基于超声波下淀粉纳米颗粒作载体的基因转导

报道了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒(PLL-StNP)在超声波介导下作基因载体的研究,实验发现DNA-PLL-StNPs复合物经过超声波处理不同的时间后的电泳分析显示,结合的DNA受到保护,其生物学性质没有改变;将pIRGFP质粒DNA-PLL-StNPs复合物与COS-7细胞混合,在120W和40kHz的超声波强度下处理2min,细胞表达绿色荧光蛋白的比率最大,达到70%.这种基于超声波下淀粉纳米颗粒作载体的基因转导方法可被广泛应用于动物转基因技术和人类基因治疗,同样可被广泛应用于植物转基因技术.

葡萄基因转导研究进展

简述了转基因技术与常规育种手段的关系,从基因转导途径和影响因素两方面综述了葡萄近年来基因转导的研究进展。葡萄基因转导途径主要有农杆菌介导法和基因枪法,并通过前者以砧木110R的体胚为材料获得了转基因植株;用后者轰击无核白试管叶片的体胚,提高了转化率。影响转导的因素主要从受体与再生系统、转化细胞的筛选与检测、培养方法与培养条件等方面进行论述,最后对葡萄基因工程进展及展望进行了讨论,探索出一条高效的再生途径仍然是目前主要的任务。

人肿瘤坏死因子-α基因转导绒癌耐药细胞系体外耐药逆转的研究

目的 将人肿瘤坏死因子 alpha(hTNF α)基因导入已建立的绒癌耐药细胞系 ,观察hTNF α基因转导后对绒癌细胞耐药性逆转的体外作用。方法 通过阳离子脂质体将hTNF α基因转导绒癌耐药细胞系 ,用新霉素筛选含hTNF α片段的单细胞克隆 ,用RT PCR方法和细胞免疫组织化学方法 ,检测转导hTNF α基因的耐药细胞中MDR1mRNA和MDR1蛋白 (P gp)表达水平的改变。采用四甲基偶氮唑蓝比色法 ,检测转导hTNF α基因的耐药细胞对足叶乙甙 (VP 16 )的耐药指数。结果 转导hTNF α基因后 ,绒癌耐药细胞中检测出hTNF αmRNA表达 ,转导hTNF α基因在mRNA水平能一定程度的逆转绒癌耐药细胞的MDR1,而在P gp蛋白水平几乎能完全逆转绒癌耐药细胞的MDR1。转导hTNF α基因的细胞的耐药指数明显降低。结论 hTNF α基因转导后 ,可通过调节MDR1的表达 。

肿瘤细胞基因转导载体聚乙烯亚胺的合成及筛选

背景与目的:选择合适的载体是基因治疗成功的关键之一,近年来一种新型多聚阳离子化合物——聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)作为高效低毒的基因转导载体得到广泛重视。本研究应用光化学法制备系列不同粒径的PEI纳米凝胶,初步探讨其转导效率与粒径之间的关系,筛选理想的肿瘤基因转导载体。方法:光化学法制备PEI,光相干光谱仪测定粒径,并用扫描电子显微镜和原子力显微镜表征;以PEI为载体将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)报告基因分别转入Bel7402细胞和A549细胞,荧光显微镜下计数和流式细胞仪检测转染率。结果:光相干光谱仪检测PEI粒径38～200nm,扫描电子显微镜和原子力显微镜检测其形貌多为球形。荧光显微镜下计数和流式细胞仪检测86.9nmPEI(4μg)介导EGFP基因(2μg)时转染率最高,Bel7402细胞分别为(32.75±1.01)%、(32.40±1.41)%,A549细胞分别为(29.81±1.84)%、(30.00±1.86)%;与脂质体相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:光化学法合成的PEI是有效的基因转导载体,PEI粒径为86.9nm转染最为有效。

