利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组SA11轮状病毒

目的利用反向遗传技术产生NSP1基因插入和表达外源基因的重组SA11轮状病毒,构建可表达外源基因的轮状病毒载体。方法本研究将轮状病毒SA11株的NSP1基因片段的223位(5端)至1388位的核苷酸删除,并直接插入连接了终止-再启动元件(P2A)的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因,采用已建立的“12质粒”轮状病毒反向遗传系统拯救NSP1基因插入和表达EGFP的重组SA11轮状病毒。通过观察细胞病变效应和插入基因(EGFP)的荧光表达初步确定重组病毒的成功拯救,再结合电镜的形态学观察、RT-PCR的测序结果及病毒基因组的检测结果,进一步证明重组轮状病毒的成功拯救和传代扩增。利用TCID 50法和qRT-PCR法,测定了rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的病毒滴度并绘制了基因组复制动力曲线。结果基于“12质粒系统”成功拯救了重组轮状病毒rSA11/NSP1-EGFP,证明NSP1片段截短并插入外源基因后病毒仍可正常复制,且具有良好的遗传稳定性,但病毒滴度低于其亲本株。结论基于NSP1基因插入和表达EGFP的重组轮状病毒能够实现稳定遗传,为利用反向遗传学构建表达外源基因的轮状病毒载体的深入探索提供了基础。

几种重组腺相关病毒亚型载体对小鼠睾丸细胞感染和外源基因表达的特性研究

目的评估几种重组腺相关病毒载体rAAV1、rAAV2、rAAV2/8和rAAV6对小鼠睾丸细胞的感染特性。方法使用HEK293T细胞进行rAAV包装制备病毒颗粒,经生精小管内注射或睾丸间质注射给小鼠睾丸接种病毒,术后第7天用颈椎脱臼法处死小鼠,取睾丸制作冰冻切片,通过免疫荧光染色检测和评估重组腺相关病毒载体对睾丸细胞的感染情况和外源蛋白表达情况。结果rAAV1、rAAV2、rAAV6三种亚型均可感染支持细胞和生殖细胞,rAAV2对支持细胞感染能力更强,rAAV2/8在经生精小管接种病毒时特异地感染支持细胞,在经间质接种时特异性感染间质细胞。结论rAAV1、rAAV6在睾丸细胞感染中并未表现出明显的偏好性;rAAV2在可以感染生殖细胞和支持细胞的同时表现出对支持细胞的偏好性;rAAV2/8无法穿越血睾屏障,在经生精小管接种时特异性感染支持细胞,在经间质接种时特异性感染间质细胞。

枯草芽孢杆菌同源重组表达外源基因在畜牧业应用的研究进展

枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性益生菌,因其分布广泛、操作安全、易于培养、易遗传转化而被广泛用于畜牧业、农业、食品、工业和医药领域的异源蛋白生产。已报道了许多基于质粒的枯草芽孢杆菌表达系统,本文进一步介绍了枯草芽孢杆菌分泌系统、启动子、质粒载体、转化方法,以及利用同源重组表达外源基因在畜牧业应用的研究进展,为畜牧科技工作者提供参考。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株作为外源基因表达活病毒载体的研究

利用反向遗传操作技术,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)也可以被用作外源基因表达的活载体。前期研究将猪瘟病毒E2蛋白的编码基因插入了高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的非结构蛋白和结构蛋白编码间区,所拯救的重组病毒rPRRSV-E2能够在体外和体内高效表达E2蛋白。能够为猪瘟和HP-PRRS的感染提供100%的免疫保护。本研究利用rPRRSV-E2的全长感染性克隆平台,在PRRSV基因组ORF7和3'非翻译区之间插入了转录调控序列6(TRS6)和绿色荧光蛋白的编码基因,构建并拯救了重组病毒rPRRSV-E2-EGFP,该病毒感染MARC-145细胞后,可以同时表达猪瘟E2蛋白和EGFP。外源序列在载体中能够保持遗传稳定。本研究为开发PRRSV作为病毒活载体疫苗提供了一个新的外源基因插入位点和构建策略,对今后多价疫苗的研发有重要意义。

TaqMan荧光定量PCR法检测CHO细胞中外源基因拷贝数的方法建立

目的以β2-微球蛋白(B2M)为内参基因,建立一种检测CHO细胞中外源基因H拷贝数的TaqMan荧光定量PCR方法。方法使用含有目的基因H和内参基因B2M的质粒作为标准品,分别建立目的基因H和内参基因B2M的标准曲线。提取重组CHO细胞基因组DNA,并对所提基因组中目的基因H和内参基因B2M的拷贝数同时进行qPCR检测。结果成功建立了目的基因H和内参基因B2M的标准曲线,扩增效率分别为92.09%和94.96%。标准曲线的相关系数均在0.99以上,且具有良好的重复性。随着细胞传代的增加,目的基因的拷贝数相对稳定。结论成功建立了TaqMan荧光定量PCR法检测CHO细胞中外源基因拷贝数的方法,该方法可用于外源基因在CHO细胞中的遗传稳定性研究。

