乙型肝炎病毒PreS基因的克隆表达及亲和层析纯化

目的 获取乙型肝炎病毒前 S区基因 (HBVpre S) ,序列测定正确后进行融合表达 ,为今后研究其机制及应用创造条件 .方法 利用乙型肝炎病毒基因组为模板体外扩增HBVPre S基因后进行基因克隆 .目的基因经测序正确后克隆入融合表达载体 p RSET- C中 ,转化大肠杆菌 JM10 9(DE3) .目的基因经 IPTG诱导 ,由 T7启动子调控表达了氨基端带 6个连续组氨酸残基的 HBV- Pre S蛋白 ,在变性条件下对目的蛋白进行纯化 .结果 成功地扩增到 pre S区全长基因 ,得到融合 6个 His的 HBV- Pre S蛋白纯度大于 90 % .结论 构建了乙型肝炎病毒前 S区基因的重组表达载体 ,获得了稳定表达的工程菌 .

大肠癌相关抗原CA-Hb3的提取、亲和层析纯化及其生物学特性

方法：应用ＴｒｉｔｏｎＸ１００和正丁醇分别提取了大肠癌组织粗提抗原和大肠癌细胞株ＨＲＴ－１８的ＣＢＥ（正丁醇提取物），二者均有抗原活性。抗原经抗大肠癌单抗Ｈｂ３－亲和层析进一步纯化，获得纯大肠癌相关抗原ＣＡ－Ｈｂ３。结果：经鉴定，ＣＡ－Ｈｂ３为糖蛋白，其抗原活性与糖链有关。其分子量随变性程度而异，变性完全（１００℃巯基乙醇作用５ｍｉｎ）时为５０ｋＤ，而变性不完全（１００℃３ｍｉｎ）约２７ｋＤ，故推测该抗原是由两个亚基（约２７ｋＤ）组成的同源二聚体。结论：在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定蛋白质分子量时。

甘油磷酸胆碱的层析纯化及其稳定性研究

目的对甘油磷酸胆碱粗品进行层析纯化,并对其进行稳定性研究,从而为工业化生产、包装、贮存和制剂的研发提供依据。方法采用三氧化二铝脱色法和硅胶柱层析法相结合的工艺对甘油磷酸胆碱进行层析纯化;设计影响其稳定性试验:分别取三份GPC(批号为100301、100302、100303)光线强度为4 500 LX的强光照射10 d,60℃高温放置10 d,温度25℃、相对湿度75%放置10 d,密闭于40℃、相对湿度75%的器皿中放置12月的加速试验,密闭于25℃、相对湿度75%的器皿中放置12月的长期试验并做重复试验,采用色谱柱为GraceSmart RP C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为60%乙腈-水溶液,检测其含量变化。结果通过三氧化二铝脱色法和硅胶柱层析法相结合的工艺进行分离纯化,能得到纯度达99.5%以上的甘油磷酸胆碱产品;强光试验含量均数为99.51%(n=9)、RSD=0.40%,高温试验含量均数为99.65%、RSD=0.42%(n=9),高湿试验含量均数为99.30%、RSD=0.47%(n=9),加速试验含量均数为99.61%、RSD=0.57%(n=15),长期试验含量均数为99.12%、RSD=0.50%(n=15),重复试验含量均数为99.68%、RSD=0.43%(n=5)。结论层析纯化度高,工艺简单,可操作性强,适用于工业化生产;甘油磷酸胆碱的稳定性好,且采用的稳定性测定方法灵敏、准确、重现性好。

疏水作用层析纯化脂肪酶

报道了以对β-硫酸酯己砜基苯胺（SESA）为活化剂制备疏水作用层析剂方法及其柱层析纯化脂肪酶的工艺条件。实验结果表明：活化剂对-β-硫酸酯己砜基苯胺（SESA）最适用量为1．0g／g湿纸纤维素。笨胺：丙酮比为1：4．以0．2mol／L磷酸缓冲液（pH8.0）=1mol／LNaCl为淋洗剂，以0．2mol／L磷酸缓冲液（pH8．0）＋8％吐温80为洗脱刘纯化脂肪酶具有较好的分辨率，酶活回收率64．0％，比活提高6．70倍。

单克隆抗体亲和层析纯化日本脑炎病毒V_3(E)糖蛋白的研究

本文探讨了用JEV-V_3(E)McAb制备亲和层析柱纯化mg量V_3糖蛋白的方法。结果表明,超声粉碎法裂解病毒囊膜不影响HA活性,而化学裂解剂(NP_(40)、去氧胆酸钠、Tritonx-100)处理病毒原始材料,则导致HA活性的丧失;pH11.5,0.05M二乙胺洗脱剂对V_3的生物学活性影响较少;而3M KSCN对V_3的HA活性有明显影响;用亲和力适中的McAb 2F_2和mC_3亲和层析柱纯化V_3糖蛋白,其HA活性的回收率分别为30～40％及30～60％,蛋白收获量分别为0.33～1.26及0.21～0.66mg,相对HA比活性分别提高3～8倍及8～12倍;经SDS-PAGE考马斯亮蓝染色,显示一条主带,分子量相当于V_3糖蛋白;纯化的V_3糖蛋白可诱导小鼠产生HI抗体及NT抗体。

