微图案化表面对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制

目的探讨两种形状微图案化表面对大鼠骨髓间充质干细胞(r BMSCs)成骨分化的影响及机制。方法利用q RT-PCR技术检测三角形和圆形微图案化表面上r BMSCs成骨基因Runx-2、Opn、Alp、Col-1、Ocn和成脂基因Pparγ、C/ebpα、AP2的表达情况,利用免疫荧光和q RT-PCR技术检测三角形微图案化表面上Piezo1、F-actin、Myosin和YAP的表达情况。结果三角形微图案化表面上r BMSCs的成骨基因Runx-2、Opn、Alp、Col-1、Ocn的表达均升高,且边长为15μm时表达最强,而成脂基因Pparγ、C/ebpα、AP2表达均降低。在圆形微图案化表面,r BMSCs的成骨和成脂基因表达均下调。此外,在15μm三角形微图案化表面上,r BMSCs的Piezo1、F-actin、Myosin和YAP表达均升高。通过使用Piezo1抑制剂Dooku1处理,观察到这些蛋白的表达均降低,且细胞的成骨能力受到抑制。结论三角形微图案化表面能够显著促进r BMSCs的成骨分化,尤其是在边长为15μm时效果最为显著。该表面通过Piezo1信号通路促进r BMSCs成骨分化,涉及的关键信号分子包括Piezo1、F-actin、Myosin和YAP。

“脾肾相赞”理论探讨不同治法对大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化中TNF-α、JNK含量影响

目的在“脾肾相赞”理论指导下,比较不同中医治法对大鼠BMSCs成肌分化及过程中TNF-α、JNK蛋白表达的影响,分析中医治疗骨质疏松症的机制。方法将大鼠分为正常组、诱导组、补肾组、健脾组、补肾健脾组(随机数字表法),制备含药血清,选取第4代BMSCs进行实验,运用免疫荧光法分析各组成肌分化情况,酶联免疫吸附法检测TNF-α、JNK蛋白表达量。结果①BMSCs经诱导15d后,通过免疫荧光化学染色法检测MyoG荧光平均强度,结果显示:各组均显著高于正常组(P<0.01),补肾健脾组最高。②TNF-α蛋白检测:补肾组、补肾健脾组显著低于正常组(P<0.01)。③JNK蛋白检测:各组显著低于正常组(P<0.01)。结论①各治法中,补肾健脾法对大鼠BMSCs成肌分化的促进效果最佳,为通过脾肾、肌骨双方向治疗OP提供可能。②各中医治法均对大鼠BMSCs的成肌分化存在促进作用,这可能与降低TNF-α、JNK水平有关。

芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用

背景:间充质干细胞移植治疗脊髓损伤有一定效果,但仍存在局部氧化应激环境导致移植细胞存活率低、细胞移植效率不佳等问题。目的:探究芒果苷在氧化应激状态下对骨髓间充质干细胞的保护作用。方法:取第3代大鼠骨髓间充质干细胞,按浓度梯度0,20,40,80,160μmol/L加入芒果苷孵育2 h,然后加入含400μmol/L H_(2)O_(2)的无血清L-DMEM培养基及相应浓度的芒果苷继续培养12 h及24 h,以常规培养的大鼠骨髓间充质干细胞为正常对照组。MTT法检测各组细胞存活情况,按照试剂盒操作方法检测细胞培养液中超氧化物歧化酶、丙二醛及过氧化氢酶水平。结果与结论:与正常对照组相比,H_(2)O_(2)组细胞的存活能力显著降低(P<0.01),超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平显著降低(P<0.01),丙二醛水平显著升高(P<0.01);与H_(2)O_(2)组相比,芒果苷组细胞的存活能力显著升高(P<0.01),超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平显著升高(P<0.01),丙二醛水平显著降低(P<0.01)。芒果苷在20μmol/L浓度以上表现出浓度依赖性的抗氧化应激保护活性,且在160μmol/L以下无细胞毒性。结果表明,抗氧化剂芒果苷可增加骨髓间充质干细胞的抗氧化活性,为骨髓间充质干细胞移植提供一种新的预处理策略。