外源基因在转基因植物中的遗传稳定性及其转育研究进展

利用基因工程方法获得的转基因植物是一种人工创造的新种质。外源基因在无性培养阶段和有性阶段的稳定性,直接影响着转基因植物的利用。外源基因拷贝数、整合位点、位置效应、外源基因丢失、甲基化、共抑制等均影响其在转基因植物中的稳定性;同时也影响外源基因在转育材料中的表现;最后简单讨论了外源基因鉴定方法的优缺点。

外源基因在转基因动物中遗传和表达的稳定性

转基因技术经过近半个世纪的发展,已成为当今生物技术研究的热点。近10多年来,与核移植技术的结合,转基因效率大大提高,携带有不同外源基因的不同种类的转基因动物迅速增加。但是,成功获得转基因动物并不是转基因动物研究的最终目的,如何利用转基因技术为人类的需求服务才是科研人员始终面对的课题。在畜牧生产领域,通过转基因技术培育家畜新品种是转基因技术应用的重要体现,在我国这方面已经引起了广泛关注。但迄今为止,外源基因在转基因动物中遗传和表达的稳定性仍然是亟待解决的问题,究其原因,这主要与位置效应、外源基因的表观遗传学修饰和遗传效率相关,文章结合目前的研究进展和本实验室的研究结果,从这3方面阐述其作用机制,期望为转基因动物遗传育种向产业化的迈进提供一定的理论探讨。

基因枪转化获得的转基因水稻中外源基因整合与表达规律研究

通过基因枪法将cecropinB和bar基因共转化水稻 ,获得多个水稻优良品系的转化材料。对转基因的结构和表达的系统分析 ,发现外源基因的整合模式多种多样 ,有简单也有复杂。其中插入位点数的变化范围为 1～ 7个 ,拷贝数的变化范围为 1～ 1 0个。转基因拷贝数的多少与其表达和沉默不存在必然的联系。相同整合模式的转基因事件中基因的表达存在较大的差异。选择标记基因bar比非选择标记基因cecropinB的表达框的完整性和转录概率要高。但是发现大部分表达框完整的bar基因发生基因沉默 ,而在终止子发生序列丢失的cecropinB基因的表达则明显提高。

利用激光微束穿刺法将外源基因导入小麦的研究

用激光微束穿刺法将携带有新霉素磷酸转移酶（ＮＰＴ－Ⅱ）基因的质粒ｐＪＩＴ１０１导入京花１号小麦幼胚细胞。方法是将小麦幼胚细胞进行高渗缓冲液预处理，用微米级的激光微束处理，然后在卡那霉素培养基上筛选出具抗性的愈伤组织及绿色小植株。第一年，从１５０个小麦幼胚中，在卡那霉素培养基上筛选出４株绿苗，取两株进行ＮＰＴ－Ⅱ酶活性分析，测到了ＮＰＴ－Ⅱ酶的活性。第二年重复实验，从２４５个小麦幼胚中，经筛选获得１株绿苗，进行了叶片ＤＮＡＰＣＲ扩增检测，转化的绿色小苗扩增出所导入的ＮＰＴ－Ⅱ基因编码的片段。结果表明，外源ＮＰＴ－Ⅱ基因已导入了小麦，并实现了整合表达。

小麦中外源基因瞬间表达调控研究及兔防御素(NP-1)基因的转化

将不同５’上游调控序列驱动下的ＧＵＳ基因用基因枪法导入小麦幼胚和胚性愈伤组织，通过组织化学分析法和荧光分析法对ＧＵＳ基因的表达进行定量检测，比较了几种启动子和烟草花叶病毒（ＴＭＶ）增强子序列对小麦中外源基因瞬间表达的调控作用；然后将其中效率最高的玉米Ｕｂｉｌ启动子与兔防御素（ＮＰ－１）基因连接起来，并加上Ｎｏｓ终止子，构建成ＮＰ－１基因小麦表达载体，并转化小麦幼胚。经ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析，初步确定ＮＰ－１基因已整合到小麦基因组中。转基因植株的抑菌试验正在进行中。

