基于分子对接和定点突变的红花糖基转移酶催化机理研究

目的:基于分子对接和定点突变制备蛋白突变体,用UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS分析酶产物变化,推测红花糖基转移酶CtUGT12的催化机理。方法:本研究发现了一种对木犀草素具有较高催化活性的红花类黄酮糖基转移酶CtUGT12。通过AlphaFold预测CtUGT12蛋白结构,用Autodock软件将CtUGT12分别与木犀草素以及尿苷二磷酸葡萄糖二钠盐进行分子对接,寻找到酶反应的关键活性位点进行定点突变。用蛋白突变体进行体外酶反应实验,通过高分辨质谱仪进行检测,推测CtUGT12催化机理。结果:本研究根据分子对接结果成功筛选了5个活性位点,设计并制备了8个CtUGT12蛋白突变体。利用突变蛋白进行体外酶反应实验并进行检测,质谱分析结果显示,CtUGT12可以催化木犀草素生成2个单-O-葡萄糖苷和2个二-O-葡萄糖苷。I127V、I127M、I443G、I443A、D444E活性差异不明显,F147S活性明显增强。E328R和E328M这2个突变体活性降低,但均生成了1个新的单-O-葡萄糖苷和1个新的双-O-葡萄糖苷,并且主产物发生了变化。结论:残基GLU328的突变能使CtUGT12的活性和产物组成发生明显改变,说明残基GLU328可能为CtUGT12参与木犀草素糖基化反应的关键活性位点。

定点突变对决明Kunitz抑制剂抑制活性的影响

【目的】决明Kunitz胰蛋白酶抑制剂1(Cassia obtusifolia Kunitz trypsin inhibitor 1,CoTI1)是一类具有β-三叶草结构的功能多肽,探究定点突变对其抑制活性的影响,对CoTI1的结构研究具有重要意义。【方法】基于CoTI1结构分析,分别将位于顶部盖子β2和β3折叠之间的Cys44,以及位于底部β-桶β9折叠内的Tyr134和Lys135这3个位点的氨基酸残基突变为丙氨酸(Ala),将各突变体进行蛋白表达之后再检测其对牛胰蛋白酶和菜青虫类胰蛋白酶的抑制作用。【结果】与野生型CoTI1相比,CoTI1^(C44D)对牛胰蛋白酶的抑制活性升高41.00%,CoTI1^(Y134D)和CoTI1^(K135D)对牛胰蛋白酶的抑制活性分别下降45.66%和36.73%;CoTI1^(C44D)、CoTI1^(Y134D)和CoTI1^(K135D)对菜青虫类胰蛋白酶的抑制活性分别下降46.94%、49.00%和38.11%。【结论】Cys44、Tyr134和Lys135参与了β-三叶草结构的形成,是稳定CoTI1的空间结构及抑制活性的重要残基,为CoTI1的结构研究奠定了重要的理论基础。

理性设计和定点突变对提高海藻糖合酶TreSI热稳定性的影响

[目的]来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase,EC 5.4.99.16)TreSI可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,在酶法生产海藻糖上有很高的应用前景,其热稳定性是制约该酶工业应用的关键。本文旨在通过定点突变对TreSI相关氨基酸残基进行改造,以期获得热稳定性强的突变子,提高其应用潜力。[方法]使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1对TreSI每个氨基酸突变后的去折叠自由能变化(ΔΔG)进行初步预测,以SDM(site directed mutator)和mCSM(mutation cutoff scanning matrix)以及两者联合(Duet)进行预测。用重叠延伸PCR法构建11个海藻糖合酶突变体,经大肠杆菌表达和蛋白纯化后,对其酶学特性进行表征。[结果]成功筛选到2个热稳定性提高的突变子。突变子R149L、N193E的比酶活与野生型无显著差异,且最适pH值和最适反应温度也未发生改变;R149L、N193E在50℃处理1 h的残余酶活性为野生型的1.37和2.50倍;在60℃处理1 h的残余酶活性为野生型的2.41和4.32倍。[结论]本研究利用PoPMuSiC结合SDM、mCSM模拟的设计策略提高了TreSI的耐热性,为工业应用提供了新的酶资源,也为其他工业酶的定向改造提供了参考。

