伊氏锥虫、马媾疫锥虫、布氏锥虫、刚果锥虫的18S rDNA部分序列测定与系统发育关系

对伊氏锥虫(Trypanosomaevansi):新疆株(XJCA)、湖北株(HBM)、云南株(YNB)、广东株(GDB2);马媾疫锥虫(Trypanosomaequiperdum)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、刚果锥虫(Trypanosomacongolense)提取基因组DNA,根据已报道的伊氏锥虫株18SrDNA基因序列设计合成引物,用PCR扩增了锥虫虫株基因组DNA,伊氏锥虫新疆株、湖北株、云南株、广东株、布氏锥虫、刚果锥虫均为373bp的片段;马媾疫锥虫为372bp的片段,PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化,纯化后PCR产物经连接、转化后测序,将测得的序列用DNAMAN软件分析并与国外已发表的相应序列进行了同源性比较,并绘制了系统发育进化树。结果与国外AJ009153、AJ223564、D89527株同源性达到99%～100%,与另外11株同源性75%。本研究为锥虫分子流行病学研究及分类研究打下基础。

布氏锥虫伊氏亚种体外培养的研究——布氏锥虫伊氏亚种的纯净培养

用无细胞培养系统培养我国3株水牛源布氏锥虫伊氏亚种取得成功。从开始培养的第7天起,向虫数已很少且不增殖的培养物中逐日补种少量滋养层细胞系统培养的培养日龄相同的同株锥虫,于10～17天间逐步建立了适应于无细胞系统的锥虫群体。整个适应过程可分为4个阶段——一过性生长期、生长停滞期、初步适应期和完全适应期。至今已连续培养9个月,虫密度一般保持在1×10~6/ml左右,最高可达1.9×10~6/ml。锥虫在培养物内有规律地呈现岛屿状密集分布。长期培养的锥虫仍保持单一细长形态,具表面被膜、对小白鼠有致病力。对已适应于无细胞系统的锥虫,成功地进行了克隆、冻存、复苏后可直接继续培养。实验表明,培养液中2-ME和马血清的适宜浓度分别为0.3mmol和20％,添加0.1mmol次黄嘌呤可使虫密度增加约1倍。用烛罐可取代CO_2-培养箱。基础培养基贮存于-20℃,至少可使用76天。

布氏锥虫伊氏亚种体外药敏试验

应用布氏锥虫伊氏亚种(Trypanosoma brucei evansi,T.b.e)体外药敏试验系统检查了国内6个T.b.e虫株和国外布氏锥虫指名亚种(T.b.b)对苏拉灭(Suramin)、贝尼尔(Berenil)、安锥赛(Antrycide)、咪唑苯脲(Imidocard)和硫胂聚氰胺(Cymelarsan)等5种抗锥虫药的敏感性。结果表明,该系统能准确测定不同虫株对各种药物的敏感性,与小鼠治疗试验结果基本相符,发现了国内抗贝尼尔和苏拉灭的T.b.e虫株。

伊氏锥虫和布氏锥虫动基体DNA酶切电泳比较

限制性内切酶ＭｂｏＩ、ＤｄｅＩ、ＨｉｎｆＩ和ＴａｑＩ对市氏锥虫ＫＤＮＡ进行酶切后，电泳中均显示出多条ＤＮＡ区带，其总Ｋｂ数约等于２０ｋｂ，内各限制酶对伊氏锥虫ＫＤＮＡ消化后均显示出１至２条区带，总和约１ｋｂ，明显区别于布氏锥虫。

布氏锥虫C型凝集素类似蛋白的鉴定

C型凝集素在机体免疫系统中具有重要的作用。为了解布氏锥虫(T.brucei)基因组编码的C型凝集素类似蛋白(CLLPs),本研究在GeneDB数据库中通过软件鉴定了13种T.brucei基因组编码的CLLPs家族基因序列,并分析它们之间的遗传进化关系。同时,采用RT-PCR方法检测了其中3种CLLPs基因在血液阶段(BSF)T.brucei虫体内的转录。利用PCR扩增并在大肠杆菌中对所选3种基因进行表达,以表达的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。实验结果表明,本研究选择的3种CLLPs基因在BSF T.brucei虫体内均能够进行转录;而通过间接免疫荧光检测表明所选的3种CLLPs基因中,只有一种CLLP(Tb5290)在T.brucei的BSF阶段和昆虫阶段(PCF)表达。本研究首次在T.brucei中鉴定了C型凝集素家族的新成员,为进一步了解CLLPs在T.brucei中的生物学功能的研究奠定了基础。

