细胞库,该文库可作为后续筛选病毒复制关键宿主因子的细胞平台。