小分子药物TD-198946促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:小分子药物TD-198946是一种能诱导干细胞形成软骨的高效软骨生成剂,但目前尚不清楚其对成骨分化的作用。目的:探讨小分子药物TD-198946促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的效果及其作用机制。方法:提取SD大鼠骨髓间充质干细胞,利用CCK-8法评估不同浓度TD-198946对骨髓间充质干细胞增殖的影响,确定TD-198946的最佳使用浓度;然后加入最适浓度TD-198946和成骨分化培养基对骨髓间充质干细胞进行成骨诱导;成骨诱导第3天用qRT-PCR检测碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原基因表达;成骨诱导第7天进行碱性磷酸酶染色,Western blot检测Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白表达;成骨诱导第21天进行茜素红染色。结果与结论:①CCK-8实验结果显示,100 nmol/L TD-198946能促进骨髓间充质干细胞增殖;②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示,TD-198946能促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化;③qRT-PCR结果显示,TD-198946可促进成骨相关基因碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原的表达;④Western blot结果显示,TD-198946可促进Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原以及p-PI3K、p-AKT蛋白表达。结果表明,小分子药物TD-198946可能通过激活PI3K/AKT信号通路,诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。

高糖环境中程序性细胞死亡受体1抑制大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:程序性细胞死亡受体1(programmed death receptor-1,PD-1)在高糖环境下影响骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制尚不清楚。目的:探讨高糖环境中PD-1对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其调控机制。方法:将大鼠骨髓间充质干细胞随机分为正常糖组(5.6 mmol/L)、高糖组(30 mmol/L)、PD-1过表达组、PD-1过表达空载组、PD-1敲低组、PD-1敲低空载组、PI3K/AKT通路抑制剂组(PD-1敲低+5μmol/L LY294002)。通过在高糖培养基中培养大鼠骨髓间充质干细胞来模拟体外糖尿病环境,采用qRT-PCR检测大鼠骨髓间充质干细胞中PD-1及其配体PD-L1和成骨标志物Runx2、OSX的mRNA表达,采用碱性磷酸酶染色和茜素红S染色观察成骨分化能力,采用CCK-8检测细胞增殖情况,采用Western blot检测PD-1、PD-L1、p-PI3K、p-AKT的蛋白表达。结果与结论:①高糖组PD-1及PD-L1表达显著高于正常糖组,高糖组骨髓间充质干细胞的成骨分化能力较正常糖组显著下降;②敲低PD-1表达可以促进骨髓间充质干细胞的成骨分化、增加细胞增殖活性,同时激活PI3K/AKT通路;③加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002后,骨髓间充质干细胞成骨分化能力显著下降。结果表明:PD-1依赖于PI3K/AKT信号通路抑制高糖环境下大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。

血管紧张素Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞棕色脂肪变的抑制作用

背景:骨髓间充质干细胞是脂肪细胞的来源之一,且表达所有肾素血管紧张素系统成分,但血清血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪组织分化的影响尚不清楚。目的:观察血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的影响,并探究血管紧张素1a型受体敲除对血管紧张素Ⅱ影响骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的作用及可能机制。方法:分离培养野生型SD大鼠及血管紧张素1a型受体敲除SD大鼠的骨髓间充质干细胞,将其培养至第3代,随机分为4组:野生组,基因敲除组,野生+血管紧张素Ⅱ组,基因敲除+血管紧张素Ⅱ组,在棕色脂肪诱导分化培养基中诱导分化14 d,后2组在每次更换分化培养基的同时加入100 nmol/L血管紧张素Ⅱ进行干预。采用Western blot、qRT-PCR、免疫荧光等方法检测棕色脂肪诱导分化、脂肪分解、β氧化和线粒体生物发生等相关标记物的表达。结果与结论:血管紧张素Ⅱ可抑制骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化,敲除血管紧张素1a型受体基因能够通过促进脂肪分解、增强脂肪酸β氧化、促进线粒体生物发生、增强线粒体功能来改善血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的抑制作用。这些发现为肥胖治疗提供了新的研究方向和潜在治疗靶点,揭示了肾素血管紧张素系统在脂肪代谢中的重要作用及其作为治疗目标的潜力。