体外培养布氏锥虫伊氏亚种的葡萄糖代谢

布氏锥虫伊氏亚种[Trypanosoma(Trypanozoon brucei evansi)下简称伊氏锥虫]在宿主体内以葡萄糖作为能量来源,葡萄糖被酵解为丙酮酸排入体液。其在体外的存活和培养都需有葡萄糖存在。伊氏锥虫病病畜呈现低血糖。为了解体外培养伊氏锥虫的葡萄糖代谢。

布氏锥虫伊氏亚种体外培养和体外药敏试验研究

本研究在测定适合我国布氏锥虫伊氏亚种(下简称伊氏锥虫)虫株生长的最适条件的基础上,对Baltz培养系统作了改进,建立了无需饲养层培养系统适应过渡直接建立无细胞培养的方法,总结出了一套保证体外培养成功并长期连续培养的技术措施。研究中还发现:(1)培养中锥虫有规律地形成集落,其形成和保持有助于锥虫生长繁殖;(2)

布氏锥虫马媾疫亚种体外培养的研究

用小白鼠腹腔巨噬细胞滋养层系统和无细胞培养系统成功地培养了布氏锥虫马媾疫亚种。开始建立无细胞培养系统培养时,从第6天起每日补种少量滋养层细胞系统培养的虫体,于3周内逐步建立了适应于无细胞培养系统的锥虫群体。长期连续培养两种系统培养物的虫密度均可稳定保持在7—10.O×10~5/ml左右,虫体有规律地呈岛屿状密集分布。培养液内2—ME和马血清的适宜浓度分别为0.3mM和20%,添加0.1mM次黄嘌呤可使培养物虫密度增加1倍左右,用烛罐可取代CO_2培养箱。体外连续培养120天。锥虫仍保持细长形态,具表面被膜,对小白鼠有感染性。

布氏锥虫亮氨酰-tRNA合成酶的克隆表达纯化及活性测定

目的克隆布氏锥虫亮氨酸-tRNA合成酶基因,并进行表达纯化及活性测定。方法通过PCR方法从布氏锥虫细胞基因组中扩增出亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)基因,依次克隆入pBS-T克隆载体及pET21a(+)表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中通过条件优化后表达。表达产物用His-Bind亲和色谱纯化,并用免疫印迹进行鉴定。采用放射性同位素方法进行酶活性测定。结果PCR扩增得到3.2 kb的DNA片段,重组质粒pET21a(+)/LeuRS经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体可溶性蛋白的20%,纯化后蛋白纯度达85%,免疫印迹进行鉴定蛋白正确,酶活性测定计算出提纯物酶活性约为72 U/mL。结论已成功克隆表达纯化出布氏锥虫亮氨酸-tRNA合成酶,并用放射性同位素方法进行了酶活性测定,这为下一步进行布氏锥虫亮氨酰-tRNA合成酶抑制物的设计和体外筛选奠定了良好的基础。

布氏锥虫伊氏亚种体外培养的研究——用小鼠腹腔巨噬细胞作滋养层培养布氏锥虫伊氏亚种

用小鼠腹腔巨噬细胞作滋养层,以HEPES缓冲的添加20％兔或马血清、0.1％葡萄糖、0.2mmol 2-巯基乙醇、2mmol丙酮酸钠、0.1mmol次黄嘌呤(用马血清时)、青霉素(100IU/ml)和链霉素(100μg/ml)的含MEM非必需氨基酸的MEM培养液体外培养布氏锥虫伊氏亚种获得成功。连续培养60天,培养虫体绝大多数仍保持细长形态,并对小鼠有很高感染性。文内还就实验方法和结果结合文献对一些问题作了讨论。