定点突变及非定点突变技术的新进展

1992年是Zoller和Smith的寡核苷酸诱导的定点突变方法发表十周年[1]。这方法发表后的前几年中,以此方法为基础,改进了的定点突变方法,如雨后春笋相继产生,如Kunkel等人(1985),Calter等人(1985)及Tayler和Eck-stein等人(1985)的改进方法。这些改进方法使突变效率得到了很大的提高[2]。可以说定点突变技术在蛋白质工程研究中发挥了很大的作用。随后非定点突变技术也有了新的改进,如错误参入法,饱和突变技术等在用来寻找具有新的活性蛋白质序列中发挥了作用[3]。现综述一下近几年来定点突变及非定点突变技术的发展情况。

基因多位点定点突变法机理的探讨

用多个化学合成的寡聚脱氧核苷酸作为诱变引物,对枯草杆菌蛋白酶E(Subtilisin E或APr E)基因进行体外突变,借此系统地探讨了基因多位点定点突变中引物的类型和数量、引物的分布、引物间的相互位置、引物与模板DNA间摩尔数比等因素对突变效果的影响。

建立缝隙连接蛋白43基因定点突变细胞株的研究

目的定点突变是通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的 DNA片段中引入包括碱基的添加、删除、点突变等所需变化。体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具,也是实验室中改造/优化基因常用的手段。连接蛋白43(connexin43,Cx43)是心脏表达最丰富的连接蛋白,主要分布在心室,其构成的缝隙连接(gapjunction,GJ)在心肌细胞中的电偶联中起着非常重要的作用。近年来的研究表明干细胞移植治疗心肌梗死时,细胞间电偶联障碍是导致心律失常副作用的一个重要原因。己知Cx43的磷酸化状态可以调节通道的功能,磷酸化常见的是368位点的丝氨酸磷酸化。我们对缝隙连接蛋白43基因(Cx43)的特定碱基进行定点改变,从而改变对应的氨基酸序列,并对表达产物进行研究,以利于将来探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)中转染突变的Cx43对其向心肌分化能力的影响,及其磷酸化状态是否对心律失常有调控作用。方法设计引物,sense:5'-CTTCAAGCAGAGCCAGCAGTCGTGCCAGCA-3',antisense:5'TGCTGGCACGACGACTGCTGGCTCTGCTTGAAG-3'。以已构建的Pcdh-Cx43为模板,使用Stratagene基因定点突变试剂盒进行PCR扩增,用DpnI酶识别甲基化位点并将其酶切,PCR产物转化后筛选阳性克隆,提取质粒测序验证。在293FT中与其它3个穿梭质粒一起包装,再将慢病毒颗粒转染BMSCs,用嘌呤霉素筛选出阳性克隆BMSCs-mCx43,在压力培养基下传代培养。用流式细胞仪检测BMSCs-mCx43的干细胞相关表面标记表达情况,同时用western blot检测BMSCs-mCx43的蛋白表达情况。结果测序结果显示突变位点正确,荧光照片显示90%的293FT表达绿色荧光。50%的BMSCs有绿色荧光蛋白的表达。流式细胞仪检测示BMSCs-mCx43细胞CD29阳性表达94%±0.8%,CD73阳性表达92%±0.7%,几乎不表达CD34和CD105,与未转染病毒的BMSCs和转染空病毒载体的BMSCs的表面标记一致。Western blot结果显示BMSCs-mCx43中的mCx43表达强于未转染病毒的BMSCs和转染空病毒载体的BM-SCs。结论本实验研究表明使用定点突变法能成功将Cx43的368位点的丝氨酸突变成丙氨酸。用慢病毒载体转染BMSCs,能使BMSCs稳定持久表达mCx43蛋白,且转染慢病毒,不改变BMSCs的分子表面标记,是对BMSCs进行基因修饰的一种有效方法。