BMP-2联合雷奈酸锶对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:研究骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)联合雷奈酸锶(strontium ranelate,Sr)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响,并探讨其相关机制。方法:取对数期大鼠BMSCs,随机分为对照组(不采用任何诱导液处理)、BMP-2组(0.1 mg/L BMP处理)、Sr组(5 mmol/L Sr处理)、BMP-2+Sr组(采用0.1 mg/L BMP处理6天后换液,再加入5 mmol/L Sr处理)。利用MTT实验检测BMSCs增殖情况,硝基苯磷酸盐法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,茜素红染色观察矿化情况,Western免疫印迹法检测TGF-β1、Smad2、p-Smad2及Runx2蛋白表达。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与对照组相比,BMP-2组、Sr组、BMP-2+Sr组ALP活性增强,MTT实验吸光度值、矿化面积百分比及TGF-β1、Runx2蛋白表达量,p-Smad2/Smad2水平显著升高(P<0.05)。与BMP-2组、Sr组相比,BMP-2+Sr组ALP活性增强,MTT实验吸光度值、矿化面积百分比及TGF-β1、Runx2蛋白表达量,p-Smad2/Smad2水平显著升高(P<0.05)。结论:BMP-2联合Sr可促进大鼠BMSCs增殖及成骨分化,其作用机制可能与激活TGF-β1/Smad信号通路有关。

丁苯酞对大鼠骨髓间充质干细胞炎性损伤的改善作用及机制

目的 研究丁苯酞对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)炎性损伤的改善作用及其可能机制。方法 将大鼠BMSCs分为对照组、模型组和丁苯酞低、中、高浓度组(10、20、50μmol/L)。体外培养BMSCs并采用脂多糖(终浓度为10 mg/L)建立炎性损伤模型,经丁苯酞干预后检测细胞存活率、凋亡率和细胞培养液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)含量以及细胞中核因子κB(NF-κB)p65 mRNA和胱天蛋白酶3(caspase-3)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和NF-κB p65蛋白表达。结果 与对照组比较,模型组细胞存活率和Bcl-2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);细胞凋亡率,TNF-α、IL-1β、IL-6含量,NF-κB p65 mRNA以及caspase-3、Bax、NF-κB p65蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,丁苯酞各浓度组上述指标均显著逆转(P<0.05),且呈浓度依赖性。结论 丁苯酞对脂多糖诱导的BMSCs炎性损伤具有改善作用,其机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。

骨髓骨片法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞和PKH26标记

目的 旨在建立一种高效的方法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的方法,并应用PKH26进行体外标记,探讨PKH26标记对BMSCs生物学特性的影响,以及体外示踪情况。方法 将大鼠5 d乳鼠双后肢骨进行分离,去除周围的肌肉和筋膜,并将其剪成小块进行培养,利用换液、传代提纯BMSCs,应用流式细胞仪测定第3代细胞表面抗原。在培养条件相同的情况下,取第3代BMSCs应用PKH26进行标记,标记组与未标记组在荧光显微镜下对细胞形态学、增殖状态进行观察,比较标记组与未标记组成骨成脂诱导特点及鉴定。结果 骨髓骨片法分离乳鼠双后肢骨,培养BMSCs呈细长梭形,形态均一,短时间内可迅速获得大量BMSCs;经流式细胞仪鉴定结果表明,表达CD29为(91.18±1.29)%,表达CD90为(95.04±0.11)%,表达CD45为(1.74±0.36)%;PHK26标记对BMSCs细胞形态,增殖无明显影响(P>0.05),对成骨成脂诱导无影响。结论 采用大鼠5 d乳鼠骨髓骨片法能够快速培养出大量高纯度的BMSCs,该细胞可作为种子细胞用于骨组织工程;PKH26可对体外大鼠BMSCs进行标记。