分泌抗布氏锥虫群共同抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用DEAE-纤维素分离的布氏锥虫伊氏亚种JG克隆株虫体按Segura 氏法制备抗原,常规免疫BALB/c鼠、融合、筛选和克隆。筛选时除使用免疫抗原外,还使用按同法制备的我国不同地区分离的3株布氏锥虫伊氏亚种(JX、ZJ、GY株),1个布氏锥虫马媾疫亚种虫株和培养的1株布氏锥虫指名亚种发育前期型虫体的抗原,以及泰氏锥虫和弓形虫抗原。共获得8个杂交瘤细胞株(4A_(11)、2D_6、5C_8、2E_3、1H_8、1C_9、1F_(11)、4F_6。它们分泌的单克隆抗体与泰氏锥虫、弓形虫抗原均无反应。4A_(11)、2D_6在ELISA和间接免疫荧光试验中只与免疫克隆株抗原反应。其余6株在ELISA中不仅与免疫株抗原反应,而且与其他锥虫虫株抗原呈明显交叉反应,免疫荧光试验则全部阴性。在ID试验中,1C_9、1F_(11)腹水与上述6种抗原呈现明显沉淀线,另6株则均无反应。4A_(11)和2D_6是针对伊氏锥虫群JG克隆株特异抗原,而5C_8、2E_3、1H_8、1C_9、1F_(11)、4F_6则是抗布氏锥虫群共同抗原。

布氏锥虫来源内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的异源表达和活性鉴定

内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase,ENGase)是一类可以水解N-糖链中核心壳二糖之间β-1,4-糖苷键的糖苷内切酶,其中糖苷水解酶85家族(glycoside hydrolasefamilies 85,GH85)的ENGase除了水解活性之外还具有转糖基活性,能够以切除后再将均一的寡糖链转移到N-糖蛋白的β-N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)上的方式,改造医药糖蛋白的N-糖基化修饰。通过数据库检索,在布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的基因组中找到了GH85家族ENGase的同源序列,并命名为Endo-Tb基因,对其克隆后在带有Nus融合蛋白的原核(E.coli)表达载体上成功表达并纯化。检测到融合蛋白Nus-Endo Tb能够水解高甘露糖型和双天线的复合型糖链,但不能作用于三天线的复合型糖链。同时Nus-Endo Tb可以水解核糖核酸酶B和人类转铁蛋白上的N糖链。当用唾液酸糖肽(SGP)作为糖基供体,MU-GlcNAc作为糖基受体时,通过荧光基质底物四甲基伞形酮(MU)检测到Nus-Endo Tb具有转糖基活性。

布氏锥虫Trx-putative和Trx-like的抗氧化功能研究

硫氧还蛋白(Trx)是一种氧化还原调节蛋白,参与锥虫抗宿主氧化,生物信息学分析发现Trx-putative和Trx-like含有与Trx一样的“Tioredoxin-like super family”结构域,为了阐明其抗氧化功能,通过原核表达方法获得其重组蛋白,重组蛋白免疫SD大鼠制备抗性血清,间接免疫荧光试验观察其在虫体内的表达情况,DTT/胰岛素还原法测定其二硫键异构酶活性,金属催化氧化法测定其体外保护DNA超螺旋活性,利用PCR点突变的方法分析其结构与功能的关系。结果显示,获得了纯度较高的重组蛋白,Trx-putative和Trx-like广泛分布于虫体胞质内;Trx-putative可以催化胰岛素二硫键的打开,而Trx-like不具备此功能;Trx-putative和Trx-like均可对氧化损伤的pUC19质粒产生保护,突变蛋白的二硫键异构酶活性显著降低,抗氧化作用减弱。这些结果提示布氏锥虫Trx-putative和Trx-like具有抗氧化功能。

布氏锥虫的一种核苷酸运输系统与药物抗性有关

病原体的药物抗性是日益严重的问题 ,其机制尚不完全了解。一般认为细胞摄入抗布氏锥虫药大多是通过一种至今尚未被识别的不平常的腺苷运输系统发生的 ,使用酿酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae)以功能筛选的方法克隆了布氏锥虫指名亚种( Trypanosoma brucei brucei)的一个编码核苷酸运输系统的基因— Tb AT1。Tb AT1在酵母中表达时 ,使酵母能摄取腺苷 ,并赋予对密胺基苯胂类药物 ( Melaminophenyl arsenicals)的敏感性。抗药锥虫藏匿缺损 Tb AT1的变种。

以布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶为靶标的抗锥虫药物筛选系统的建立

锥虫是人的血液寄生虫,对热带乃至拉丁美洲贫困地区影响极大,但目前的传统治疗药物存在副作用大、有效性不断降低的问题。根据亮氨酰tRNA合成酶在微生物中可作为药物靶点的事实,在新型抗锥虫药物筛选中,通过对锥虫的亮氨酰tRNA合成酶的克隆、表达和纯化,以及该酶活性测定的优化,建立了该酶抑制物的筛选系统。筛选结果表明,这一以锥虫亮氨酰tRNA合成酶为靶标的抗锥虫药物筛选系统可以有效筛选抗锥虫化合物,选出的化合物有一定的抗锥虫特异性,并可以用于化合物的进一步优化和测定其半抑制浓度。使用这一系统筛选到了对锥虫有较好抑制作用,但对人类细胞毒性较小的一系列新型化合物,因而锥虫亮氨酰tRNA合成酶很可能成为开发有效抗锥虫药物的新靶标。