生物化学实验多媒体课件制作初探——亲和层析纯化胰蛋白酶示教片的制作

为便于学生规范、准确地掌握生物化学的基本实验技术和实验方法,以胰蛋白酶的分离纯化为例,进行了教学示教片制作的初步尝试。就示教片拍摄的设计思路、拍摄脚本及道具的准备、拍摄过程中常遇到的问题等进行了较详细的讨论。

紫丁香苷、橄榄苦苷硅胶柱层析纯化研究

紫丁香是我国北方常用园林绿化植物,本试验研究确定紫丁香苷、橄榄苦苷粗品的硅胶柱层析条件,为紫丁香苷和橄榄苦苷进一步开发利用和紫丁香叶片变废为宝提供理论依据。结果表明：紫丁香苷最佳洗脱剂比例为乙酸乙酯：甲醇：水=12：1：0.2,硅胶粒度为100~200目,径高比1：10,洗脱流速0.6 cm/min,负载量为25 mg/g,最终得紫丁香苷纯度可达92%,回收率达78%。橄榄苦苷最佳洗脱剂比例为乙酸乙酯：甲醇：水=16：1：0.2,硅胶粒度为100~200目,径高比1：10,洗脱流速0.6 cm/min,负载量15 mg/g,最终得橄榄苦苷纯度可达86%,回收率达85%。

银杏聚戊烯醇柱层析纯化工艺的研究

对银杏聚戊烯醇柱层析纯化条件进行研究，所得产物经薄层层析与高效液相色谱分析，聚戊烯醇含量超过90％。

木糖醇脱色液层析纯化的研究

采用 73 2 # 钙型树脂为层析剂 ,以不同 pH的蒸馏水为洗脱液 ,用均匀设计法安排实验并考察在不同的实验条件下木糖和木糖醇的分离度及木糖醇的回收率 ,寻找较佳分离方法 ,确定较佳分离条件为洗脱液 pH =4.0 ,流速 =3 .6ml/min ,高径比H/D =3 2 ,T =5 0℃ .在较佳条件下的分离度RS=0 .2 9,木糖醇回收率为 10 0 % ,色谱峰形较尖锐 ,峰宽窄 ,没有拖尾现象 。

稳可信——层析纯化万古霉素

据美国医院感染监测系统(NNIS)报告,手术部位感染是第3位最常见的医院感染,占住院病人所有医院感染的14%～16%.由此可见,控制感染对于手术成功是至关重要的.

一种基于酵母3',5'-二磷酸核苷酸酶的蛋白亲和层析纯化体系

蛋白质是生命活动的主要承担者.蛋白质的结构和功能的研究在后基因组时代尤为重要.为深入分析蛋白质的结构和功能,研究者们需要分离纯化大量不同的蛋白质.亲和层析具有高选择性、高活性回收率和高纯度等特点已成为纯化蛋白质等生物大分子最有效的技术之一.目前,常用的亲和层析标签有多聚组氨酸、谷胱甘肽转硫酶、麦芽糖结合蛋白等,但不同的标签各有其优缺点.例如:研究发现如果表达的蛋白表面有几个接近的组氨酸,此蛋白可能结合Ni-NTA介质,最终和目的蛋白一同洗脱下来,导致多聚组氨酸标签纯化的蛋白纯度不够;麦芽糖结合蛋白标签的缺点为层析介质价格较高且纯化的目的蛋白纯度较低;谷胱甘肽转硫酶标签的缺点为标签蛋白中半胱氨酸的氧化可导致目的蛋白凝集,且此蛋白与其配体的结合较慢,因此,我们需要降低上样流速,延长样品的上样时间等.最近,我们开发了以酵母3',5'-二磷酸核苷酸酶作为原核蛋白表达和分离纯化的标签.本文主要对其蛋白纯化原理和方法进行总结.