白藜芦醇对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激的保护作用研究

目的:探索白藜芦醇(Res)在体外对氧化应激状态下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的保护作用。方法:使用200μmol/L双氧水处理大鼠BMSCs,使其进入氧化应激状态,采用CCK-8、活性氧(ROS)荧光探针、实时荧光定量PCR、Western blot和碱性磷酸酶(ALP)染色等方法分别检测不同浓度的Res对大鼠BMSCs细胞活力、细胞内ROS水平、成骨分化和铁死亡的影响。结果:Res在1~25μmol/L浓度范围内对氧化应激状态下的大鼠BMSCs细胞活力有促进作用(P<0.05)。10μmol/L Res显著降低氧化应激状态下的大鼠BMSCs细胞内ROS水平,增加核红细胞相关因子2(NRF2)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶1(SOD-1)和超氧化物歧化酶2(SOD-2)等抗氧化相关基因的表达(P<0.05)。10μmol/L Res促进氧化应激状态下的大鼠BMSCs成骨相关标志物的表达(P<0.05),明显增强其ALP染色,促进铁死亡相关标志物谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)和胱氨酸转运蛋白(XCT)的表达(P<0.05),降低脂酰辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)和铁蛋白自噬核受体共激活因子4(NCOA4)的表达(P<0.05)。结论:Res能够降低氧化应激诱导的大鼠BMSCs细胞内活性氧和铁死亡水平,并促进氧化应激状态下大鼠BMSCs成骨分化,维持氧化应激状态下的大鼠BMSCs细胞活性。

低氧低糖及血清剥夺联合处理抑制Nrf2信号通路诱发大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激和凋亡

目的探讨低氧低糖血清剥夺(GSDH)处理对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)氧化应激及凋亡的影响。方法在体外对提取纯化后的原代BMSCs利用低氧(1%O_(2))、低糖(1.0 g/L)及血清剥夺联合处理建立BMSCs细胞损伤模型。采用集落形成实验、细胞周期测定以及CCK-8实验检测细胞增殖能力;划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移能力;通过细胞凋亡试剂(AnnexinV-FITC/PI)、线粒体膜电位检测试剂(JC-1)染色和线粒体荧光探针(Mito-Trancker)检测细胞凋亡;细胞活性氧簇(ROS)和钙离子(Fluo-4AM)检测细胞氧化应激水平;Western blotting检测抗氧化应激相关分子谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)等以及核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)信号通路中关键分子的蛋白表达水平。结果大鼠原代BMSCs表面标志物高表达CD29、CD71,低表达CD45、CD34;GSDH处理抑制BMSCs细胞增殖(P<0.05)和迁移(P<0.05),增加ROS和钙离子水平(P<0.05),且抑制抗氧化应激相关分子GPX4等蛋白表达(P<0.01);与空白对照组相比,GSDH处理后BMSCs凋亡显著升高(P<0.05),线粒体膜电位降低(P<0.01),网络化减少(P<0.01)。Nrf2信号通路中Nrf2蛋白及下游关键分子的蛋白表达水平均降低(P<0.05)。结论GSDH处理诱发的BMSCs氧化应激及进一步导致的凋亡损伤与Nrf2信号通路被抑制有关。