首例输入性布氏罗得西亚锥虫病病例分析

目的分析和总结首例输入性布氏罗得西亚锥虫病病例的诊断、治疗过程,为输入性锥虫病的防治提供科学依据。方法应用流行病学方法调查病例的流行病学史,吉氏染色显微镜下进行虫体观察,结合临床表现和其他辅助检查,进行诊断和治疗。结果发热病人的外周血涂片检出锥虫,经基因扩增和测序,为布氏罗得西亚锥虫,结合流行病学史和临床表现,诊断为布氏罗得西亚非洲锥虫病;脑脊液检查未检出锥虫,且白细胞≤5mm3,判定为病程第一阶段,采用苏拉明抗锥虫治疗;疗程结束病人症状体征消失,多次复查血液,均未检出锥虫,痊愈出院。结论该例病例为我国首例输入性布氏罗得西亚锥虫病,应加强输入性寄生虫病的防控。

布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及活性测定

苯丙氨酰-tRNA合成酶是布氏锥虫蛋白合成过程中的一类重要酶,以其为靶点的抑制剂可能发展成为新一代的抗锥虫药物,但此前并没有分离锥虫苯丙氨酸-tRNA合成酶的报道。本研究用大肠杆菌成功克隆表达并纯化了布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶并进行了活性测定。首先通过PCR方法从布氏锥虫细胞基因组中分别扩增出苯丙氨酰-tRNA合成酶的α亚基、β亚基的基因,依次克隆入pCOLADuet共表达载体,然后在大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中进行了成功表达,并采用Ni-Bind亲和层析对其进行了纯化,最后用免疫印迹进行了鉴定。此外还采用放射性同位素方法进行了酶活性测定,这为下一步进行布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶抑制物的设计和体外筛选奠定了良好的基础。

布氏锥虫未知CCCH-型锌指蛋白TbZC3H8功能特性的初步分析

目的通过RNAi和蛋白复合物鉴定来初步分析布氏锥虫未知锌指蛋白TbZC3H8的特性及功能。方法运用蛋白数据库和分析软件对TbZC3H8进行序列分析和结构域预测;构建RNAi诱导表达细胞株分析TbZC3H8经RNAi敲低后对锥虫生长的影响,并通过RT-QPCR和Western blot检测RNAi干扰效率;构建异位融合表达myc-TAP标签的TbZC3H8细胞株,采用串联亲和纯化合并质谱鉴定其蛋白复合物组成;采用免疫荧光分析蛋白定位。结果 TbZC3H8的CCCH结构域在动基体原虫中高度保守;RNAi下调TbZC3H8后明显抑制了锥虫复制;TbZC3H8蛋白复合物中包含多种未知蛋白和两种RNA结合蛋白;TbZC3H8蛋白定位于胞质中,血清饥饿和热刺激对其定位无影响。结论 TbZC3H8是锥虫生长必需的,TbC3H8与RNA结合蛋白的相互作用暗示其可能在RNA加工代谢中发挥着作用。

布氏锥虫自噬蛋白ATG12的表达、纯化及二级结构预测

[目的]表达纯化布氏锥虫自噬蛋白TbATG12,并对其二级结构进行预测。[方法]克隆TbATG12编码序列,采用酶切连接方法构建表达载体TbATG12(pET-28a),转化进入BL21(DE3)表达菌株诱导蛋白表达,利用Ni^(2+)-NAT亲和层析及分子筛层析方法纯化蛋白。采用核磁手段,采集一维和二维谱图,利用JPred 4预测其二级结构。[结果]16℃、0.5 mmol/L IPTG诱导20 h,TbATG12以可溶蛋白形式存在。纯化后蛋白纯度可达95%。TbATG12谱峰分布均匀,强度较强,二级结构预测其含有3个α-螺旋和5个β-折叠,为后续解析TbATG12溶液结构提供指导。[结论]克隆、表达纯化得到纯度>95%可溶TbATG12蛋白,二级结构预测和比对发现其结构在进化上很保守。