hNIS基因转导黑色素瘤细胞介导^(125)I摄取的实验研究

目的 探讨克隆的人钠 碘同向转运体 (hNIS)基因cDNA的生物学性能及其用于黑色素瘤放射治疗的可能性。方法 用反转录 聚合酶链反应 (RT PCR)从人甲状腺组织总RNA中扩增出hNIS基因cDNA序列 ,将其克隆至pUCm T载体并亚克隆至真核载体pcDNA3中 ,电击法将重组质粒导入黑色素瘤细胞 (B16 )建立新细胞系 (B16 A) ,在体外培养条件下研究其对放射性碘的摄取及外流情况。结果 成功克隆了hNIS基因 ,建立了能稳定表达hNIS基因的新型细胞系B16 A和单转空质粒pcDNA3的细胞系B16 B。B16 A细胞的摄碘能力较B16细胞高 17倍 ,较单转空质粒pcDNA3细胞系B16 B高 19倍。碘的外流过程十分迅速 ,有效半衰期 (T1 2 )仅 10min。结论 体外培养条件下 ,hNIS基因转导黑色素瘤细胞其本身足以介导碘的摄取 ,但有效半衰期较短 ,有待进一步研究如何增加放射性碘的摄取量及延长其细胞内滞留时间 ,从而提高放射生物学效应。

Fas基因转导大肠癌细胞株的表达

目的建立表达外源性Fas基因的大肠癌细胞株,观察Fas基因在转导前后的表达。方法采用分子克隆技术将Fas基因插入真核表达载体pBK-CMV的多克隆位点之间,以脂质体介导法将Fas基因导入受体细胞LoVo,用G418筛选克隆细胞。以dot blotting,Western blotting检测转导细胞Fas基因的表达。结果成功建立了Fas基因表达株。转导株在RNA及其蛋白水平表达均明显高于非转导株,转导细胞增殖速度、倍增时间、对数生长期等均比非转导株更为缓慢,但无显著性差异,在Fas抗体作用下,转导株细胞生长明显受到抑制,有非常显著性差异。结论Fas基因在大肠癌细胞中处于低表达状态;通过真核表达载体介导,Fas基因在RNA及其蛋白水平能有效表达。Fas表达株在Fas抗体作用下可明显抑制体外培养的大肠癌细胞的生长增殖。

腺病毒携带GFP在豚鼠耳蜗基因转导的形态结构与功能改变

目的 带有绿色荧光蛋白 (GFP)基因的腺病毒注入豚鼠耳蜗后 ,观察不同时间段GFP基因的表达和分布情况及手术操作对听力的影响 ,为内耳基因治疗提供理论依据。方法 1 5只杂色豚鼠术前及术后行听性脑干反应 (ABR)和畸变耳声发射 (DPOAE)检查 ,空白对照组经圆窗或底回钻孔注入人工外淋巴液。实验组注入带有GFP基因的腺病毒。分别于 3、5、7和 1 0d后取材 ,耳蜗标本经硝酸银染色后铺片。结果 腺病毒注入耳蜗后对听阈影响不大。术前术后的DP值有差异。荧光显微镜下可见 3d组表达产物最高。 7d后逐渐减弱 ,1 0d后更弱 ,表达产物主要分布于支持细胞、螺旋神经节细胞和基底膜下的间皮细胞。对照组均无绿色荧光。结论 通过圆窗或底回注入腺病毒对听阈没有影响。单一位点的接种就能使神经营养因子通过耳蜗液扩散到整个耳蜗。有效的基因转移在耳蜗是可行的 ,但表达相对短暂。

骨髓基质细胞对人造血CD_34^+细胞体外扩增及基因转导的作用

目的：探讨造血基质细胞对人外周血干细胞体外培养扩增及基因转导的促进作用。方法：应用基质细胞支持培养扩增体系进行人造血干细胞体外培养扩增及基因转导。结果：骨髓基质细胞和造血生长因子共同支持组的造血ＣＤ＋３４细胞在体外培养３周后，其造血祖克隆形成能力较单纯造血生长因子支持组高３０．７％（Ｐ＜０．０５）。在有基质细胞支持时，逆转录病毒载体上清转导人造血ＣＤ＋３４细胞后，其造血细胞克隆中Ｎｅｏ基因阳性克隆是无基质支持对照组的２倍。结论：基质细胞的支持有维持造血干细胞原始造血活性及促进基因转导的双重好处。