双孢菇菇柄多糖柱层析纯化及单糖组成

以双孢菇菇柄为试材,首先对经超声提取得到的菇柄多糖进行柱层析分离纯化,然后对柱层析得到的多糖组分别采用紫外光谱和柱层析进行纯度分析,并进行红外光谱分析和单糖组成分析。结果表明,脱蛋白双孢菇菇柄多糖经DEAE Sephadex A-25柱层析纯化共得到4个组分,收集其中两个较多的组分(蒸馏水和0.1 mol/L Na Cl洗脱组分),经紫外光谱扫描无核酸和蛋白质,经Sephadex G-200柱层析鉴定均为单一峰。所得两种多糖组分经FT-IR红外光谱分析,均含有多糖特征吸收峰,且均为吡喃糖环β-异构体的多糖。菇柄蒸馏水洗脱多糖组分由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖组成,0.1 mol/L Na Cl洗脱组分是由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖组成。

用DE-52纤维素柱层析纯化柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子

从分子水平上研究球虫的时候，经常需要对球虫的不同发育阶段进行纯化，这样便能够获取所需的核酸。在球虫的纯化过程中，有关子孢子纯化的比较多见。相反，针对球虫裂殖子纯化的报道相对较少。在有限的文献中，球虫裂殖子的纯化方法比较繁琐。笔者主要针对柔嫩艾美耳球虫的第二代裂殖子，

为大规模制备高纯度百日咳疫苗奠定基础 切向流工艺和层析工艺在百日咳毒素分离纯化中的应用

本文将介绍采用切向流微滤和超滤技术及层析方法纯化百日咳毒素。用中空纤维微滤工艺替代传统离心机分离澄清百日咳菌液，用OmegaT型筛网5KD超滤膜包对澄清料液浓缩并置换缓冲液。随后进行阴离子层析和羟基磷灰石层析纯化百日咳毒素。百日咳毒素可通过高盐抽提、切向流澄清和浓缩，以及DEAEHyperD阴离子交换层析和HAUltrogel羟基磷灰石两步层析达到较好纯度和回收率。

纯化层析系统在中药液体制剂生产中的应用

复方中药原料药材成分复杂、有效成分含量低、杂质多,生产过程需要对提取液进行深度的分离纯化,才能保证质量与安全。如何提高产品质量和用药安全,是中药液体制剂生产工艺的焦点和技术瓶颈问题。在色谱分析、制备层析等仪器设备技术基础上,制药工业纯化层析系统(Chromatography system)设备应运而生。因此,本文就纯化层析系统相关技术以及在中药液体制剂生产中的应用展开探讨。

大肠杆菌表达的vMIP-Ⅱ包涵体的纯化与复性研究

目的纯化、复性大肠杆菌表达的vMIPⅡ包涵体蛋白。方法用8molL尿素缓冲液变性溶解vMIPⅡ包涵体,然后加入十二烷基磺酸钠(SDS)进一步促溶,利用金属亲和层析和分子筛层析纯化,再利用柱层析去除SDS,纯化后透析复性;通过荧光和单核淋巴细胞趋化抑制实验检测复性蛋白的结构和抑制单核淋巴细胞趋化的活性。结果重组vMIPⅡ纯化和复性后,仍具有完整的高级结构和抑制单核细胞趋化的活性。结论已获得了重组vMIPⅡ活性蛋白,为进一步研究应用奠定基础。

SARS病毒刺突蛋白片段在大肠杆菌中的表达和纯化

目的获得SARS病毒表面刺突蛋白片段。方法用PCR方法克隆SARSS2片段基因,并在大肠杆菌中进行表达。表达产物经SDSPAGE及Westernblot鉴定,阴离子交换层析纯化。结果SARS病毒S2片段基因在大肠杆菌中获得了高表达,表达量占总蛋白的50%以上;得到纯度大于90%的SARS蛋白样品。结论获得了能够应用于SARS疫苗研究的SARS蛋白样品。

茶叶多糖的提取纯化及其单糖组分的鉴定

研究了用水煮醇沉法提取茶叶多糖,用savage法除蛋白,苯酚-硫酸法测多糖含量,通过正交试验确定茶叶多糖的最佳提取条件;粗多糖经Sephadex-100柱层析纯化,得到精制茶叶多糖;薄层层析法鉴定单糖组分。结果表明:最佳提取条件为95℃,料液比1∶20(g:mL),提取时间2h,提取3次,茶叶多糖含量为35.92mg/g。茶叶多糖中含有2种不同的多糖,水解得到单糖D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖等。

人胰岛素样生长因子1前体基因的重组、表达及纯化

目的构建含有人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)前体编码基因的重组载体,在E.coliBL21中表达,并探讨其抗原性和应用价值。方法用PCR法,从现有重组质粒pBakPAK8/hIGF-1中,扩增编码hIGF-1前体的基因片段,经双酶切、纯化、连接后得到pET29a(+)/hIGF-1重组体,再将其转化大肠杆菌BL21-CodonPlus并诱导表达。表达产物经镍柱亲和层析纯化后,用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果重组持粒pET29a(+)/hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析证实构建成功。在大肠杆菌BL21-CodonPlus中经IPTG诱导表达,有一相对分子质量15000的重组蛋白hIGF-1前体,该蛋白经镍柱亲和层析获得了良好的纯化效果,具有特异的抗原活性。结论成功地克隆并表达相对分子质量为15000的hIGF-1前体编码基因,为进一步制备抗hIGF-1抗体和后续hIGF-1生物学功能研究打下了良好基础。