丙戊酸促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:丙戊酸作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,具有促进细胞成骨分化的能力,但相关机制尚不明确。目的:探讨丙戊酸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用及机制。方法:从SD大鼠中分离提取骨髓间充质干细胞,流式细胞仪进行鉴定;CCK-8检测不同浓度丙戊酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响,以确定丙戊酸的使用浓度;然后加入丙戊酸和成骨培养基对大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化,在成骨诱导培养第7天进行碱性磷酸酶染色以及第21天进行茜素红染色;成骨诱导培养第3,7天进行qRT-PCR检测成骨相关基因及EZH2的表达;成骨诱导培养第5天进行Western blot检测Runt相关转录因子2、EZH2和H3K27me3相关蛋白的表达。结果与结论:①CCK-8细胞增殖实验显示,随着丙戊酸浓度的增加,骨髓间充质干细胞增殖受到显著抑制;②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示,丙戊酸能提高细胞碱性磷酸酶的表达,增强骨矿化能力;③qRT-PCR结果显示,丙戊酸可提高成骨相关基因的表达,降低EZH2基因的表达;④Western blot结果显示,丙戊酸使Runt相关转录因子2蛋白表达增强,EZH2和H3K27me3蛋白表达下降;⑤结果表明,丙戊酸能够通过下调EZH2的表达促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。

发动蛋白(dynamin)抑制剂Dyngo-4a在大鼠骨髓间充质干细胞内吞葡聚糖过程中存在脱靶效应

目的研究发动蛋白(DNM)抑制剂Dyngo-4a在依赖DNM的内吞途径中可能存在的脱靶作用。方法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)并进行流式细胞术鉴定,将细胞分为抑制剂对照组、Dyngo-4a处理组、转染阴性对照(si-NC)组、DNM2小干扰RNA(si-DNM2)转染组、转染和Dyngo-4a共处理组。反转录PCR和Western blot法验证DNM2基因沉默效率,CCK-8法检测Dyngo-4a处理后细胞活性变化,共聚焦显微镜检测内吞的Dylight649标记的转铁蛋白(transferrin-Dylight649)和四甲基罗丹明标记的葡聚糖(dextran-TMR)阳性的囊泡数量以及平均荧光强度。结果使用小干扰RNA能显著下调BMSC的DNM2的mRNA和蛋白表达,转染组内吞的转铁蛋白囊泡数量与转染阴性对照组比较明显降低,si-DNM2转染组内吞的葡聚糖囊泡数量和平均荧光强度与si-NC组比较变化不明显,转染si-DNM2和Dyngo-4a共处理组与单独si-DNM2转染组比较,Dyngo-4a处理组与抑制剂对照组比较,葡聚糖囊泡数量和平均荧光强度均明显降低。结论Dyngo-4a作为靶向DNM的抑制剂在葡聚糖内吞进BMSC过程中存在脱靶效应。

酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力

背景:目前对酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2-interaction protein-1,CKIP-1)分子机制的体外研究主要集中在基因敲除小鼠来源成骨细胞或骨髓间充质干细胞,鲜见报道骨质疏松模型大鼠来源骨髓间充质干细胞中CKIP-1表达的研究。目的:探讨下调CKIP-1基因前后骨质疏松状态骨髓间充质干细胞成骨分化能力的变化。方法:用维甲酸诱导雌性SD大鼠骨质疏松模型,采用全骨髓贴壁法体外培养骨质疏松组、正常组大鼠骨髓间充质干细胞。成骨诱导后进行茜素红染色、碱性磷酸酶染色及实时定量RT-PCR检测骨桥蛋白、Runx2 mRNA的相对表达,实时定量RT-PCR检测成骨诱导过程中2组细胞中CKIP-1的动态表达;通过基因转染沉默CKIP-1基因,成骨诱导后进行茜素红染色、碱性磷酸酶染色及实时定量RT-PCR检测骨桥蛋白、Runx2 mRNA的相对表达。结果与结论:①与正常组相比,骨质疏松组骨髓间充质干细胞茜素红染色钙结节定量、碱性磷酸酶活性及骨桥蛋白、Runx2的mRNA水平降低(P<0.05),骨质疏松组骨髓间充质干细胞中CKIP-1基因动态表达水平总体偏高;②与未下调CKIP-1的骨质疏松组骨髓间充质干细胞相比,下调CKIP-1基因表达后,骨质疏松组骨髓间充质干细胞茜素红染色钙结节定量、碱性磷酸酶活性及骨桥蛋白、Runx2的mRNA水平明显升高(P<0.05);③结果表明,维甲酸诱导的骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成骨能力降低,下调CKIP-1基因可以部分提高其成骨分化能力。