HSV_1-TK基因转导人肺腺癌细胞A549体内外表达的研究

目的：观察ＴＫ基因转导Ａ５４９细胞后在体外和体内的表达。方法：将已构建的逆转录病毒表达载体ＰＬＸＳＮ－ＴＫ用电穿孔法转化Ａ５４９细胞，原位杂交检测ＴＫｍＲＮＡ在Ａ５４９－ＴＫ细胞和由它接种裸鼠形成肿瘤组织中的表达。斑点杂交检测外源基因在细胞中整合。并体外观察Ａ５４９－ＴＫ细胞对ＧＣＶ的敏感性。结果：原位杂交表明Ａ５４９－ＴＫ细胞及由其所形成的肿瘤组织中ＴＫｍＲＮＡ表达阳性，对照细胞无表达，斑点杂交证明Ａ５４９－ＴＫ细胞中有ＴＫ基因整合。Ａ５４９－ＴＫ细胞对ＧＣＶ的敏感性是亲代细胞的４６倍。结论：ＴＫ基因在Ａ５４９－ＴＫ细胞中表达阳性，转基因细胞对ＧＣＶ敏感。

WT1多肽特异性T细胞受体基因转导正常T细胞的抗肺癌效应

目的通过基因转导技术获得WT1多肽特异性TCR基因转导的正常外周CD8+T细胞,检测其对肺癌细胞的杀伤活性,探讨TCR基因转导用于过继性细胞治疗肺癌的可行性及安全性。方法通过克隆HLA-A*2402限制性WT1特异性细胞毒性T细胞(CTL)之TCR基因,经构建逆转录病毒载体后转导WT1-TCR基因至正常外周CD8+T细胞;所获得的CD8+T细胞对靶细胞的杀伤效应经标准51Cr释放试验测定。结果 WT1-TCR基因转导后的正常外周CD8+T细胞显示出对WT1多肽负载的HLAA*2402+LCL细胞的特异性杀伤作用,同时TCR基因改造后的CD8+T细胞可特异性杀伤HLA-A*2402及WT1表达阳性的肺癌细胞株而不对HLA-A*2402表达阳性的正常细胞产生杀伤作用。结论这些数据论证了WT1-TCR基因转导正常外周T细胞具有与亲代CTL一致的特异性杀伤特性,提示该方法用于过继性细胞免疫疗法治疗肺癌具有可行性。

肿瘤坏死因子α基因转导的人肝癌细胞疫苗对小鼠肝癌移植瘤的影响

目的 用肿瘤坏死因子α (TNF α)基因转导的人肝癌细胞作为疫苗接种小鼠 ,研究其对小鼠肝癌移植瘤的免疫排斥作用。方法 取昆明种小鼠 40只 ,分为 5组 ,每组 8只。分别采用经60 Co照射的TNF α基因转导的人肝癌细胞 (BEL 740 4 TNF Co组 )、未经60 Co照射的TNF α基因转导的人肝癌细胞 (BEL 740 4 TNF组 )、经60 Co照射的人肝癌细胞 (BEL 740 4 Co组 )以及未经60 Co照射的人肝癌细胞 (BEL 740 4组 )接种小鼠 ,生理盐水对照组仅注射生理盐水。然后将小鼠肝癌细胞株H2 2移植于上述 5组小鼠 ,观察肝癌移植瘤生长情况 ,并应用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记 (TUNEL)法观察肿瘤细胞凋亡指数。结果 BEL 740 4 TNF Co组小鼠接种经60 Co照射的TNF α基因转导的人肝癌细胞疫苗后 ,肝癌移植瘤成瘤率下降 ,瘤体生长受抑制 ,细胞凋亡指数增高 ,与BEL 740 4 Co组、BEL 740 4组及生理盐水对照组相比 ,差异有显著性 (P <0 .0 1) ,但与BEL 740 4 TNF组相比 ,差异则无统计学意义 (P>0 .0 5 )。结论 TNF α基因转导的人肝癌细胞疫苗对小鼠肝癌移植瘤有较强的免疫排斥作用。