转双抗虫基因三倍体毛白杨外源基因表达及性状相关性分析

用部分改造的BtCry I Ac基因与慈菇蛋白酶抑制剂（API）基因构建的双抗虫基因表达载体，通过农杆菌介导法转化了三倍体毛白杨Populus tomentosa Carr.，获得一批转双抗虫基因株系。对转基因株系的抗虫毒蛋白表达进行了ELISA和Westem Blot检测，同时用转基因株系叶片对杨扇舟蛾Clostera anochoreta Fabricius和舞毒蛾Lymantria dispar L．幼虫进行室内饲虫试验，并对各项外源基因表达指标进行了相关分析。结果表明：在检测的28个转基因株系中，对杨扇舟蛾高抗株系占总参试系号的41％，中抗系号占35．0％，低抗系号占24％，对舞毒蛾高抗株系占参试系号的70％。转基因植株可明显抑制存活幼虫的生长发育，且不同转基因株系饲养的幼虫发育存在显著差异。连续两年相关分析表明，不同转基因株系幼虫死亡率间存在极显著相关。转基因植株对舞毒蛾和杨扇舟蛾均表达出抗虫性，并存在极显著相关。ELISA检测结果表明，不同转基因株系Bt毒蛋白表达量存在差异，变化在0．0011％～0．0161％。转基因植株对害虫的杀虫效果与Bt杀虫蛋白的表达量存在显著相关，表明Bt毒蛋白在抗虫效果中占有重要地位。转基因植株对卡那霉素表现出一定的抗性，但与抗虫程度相关不明显，单纯用卡那霉素作为筛选手段并不能完全反映植株的真实抗虫效果。

脂质体介导外源基因体外转染牛胎儿成纤维细胞条件的优化

通过脂质体(FuGENE-6)介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的表达随DNA、脂质体量的增加而增加,延长细胞暴露时间反而使转染效率下降,转染细胞数适当才能得到较高的转化率。

鱼类精子携带的外源基因导入

将鲤鱼（或泥鳅）精子在保存液内与人生长激素（ｈＧＨ）重组质粒ＤＮＡ保温，再与鲤（或泥鳅）卵受精。由此发育的鱼苗经ＤＮＡ分子杂交和ＰＣＲ检测证明，３３．３％（或３７．０％）的个体带ｈＧＨ基因，其拷贝数在４—１５０／细胞之间。在一定条件下，精子可作为携带外源基因的载体，通过受精作用产生转基因鱼。

转抗虫基因优良籼型恢复系的获得及其外源基因的遗传稳定性研究

用基因枪法将雪花莲外源凝集素基因 (gna )转移到优良籼型杂交稻恢复系蜀恢 5 2 7中 ,通过 PCR、PCR- South-ern blotting和 Southern blotting等分子方法检测证明 ,外源基因已稳定遗传到转基因第三代 (T2 )。转基因第一代植株 (T0 )在株高和结实率上与相应的组培、种子实生苗植株相比 ,发生明显的不可遗传的变异。随着繁殖代数的增加 ,转基因植株恢复到与对照植株一致。还讨论了 DNA微量提取法在转基因后代筛选中的运用。

外源基因导入鲤(Cyprinus carpio)受精卵最佳时期的研究

本研究以鲤鱼受精卵为材料，通过显微注射技术，在受精卵的不同发育时期把鲤鱼ＭＴ启动子基因和大麻哈鱼ＧＨ基因导入受精卵中，按孵出的鱼苗数分别计算成活率，再通过斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ杂交检测整合情况，计算整合率，孵化率最高的为单细胞中期（９０．８３％），整合率最高的为单细胞后期和囊胚期（４０％）。综合研究结果外源基因导入鲤鱼受精卵的最佳时期应选在单细胞后期。

水稻转基因植株后代中外源基因异常分离的研究

以用农杆菌介导法育成的日本晴等 3个品种 (系 )的转基因水稻为材料 ,对外源基因的分离情况进行了研究。这几份转基因水稻都携带串联排列的抗虫基因cry1Ab和报告基因gusA等基因。在自交后代中 ,cry1Ab和gusA协同分离 ,但阳性植株与阴性植株之比都显著小于 3∶1,阴性植株显著偏多。以杂合转基因植株 (gusA/ - )作母本植株 ,与常规品种 (- / - )杂交所得测交F1,阳性植株 (+/ - )和阴性植株 (- / - )的比例基本符合 1∶1。在反交时 ,阴性植株与阳性植株之比显著大于 1∶1的比例。比较日本晴转基因后代中gusA阳性株与阴性株的结实率发现 ,前者的结实率显著低于后者。综合上述结果可以看出 ,携带crylAb等转基因的花粉存在竞争劣势 ,可能是导致外源基因异常分离的主要原因。

转基因大豆、玉米和水稻外源基因检测通用标准分子的构建

将转基因大豆、玉米和水稻的主要外源Cry1A(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因和内参RBCL基因目标片段分别克隆到克隆载体pMD18-T中,构建获得的质粒可作为定性检测3种转基因粮食作物的上述外源基因的通用标准分子质粒pMD18-T-PAT-CP4-EPSPS-Cry1 A(B)-BAR-RBCL,长约4.7 kb。经过双酶切、测序及PCR扩增,获得与预期片断大小及序列一致的目的基因片段,证明所构建的标准分子质粒是正确的,可以用来作为不同品种转基因粮食作物定性检测CP4-EPSPS基因、Cry1 A(B)基因、BAR基因和PAT基因的通用阳性标准分子。