20(S)-原人参二醇对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制

目的:探讨20(S)-原人参二醇(PPD)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用,并阐明其成骨诱导机制。方法:采用全骨髓法提取SD大鼠BMSCs,分为对照组和不同剂量(2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 mg·L^(-1)) PPD组,采用CCK-8法检测各组BMSCs增殖活性,采用Calcein/PI染色法观察各组BMSCs存活情况,筛选合适浓度PPD用于后续实验。将BMSCs分为对照组和PPD组,于成骨诱导第7天,采用BCIP/NBT比色法进行碱性磷酸酶(ALP)染色并定量检测各组BMSCs中ALP活性;成骨诱导第21天,采用茜素红染色检测各组BMSCs中矿化结节形成情况并定量分析细胞矿化活性;成骨诱导第7天,采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组BMSCs中ALP、1型胶原蛋白(COL^(-1))、骨钙素(OCN)和Runt相关转录因子2 (Runx-2) mRNA表达水平,免疫荧光染色法检测各组BMSCs中Runx-2和OCN蛋白表达荧光强度。结果:PPD处理第1和3天,与对照组比较,40.0 mg·L^(-1) PPD组BMSCs增殖活性明显降低(P<0.01);PPD处理第7天,与对照组比较,2.5、 5.0和10.0 mg·L^(-1) PPD组BMSCs增殖活性差异无统计学意义(P>0.05),20.0和40.0 mg·L^(-1) PPD组BMSCs增殖活性明显降低(P<0.01)。培养第1和3天,5.0、10.0和20.0mg·L^(-1) PPD组活细胞数较多,故选用10.0 mg·L^(-1) PPD用于后续实验。成骨诱导第7天,与对照组比较,PPD组BMSCs的ALP活性明显升高(P<0.01);成骨诱导第21天,与对照组比较,PPD组BMSCs中矿化结节数明显增多,矿化活性明显升高(P<0.01);成骨诱导第7天,与对照组比较,PPD组BMSCs中ALP、 COL^(-1)、 OCN和Runx-2 mRNA表达水平明显升高(P<0.05),Runx-2和OCN蛋白表达荧光强度均明显升高(P<0.01)。结论:PPD可通过增加BMSCs ALP活性和钙盐沉积,上调ALP、COL^(-1)、OCN和Runx-2等成骨基因的表达进而促进BMSCs的成骨分化,PPD是一种有效的成骨诱导活性因子。

改良全骨髓贴壁法分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞

目的建立简单、优化的分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,为组织工程支架研究提供细胞基础。方法分别采用常规和改良的全骨髓贴壁法分离和培养BMSCs。常规法按照传统全骨髓贴壁法,对骨髓冲洗液进行过筛和离心处理后加入完全培养基进行培养。在改良全骨髓贴壁法中,将骨髓冲出骨髓腔后直接加入完全培养基进行培养。倒置相差显微镜下观察两组细胞形态,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法比较两组BMSCs的增殖活性,流式细胞术检测表面标志物CD90、CD29、CD11b/c、CD45。对改良法培养的BMSCs进行定向诱导成骨及成脂分化,并通过茜素红染色检测其成骨分化潜能,通过油红O染色检测其成脂分化潜能。结果改良全骨髓贴壁法培养的BMSCs形态均一,细胞集簇排列呈“鱼群状”“漩涡状”。改良法比常规法培养的BMSCs增殖活性强(P<0.05)。改良法与常规法培养的BMSCs均高表达CD90和CD29,低表达CD11b/c和CD45。改良法培养的BMSCs成骨、成脂诱导分化后茜素红染色和油红O染色均为阳性。结论改良全骨髓贴壁法可成功分离并培养BMSCs,培养的BMSCs具有多向分化潜能,为组织工程支架的研究奠定了细胞基础。