IL-6基因转导大肠癌细胞的表达

目的：将ＩＬ－６基因导入大肠癌细胞，建立有有效表达ＩＬ－６的转导株ＨＴ－２９ＩＬ－６。方法：采用酶切与连拉技术构建重组ＩＬ－６基因逆转录病毒载体，基因转录病毒载体，基因转染包装细胞，Ｇ４１８筛选克隆，常规制备重组病毒液并感染ＨＴ－２９细胞，筛选抗性细胞，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｍ ｂｌｏｔ分析基因的整合与ｍＲＮＡ转录水平，ＭＴＴ显色法及ＥＬＩＳＡ法检测表达产物的量与活性。

不同细胞因子基因转导对小鼠B16细胞体内生长及免疫原性的影响

目的：通过比较不同细胞因子基因转导对肿瘤细胞体内生长及对机体免疫活性的影响，探讨其可能的作用机制及因子间的协同效果。方法：采用逆转录病毒介导的方法将ＩＬ６／ＩＬ２融合基因及ＩＬ６、ＩＬ２单基因分别导入小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞中，检测基因修饰瘤细胞体内成瘤及对机体ＬＡＫ、ＣＴＬ活性的诱导。结果：三种基因修饰的肿瘤细胞均可表现出体内生长抑制及免疫原性增强，但融合基因转导细胞的改变，较单一基因修饰细胞更为明显。

半乳糖基化壳聚糖肝靶向性基因转导的体内实验

目的:研究半乳糖基化壳聚糖(Galactosylated chitosan, GC)在狗体内的肝靶向性作用. 方法:GC与质粒pEGFP-N1混和制备成纳米微囊复合物,体外转染SMMC-7721细胞.杂种狗术前1 d静脉注射氯化钆(14 mg/kg)以清除Kupffer细胞.将含1 mg质粒的纳米微囊经肝动脉和门静脉注射入动物体内.48 h 后取主要脏器组织做冰冻切片,在荧光显微镜下观察绿荧光蛋白表达情况.以裸质粒作为对照. 结果:7721细胞中有绿荧光蛋白的表达,体内实验GC组肝组织中有绿荧光蛋白表达,其他脏器组织中仅有微量表达. 结论:半乳糖基化壳聚糖在体外有较高的转染率,在大动物体内有肝靶向性作用,肝动脉、门静脉联合给药是基因治疗的一种有效途径.

TNF-α基因转导淋巴细胞对人胃癌细胞杀伤作用的实验研究

目的:观察将肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因导入淋巴细胞能否增强其对胃癌细胞的杀伤作用。方法:从胃癌转移淋巴结中分离淋巴细胞及胃癌细胞并在体外培养扩增,再用脂质体法将TNF-α基因导入淋巴细胞,在蛋白印迹法证实导入基因成功表达后,再用MTT法检测此转基因淋巴细胞对胃癌细胞的杀伤作用。结果:15例行TNF-α转导的淋巴细胞中,12例经蛋白质印迹法证实转导成功;其中4例转导入TNF-α基因后能显著增强淋巴细胞对胃癌细胞的杀伤作用,而另外8例则未见显著增强淋巴细胞的杀伤作用。结论:采用脂质体法能成功将TNF-α基因转导入淋巴细胞,而且转导入TNF-α基因有可能增强淋巴细胞对胃癌细胞的杀死作用。