重组猪α干扰素基因定点突变及在大肠杆菌中的表达

用巨引物PCR法介导的定点突变把猪α干扰素 (PoIFN α)第 86位Cys(TGC)突变为Tyr(TAC) ,同时将其成熟蛋白N端第一个密码子TGT同义突变大肠杆菌偏爱的密码子TGC ,构建了大肠杆菌融合基因表达载体pGEX IFN ,表达产物占菌体总蛋白的 2 0 %。将以包涵体形式表达的目的蛋白经变、复性处理 ,并以FPLC进一步纯化 ,得到了具有较高生物活性的产物 (5 2 0 0IU mg)。

猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性

用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变 ,然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET 2 8a(+ )中 ,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL2 1(DE3 )plysS中 ,在IPTG的诱导下 ,重组转化菌可高效表达目的基因 ,表达量平均可达菌体蛋白总量的 2 8%。免疫印迹和间接ELISA表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。

定点突变提高枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的活力及稳定性

L-天冬酰胺酶可以催化L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸和氨。它可以通过降解食品原料中的L-天冬酰胺而降低高温烹制食品中丙烯酰胺的含量。由于食品预处理环境的复杂性,只有具有高酶活且稳定的酶才能满足食品生产中的应用。作者通过点突变提高来源于Bacillus subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶(Bs AII)的酶活和热稳定性。通过序列比对和同源模拟选择5个点进行突变,构建6个突变菌株。酶活测定结果表明,突变体酶S299N_(ansz)和P348A_(ansz)的酶活较Bs AII分别提高28%和32%。其中P348A_(ansz)的热稳定性和p H稳定性较Bs AII均有明显提高。本研究表明,第299和348位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响,对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础,并提高了该酶的工业应用潜力。

F43Y及I354M,L358F定点突变对植酸酶热稳定性及酶活性的改善

对重组酵母PPNPm8的植酸酶phyAm基因进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354、358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(I354M,L358F),得到了2个突变体PPNPm-1(F43Y)及PPNPm-2(I354M,L358F).含突变基因的重组表达载体pPIC9kphyAm-1,pPIC9kphyAm-2在毕赤酵母GS115中表达,对表达产物进行酶活性测定及热稳定性检测.结果表明:突变体PPNPm-1最适反应温度比未突变体PPNPm8上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高15%,比活力提高11%;PPNPm-2最适反应温度未改变,热稳定性比PPNPm8仅提高3%,比活力降低6.5%.对突变前后的植酸酶空间结构进行比较预测,发现突变氨基酸Tyr43与空间位置相邻的Asn416之间形成氢键,增强了酶的热稳定性.

北京棒杆菌天冬氨酸激酶G377定点突变及酶学性质表征

采用饱和定点突变和高通量筛选技术,对北京棒杆菌天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)AK Gly377位点进行突变,并筛选获得高活力突变体G377F,分离纯化后对G377F AK酶学性质进行表征。结果表明:突变体AK最适pH值为9.0,较突变前野生型(wide type,WT)最适pH值为8.5有所提高;最适反应温度与WT一致,均为25℃;半衰期由WT的2.6 h提高到5.3 h;pH耐受性在5 h内保持其活力50%以上,与WT 3 h内酶活力保持能力相同。G377F对金属离子和有机溶剂均表现出良好的抗性。其中,Lys的抑制作用在一定程度上被解除,当Lys和Met同时存在时对AK具有明显的激活作用。动力学研究显示:G377F AK Vmax较WT提高9.3倍;n值为1.0明显低于WT的2.7,说明AK正协同性降低,趋向于米氏酶。