氢氧化钙糊剂浸提液对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:研究氢氧化钙糊剂浸提液对大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)成骨向分化的影响,为其临床使用提供理论依据。方法:全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMMSCs,流式细胞仪进行细胞鉴定,不同条件诱导细胞后进行茜素红染色、油红O染色及阿利新蓝染色,鉴定细胞成骨、成脂及成软骨分化能力。将氢氧化钙糊剂烘干、研磨成粉后,制作氢氧化钙糊剂浸提液及氢氧化钙糊剂条件培养基(CH),使用不同浓度CH(0、0.02、0.2、1、1.5、2 g/L)培养大鼠BMMSCs,碱性磷酸酶(ALP)活性测定筛选最佳作用浓度用于后续实验。大鼠BMMSCs经CH诱导后,ALP染色、ALP活性测定、茜素红染色检测其ALP活性及矿化能力的变化,Western blot检测细胞成骨相关指标Ⅰ型胶原α1(COL1A1)、ALP、Runt相关转录因子2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子(OSX)的表达水平变化。结果:成功分离培养了大鼠BMMSCs,具有成骨、成脂及成软骨分化等间充质干细胞特性;0.2 g/L为CH诱导大鼠BMMSCs ALP活性的最佳作用浓度(P<0.01),使用该浓度CH培养基处理大鼠BMMSCs后,COL1A1、ALP、RUNX2、OSX表达上调(P<0.01)。结论:氢氧化钙糊剂浸提液可促进大鼠BMMSCs成骨分化。

miR-145-5p在正常大鼠与2型糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的表达比较

背景糖尿病会导致骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)的成骨分化能力降低,miRNA在此过程中发挥重要作用,其中miR-145-5p对细胞成骨成软骨分化有重要的调节作用。然而miR-145-5p对糖尿病源BMMSCs成骨分化的影响尚不清楚。目的比较正常大鼠与2型糖尿病大鼠BMMSCs成骨分化能力,初步探讨在成骨分化中miR-145-5p及其靶基因SEMA3A和Wnt通路关键蛋白β-catenin表达的差异。方法12只GK大鼠采用高糖高脂饲料喂养构建2型糖尿病大鼠模型,12只Wistar大鼠常规饲养作为对照组。无菌条件下分离大鼠股骨,全骨髓培养法培养正常大鼠和2型糖尿病大鼠BMMSCs(分别对应WT-BMMSCs和GK-BMMSCs);CCK-8检测细胞增殖能力;结晶紫染色检测细胞集落形成能力;碱性磷酸酶染色及半定量分析检测碱性磷酸酶活性;茜素红染色检测矿化基质形成;qRT-PCR和Western blot检测成骨相关标志物、miRNA-145-5p、SEMA3A和β-catenin的表达。结果干细胞培养4~9 d时,GKBMMSCs的增殖水平低于WT-BMMSCs,差异有统计学意义(P<0.01);10 d时,其集落形成率显著低于WT-BMMSCs(P<0.01);成骨诱导7 d时,GK-BMMSCs碱性磷酸酶活性(P<0.001)、成骨相关标志物碱性磷酸酶基因(P<0.01)和蛋白(P<0.001)表达、骨钙素基因(P<0.001)和蛋白(P<0.001)表达均显著低于WT-BMMSCs,1型胶原蛋白(P<0.01)基因的表达显著低于WT-BMMSCs,而Runt相关转录因子2(P<0.001)蛋白表达显著高于WT-BMMSCs。在WT-BMMSCs成骨分化中,miR-145-5p表达下调,SEMA3A表达上调,而在GK-BMMSCs成骨分化中,miR-145-5p和SEMA3A表达均上调,β-catenin(P<0.001)在GK-BMMSCs中的表达显著降低。成骨诱导21 d时,WT-BMMSCs矿化基质染色较深。结论2型糖尿病大鼠BMMSCs细胞增殖、集落形成及成骨分化能力降低,推测在正常大鼠BMMSCs成骨分化中miR-145-5p起抑制作用,在2型糖尿病大鼠BMMSCs成骨分化中miR-145-5p起促进作用。