转基因烟草中外源基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法,为转基因植物中外源基因拷贝数的检测提供参考。【方法】采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,检测转基因烟草中外源绿色荧光蛋白基因(GFP)的拷贝数,以烟草单拷贝的内源核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因,建立相对定量的双标准曲线法检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法。【结果】构建RNR2基因、GFP基因实时荧光定量PCR的标准曲线,分别为y=-0.2858x+5.6695和y=-0.2826x+2.1048,R2分别为0.9994和0.9989,相关性较高。在检测的5株转基因烟草中GFP基因的拷贝数分别为5、8、19、28和45,非转基因烟草植株的GFP基因拷贝数为0。【结论】建立的转基因烟草中外源基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法具有简单、快速、准确等优点,可用于基因工程中对优良转化植株的筛选及外源基因表达量的快速检测和定量分析。

外源基因导入改良小麦抗旱性的研究进展

华北是我国水资源匮乏地区之一,干旱直接威胁着本区域粮食安全。小麦(Triticum aestivum L.)作为世界主要粮食作物,在我国北方占有重要地位,选育抗旱小麦品种是降低干旱危害的有效手段。由于小麦属内的遗传变异相当有限,小麦抗旱性遗传改良急需开发和导入新的基因资源。远缘杂交是转育小麦近缘属种优良基因、创造特异育种新材料的有效途径;全基因组DNA导入技术打破了物种界限,可以将小麦族外的基因导入小麦基因组中;转基因技术不仅可以导入其他物种的基因,更使得分子聚合不同来源的抗旱相关基因成为可能,为小麦抗旱性综合改良开辟了新途径。本文以上述3种技术为切入点,对外源基因(或染色质)导入、改良小麦抗旱性的相关研究进展进行了回顾和展望。

转双抗虫基因欧美杨107杨中外源基因的表达

【目的】鉴定并分析转双抗虫基因(BtCryl Ac和API基因)欧美杨107杨(简称:转基因107杨)中外源基因的表达情况,并且筛选出对鳞翅目害虫美国白蛾和杨扇舟蛾具有高抗虫性的转基因107杨株系【方法】以10个转基因107杨株系2年生田间苗为试验材料,未转基因107杨为对照(CK),进行外源基因表达测定,包括PC R检测、绝对荧光定量PC R检测和毒蛋白检测以及鳞翅目害虫抗虫性对比试验【结果】PCR检测结果表明,10个转基因株系均检测到外源基因BtCryl Ac和API而对照未检测到,证明BtCryl Ac和API基因已稳定插入转基因植株基因组中。荧光定量PCR检测表明,8月份PB1,PB2,PB6,PB9和PB10这5个株系BtCryl Ac基因的转录丰度较高为1.72×10~8~7.91×10~9,PB1最高;PB3,PB7和PB8次之为1.03×10~7~2.35×10~7;PB4和PB5与对照一样未检测到BtCrylAc基因的转录表达。ELISA毒蛋白检测表明,CrylAc毒蛋白的表达量与转录丰度大小变化趋势一致,PBl最高,为665.11 ng·g^(-1),PB4和PB5与对照一样未检测到毒蛋白。室内饲虫试验证明转基因107杨对美国白蛾幼虫的杀虫效果高于杨扇舟蛾幼虫。8个表达毒蛋白的转基因株系对1-6龄美国白蛾幼虫的致死率均为100%,但致死时间存在一定差异,PB1和PB2对各龄幼虫的致死时间均较短;PB1,PB2,PB6,PB9和PB10对1~4龄杨扇舟蛾幼虫的致死率均为100%,其中PB1和PB2的致死时间较短,PB3,PB7和PB8对1~2龄杨扇舟蛾幼虫的致死率为100%,对3龄和4龄的致死率最高为22.22%。综合抗虫对比试验结果,可以将8个转基因株系划分为2个抗性水平:PB1,PB2,PB6,YB9和PB10为高抗株系对美国白蛾和杨扇舟蛾均表现高抗性;PB3,PB7和PB8为中抗株系,对杨扇舟蛾表现出中等抗性,但对美国白蛾表现出高抗性。【结论】通过对转基因107杨进行一系列分子检测及室内抗虫对比试验,证明外源基因已成功导入杨树基因组并稳定存在,并且有8个株系高效表达;抗虫试验证明转基因107杨对美国白蛾和杨扇舟蛾具有明显的抗性,筛选出的5个株系对2种害虫都具有高抗性,另外3个株系PB3,PB7和PB8对美国白蛾具有很高的抗性,而对杨扇舟虫我则表现出中低抗性。