经大鼠圆窗膜bFGF基因转导防治爆震性聋的实验研究

目的以阳离子脂质体介导bFGF(basic fibroblast growth factor,碱性成纤维细胞生长因子)基因,经完整圆窗膜途径转染爆震后的大鼠耳蜗,观察bFGF的表达及其对爆震性聋的防治作用。方法 SD大鼠30只,随机分为四组:空白对照组(n=6),仅接受155dB SPL脉冲噪声暴露20次;EGFP(enhanced green fluorescent protein,增强型绿色荧光蛋白)对照组(n=8),噪声暴露后即刻导入EGFP/阳离子脂质体复合物;bFGF治疗组(n=8),噪声暴露后即刻导入EGFP-bFGF/阳离子脂质体复合物;bFGF保护组(n=8),噪声暴露前3天导入EGFP-bFGF/阳离子脂质体复合物。各组动物分别于噪声暴露前及噪声暴露后1天、3天、7天、14天行ABR阈值测试。噪声暴露后14天耳蜗取材做基底膜铺片,荧光显微镜观察,并做bFGF免疫荧光染色验证bFGF的表达。结果爆震后1天,bFGF保护组ABR阈值低于空白对照组及EGFP对照组,且差异均有显著性意义(P<0.05)。爆震后3天、7天和14天,bFGF治疗组及bFGF保护组ABR阈值均低于两个对照组,且差异有显著性意义(P<0.05)。而爆震前及爆震后bFGF治疗组和bFGF保护组间的ABR阈值差异均无显著性意义(P>0.05)。术后14天,荧光显微镜直接观察及bFGF免疫荧光染色均检测到毛细胞内有bFGF的定位表达。结论将阳离子脂质体介导的bFGF基因经圆窗膜导入大鼠耳蜗能够表达,表达产生的bFGF对爆震所致的耳蜗损害有一定的保护作用,它能够减轻爆震后听。

hNIS基因转导黑色素瘤细胞介导放射性碘摄取的实验研究

目的 获取人钠 /碘同向转运体 (hNIS)基因cDNA ,研究其转导黑色素瘤细胞在体外和体内能否介导放射性碘摄取 ,从而探索该策略用于黑色素瘤放射性碘治疗的可能性。方法 运用逆转录聚合酶链反应从人甲状腺组织总RNA中扩增出hNIS基因cDNA ,将其克隆至真核载体pc DNA3 中 ,电转化法分别将重组质粒pc DNA3 hNIS及空质粒pc DNA3 转导黑色素瘤细胞 (B16 ) ,分别建立了细胞系B16 A和B16 B。在体外培养条件下检测其对放射性碘的摄取及外流情况 ,继而将三种细胞系接种C5 7小鼠行13 1I显像和肿瘤摄取12 5I动态定量测定。结果 成功克隆到hNIS基因 ,并建立了能稳定表达hNIS的新型细胞系B16 A。B16 A细胞的摄碘能力较B16细胞高 17倍 ,较B16 B细胞高 19倍。碘的外流过程迅速 ,T1/ 2eff仅 10min。体内实验发现B16 A细胞所形成肿瘤能摄取放射性碘 ,腹腔注射12 5I后 1、2、4、12、2 4h肿瘤组织的 %ID/ g平均为 12 .2 2、10 .91、8.73、1.2 4、0 .19,12 5I在肿瘤组织内的生物半衰期约为 6h。B16 A细胞系所成肿瘤摄碘量与对照组相比较 ,P <0 .0 1,差别具有高度统计意义。结论 hNIS基因转导黑色素瘤细胞足以介导放射性碘摄取 ,但有效半衰期较短 ,难以产生足够的治疗剂量 ,有必要进一步研究如何增加放射性碘的摄取?

基因转导及组织工程重建涎腺功能

涎腺功能低下或丧失在临床上很常见,目前尚无较理想有效的治疗方法。近年来随着涎腺基因转导及组织工程等新技术方法的应用,涎腺功能重建取得了可喜的进展。通过传导腺病毒介导的水通道基因治疗涎腺放射损伤,已在美国获批进入临床实验,长期稳定的载体介导的水通道基因在大型动物的临床前研究正在进行中。