干扰FoxO1慢病毒包装及稳转大鼠骨髓间充质干细胞株的建立

目的建立干扰叉头状转录因子O1(FoxO1)的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)稳转株,为研究BMSCs定向分化提供条件。方法提取大鼠原代BMSCs。构建FoxO1干扰载体,扩增后进行测序鉴定。FoxO1质粒瞬转293T细胞后,通过Western blot验证其干扰效果,并选择干扰效果最好的质粒载体。然后通过三因子慢病毒包装系统将FoxO1质粒和两个辅助质粒共转染293T细胞,包装慢病毒,组名为sh1,sh2,sh3,Vector。包装的干扰慢病毒和阴性对照病毒感染大鼠BMSCs,通过Western blot和RT-qPCR检测其表达效果。结果成功提取大鼠原代BMSCs;测序结果显示,重组FoxO1质粒构建成功;重组FoxO1质粒瞬时转染293T细胞48 h,细胞荧光明显,表明EGFP表达良好;Western blot结果显示,载体中标签蛋白表达成功,并筛选到干扰效果最佳的目的质粒sh1-FoxO1;干扰FoxO1慢病毒滴度为1×10^(8) TU·μL^(-1);包装完成的慢病毒感染BMSCs,经嘌呤霉素筛选后,Western blot结果显示,与Vector组相比,sh1组FoxO1的蛋白相对表达量降低(P<0.05);RT-qPCR结果显示,与Vector组相比,sh1组FoxO1的mRNA相对表达量降低(P<0.01),得到干扰FoxO1的大鼠BMSCs稳转株。结论成功构建了FoxO1干扰BMSCs稳转株,为进一步研究FoxO1在诱导BMSCs定向分化为IPCs过程中的作用及其潜在机制奠定了基础。

骨抑素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化和促进血管生成能力的影响

目的 探讨骨抑素(osteostatin,OST)对缺氧环境下骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖、成骨分化和促进血管生成能力的影响及其在骨缺损修复中的应用前景。方法 从大鼠骨髓中分离培养BMSCs。BMSCs经OST处理后,在常氧(21%氧气)或缺氧(1%氧气)条件下培养。采用cellcountingkit-8(CCK-8)法检测细胞增殖,台盼蓝染色法检测细胞死亡率。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和茜素红S(alizarin red S,ARS)染色评价成骨分化。western blot检测ALP、成骨转录因子(runt-related transcription factor 2,RUNX2)和骨钙素(osteocalcin,OCN)的蛋白水平。ELISA检测培养基中血管生成素1(angiopoietin-1,Ang-1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)浓度。小管形成试验评估促进血管生成能力。结果 OST剂量依赖性增强大鼠BMSCs的增殖(F=4.89,P=0.006)。缺氧诱导下,BMSCs的增殖、小管形成量增加(F=28.98、76.68,P均<0.001),Ang-1和VEGF的浓度提高(F=183.7、585.6,P均<0.001);ALP、RUNX2和OCN的蛋白水平降低(F=646.8、432.7、257.5,P均<0.001)。OST处理后,BMSCs增殖(常氧+OSTvs常氧,P均<0.001;缺氧+OSTvs缺氧,P=0.005)、小管形成量(常氧+OSTvs常氧,P=0.002;缺氧+OSTvs缺氧,P=0.005)进一步增加,Ang-1浓度(常氧+OST vs常氧,P<0.001;缺氧+OST vs缺氧,P<0.001)和VEGF的浓度(常氧+OST vs常氧,P<0.001;缺氧+OSTvs缺氧,P<0.001)进一步提高;ALP、RUNX2和OCN的蛋白水平升高(常氧+OSTvs常氧,P均<0.001;缺氧+OST vs缺氧,P均<0.001)。结论 OST可增强缺氧环境中BMSCs的增殖和成骨分化能力,促进血管生成。