定点突变提高Thermococcus siculi HJ21高温酸性α-淀粉酶的催化活性

通过分析超嗜热古菌Thermococcus siculi HJ21高温酸性α-淀粉酶基因,对6个可能提高酶催化活性的氨基酸残基进行定点突变,获得比未突变酶催化活性较高的突变子Y184H、Y121S、A109V、K98R、V125L。将以上5个突变位点集中在一个突变子上得到突变酶TSAM-23,该突变酶与未突变酶相比,酶的催化效率有较大提高,酶的活力和90℃条件下的热稳定性分别提高了3.75倍和2.4%,最适反应pH值为5.0,比未突变酶降低0.5,较之突变前有更好的工业应用价值。

Q20L及G247D定点突变对葡萄糖异构酶酶活和最适pH的改善

用双引物法对GI基因进行体外定点突变 ,构建了突变体Q2 0L和G2 47D。含突变基因的重组表达质粒pTKD GIQ2 0L及 pTKD GIG2 47D在E .coliK38菌株中表达。纯化的突变酶与野生型酶相比 :(1)GIQ2 0L的最适反应温度下降 5℃ ,热稳定性为野生型酶的 78% ,对底物的亲和性增强 ;(2 )GIG2 47D的酶活提高约 33% ,最适pH下降 0 6个单位 ,但热稳定性降低。初步分析认为 ,Gln 2 0位于α0～α1螺旋之间 ,其亲水侧链被Leu的疏水侧链取代后 ,分子表面增强的疏水作用 ,反而不利于蛋白质的稳定 ,使GIQ2 0L的热稳定性降低。Gly2 47是酶活性中心β 折叠 (2 42～ 2 47aa)的最后一个残基。引入电负性极强的Asp后 ,可能改变分子的静电场分布 ,影响了活性部位的电荷传递过程 ,使GIG2 47D酶活提高。引入的电荷 ,可能改变活性中心可解离基团的 pKa ,使其最适pH下降。另外Asp2 47的侧链在周围空间结构中显得过于拥挤 ,易与其他侧链产生排斥 ,由此影响到 β 折叠的稳定性 ,接近亚基结合面的Asp2 47,可能进一步影响到亚基间相互作用的稳定性 ,最终导致酶热稳定性的降低。GI酶活和最适pH的改善更利于工业生产。

粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白锌离子结合域定点突变

粉纹夜蛾颗粒体病毒(Trichoplusia ni granulovirus,TnGV)增强蛋白(enhancin)具有增强病毒感染力的作用。该蛋白包含一个多种杆状病毒增强蛋白都具有的保守结构域HELGH,是典型的金属蛋白酶锌离子结合域,但该结构域对增强蛋白生物活性的重要性尚未得到研究。本研究通过定点突变构建了该结构域的5个氨基酸分别突变为2种不同氨基酸的共10种增强蛋白突变体基因,并用杆状病毒载体进行了重组表达。活性测定发现,10种突变型增强蛋白大部分都丧失了野生型增强蛋白所具有的降解粉纹夜蛾幼虫围食膜粘蛋白的生物学功能,只有1种(第4位G突变为A)保留该生物学活性。这一结果表明锌离子结合域对增强蛋白生物活性具有重要作用,也提示增强蛋白确是一种金属蛋白酶。

苏云金芽孢杆菌Cry1Ca7蛋白定点突变对甜菜夜蛾杀虫活性的影响

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ca7对重要的农业害虫甜菜夜蛾具有较高毒力。【目的】本文的研究目的是通过定点突变的方法获得毒力发生改变的毒蛋白,为下一步研究工作提供有价值的实验材料。【方法】利用重叠引物PCR技术对cry1Ca7基因进行定点突变,获得了10种突变基因,通过生物活性测定的方法确定了各突变基因表达产物对甜菜夜蛾的杀虫活性。【结果】活性降低的突变毒蛋白有G138S,T221D,T221R,N251S,439GGT440,N306R,W376F,R522E和R570G,其中,位于DomainⅡ内的突变的活性依次是439GGT440<N306R<W376F;位于DomainⅢ内的突变R522E<R570G,二者的活性较Cry1Ca7也有明显降低;只有位于结构域Ⅰ中的R148G,产生了活性提高的突变毒蛋白,其毒性较Cry1Ca7提高了6倍,而同样位于DomainⅠ内的突变T221D<T221R<G138S<N251S,尤其是T221D活性完全丧失。研究结果表明,在结构域Ⅰ中的突变更容易产生活性提高的突变蛋白,而结构域Ⅱ和Ⅲ较难获得毒力提高的突变蛋白。【结论】本项研究所获得的这些活性发生不同变化的蛋白为揭示Cry蛋白的杀虫机理提供了基础材料,而活性提高的诱变基因及其表达产物将可作为新的杀虫资源,用于抗虫遗传工程菌和转基因植物的构建。

TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程

类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA结合结构域和非特异性的FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。TALEN能够根据用户需要切割特定的核苷酸靶序列,造成DNA双链断裂,从而诱导该靶序列产生indel突变,目前已成功地应用于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。文章介绍TALEN靶点的选择与确认,采用"单元组装法"构建人工TALEN的原理与步骤,以及通过显微注射TALEN mRNA诱导并筛选斑马鱼突变体的实验流程与经验。这些方法理论上也适用于对其他物种进行基因打靶。

利用定点突变技术构建突变nm23-H_1和EGFP融合基因

背景与目的以前的研究已经证明nm23H1基因是肿瘤转移抑制基因,但其抑制肿瘤转移的分子机制目前还不完全清楚。基因定点突变技术可以精确地改变基因的特定碱基序列,获得突变蛋白质。本研究的目的是应用基因定点突变技术构建突变型nm23H1增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因,为进一步研究肿瘤抑制基因nm23H1的功能、生化作用机制提供理论基础和实验依据。方法以逆转录病毒PLXSN野生型nm23H1EGFP质粒为突变模板,应用QuikChangeTM定点突变方法,简单、快速、高效地引入nm23H1S44A、nm23H1P96S、nm23H1H118F、nm23H1S120G四个点突变和一个联合位点突变nm23H1P96SS120G,构建了突变型nm23H1EGFP融合基因。结果成功构建了nm23H1S44AEGFP、nm23H1P96SEGFP、nm23H1H118FEGFP、nm23H1S120GEGFP、nm23H1P96SS120GEGFP五个突变型nm23H1EGFP融合基因,经DNA序列分析突变的碱基序列与实验设计完全一致。结论成功构建了五个具有不同突变位点的突变型nm23H1EGFP融合基因。QuikChangeTM定点突变技术是一种简单、快速、高效的基因定点突变方法。

NisinZ的定点突变及突变体性质的研究

以本实验室构建的含nisZ基因的质粒pHJ2 0 1为模板 ,采用定点突变技术将乳链菌肽Z分子中B环第 8位Thr突变为Ser(T8S)、将第 2位Dhb突变为Dha和第 31位His突变为Lys(T2S H31K)以及将第 2 7位Asn突变为Lys和第 31位His突变为Lys(N2 7K H31K) ,以pMG36e为载体 ,电击转化乳酸乳球菌 (L .lactis)NZ980 0进行表达。对表达产物性质的研究结果表明 ,3个突变体的抑菌谱和溶解度未发生变化 ,其抑菌活性略有下降 ,但它们的稳定性表现各不相同 :N2 7K H31K的稳定性与NisinZ几乎一致 ,而T8S和T2S H31K的稳定性有明显提高 ,在pH9条件下10 0℃加热 5min仍不丧失抑菌活性。

运用定点突变提高重组木聚糖酶在毕赤氏酵母中的表达

运用PCR介导的定点突变对米曲霉 (Aspergillusoryzae)来源的木聚糖酶在毕赤酵母中的重组表达进行了研究 ,获得一表达量远远高于亲本的突变株I1 5 6A ,对其进行了提纯并研究其酶学特性 ,除热稳定性外其余与亲本基本一致。突变株I1 5 6A所产木聚糖酶XynFl的分子量为 3 5kD ,在pH 4～ 9范围内稳定 ,最适pH为 7 0 ,最适温度为 45℃ ,在 5 0℃以下稳定性略高于亲本。