异亮氨酸缓解轮状病毒攻毒断奶仔猪十二指肠结构和功能的研究

为探究异亮氨酸(Isoleucine,Ile)对轮状病毒(RV)攻毒的断奶仔猪腹泻评分及十二指肠肠道形态和功能的影响,本试验采用2×3双因子交叉设计,第1个因素为基础日粮中Ile水平(0、0.5%、1.0%),第2个因素为RV攻毒与否。选取21日龄体重相近的健康断奶仔猪48头(杜×长×大),随机分为6个处理组,每个处理8个重复,每个重复1头猪。第1、2组饲喂基础日粮,第3、4组为基础日粮+0.5%Ile,第5、6组为基础日粮+1%Ile。在饲喂第14天时,所有仔猪灌服100 mmol/L碳酸氢钠溶液5 mL,20 min后,第2、4、6攻毒组进行灌服RV 5 mL(10^(6)TCID_(50)/mL)攻毒处理,第1、3、5组灌服生理盐水5 mL。攻毒后饲喂日粮不变,在试验第18天进行采样。结果显示:攻毒试验前14 d Ile试验组的腹泻指数与对照组相比差异不显著,在试验15~18 d时RV攻毒对照组断奶仔猪的粪便评分指数显著高于试验组,通过Ile的治疗断奶仔猪的粪便评分指数有降低的趋势,Ile与RV具有交互作用。在Ile处理下,试验组十二指肠的绒毛高度与对照组相比显著升高,绒隐比在RV处理下显著升高,杯状细胞在Ile作用下试验组与对照组显著上升;RV处理下试验组与对照组显著下降,添加Ile显著影响断奶仔猪十二指肠的超氧化物歧化酶,Ile与RV无显著交互作用,试验组的总抗氧化、谷胱甘肽与对照组相比差异不显著;试验组与对照组的消化酶活性差异不显著。Ile可以缓解RV对断奶仔猪的腹泻,改善十二指肠组织结构以及抗氧化能力。

异亮氨酸对断奶仔猪睾丸生长发育、抗氧化能力和生殖激素水平的作用研究

试验旨在研究不同水平异亮氨酸对断奶仔猪睾丸生长发育、抗氧化功能及生殖激素的影响。选取28日龄断奶仔猪18头,随机分成3组,每组6个重复,每个重复1头仔猪。各组饲粮异亮氨酸水平分别为0.8%、1.0%、1.2%。试验期21 d。结果显示:与0.8%异亮氨酸组(对照组)相比,1.0%异亮氨酸组睾丸尺寸和重量均显著升高(P<0.05);1.0%和1.2%异亮氨酸组睾丸组织曲细精管横截面积及曲细精管周长均显著升高(P<0.05);1.0%异亮氨酸组睾丸组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著增高(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著降低(P<0.05),1.0%异亮氨酸对下丘脑-垂体-睾丸性腺轴生殖相关指标具有明显的调控作用。研究表明,1.0%异亮氨酸可以缓解仔猪断奶导致的氧化应激,通过改变下丘脑-垂体-睾丸组织性腺轴生殖相关激素分泌水平,影响仔猪睾丸形态及生殖相关指标。

精氨酸和异亮氨酸对白羽肉鸡肠道发育、免疫器官指数和肉品质的影响

为研究无抗日粮中添加精氨酸和异亮氨酸对白羽肉鸡肠道发育、免疫器官指数和肉品质的影响,本试验选用健康的1日龄罗斯308肉仔鸡720只,随机分成4个处理,每个处理6个重复,每个重复30只,分为对照组(基础饲粮)、抗生素组(基础饲粮+75 mg/kg金霉素)、AL2组(基础饲粮+2%精氨酸和异亮氨酸)、AL5组(基础饲粮+5%精氨酸和异亮氨酸)。研究结果表明:(1)与对照组相比,抗生素组、AL2组和AL5组商品肉鸡21 d的空肠绒毛长度分别提高7.97%、15.94%和13.69%(P<0.05),回肠绒毛长度分别提高15.38%、33.34%和39.05%(P<0.05),21 d的空肠绒腺比提高11.27%、18.18%和16.54%(P<0.05),回肠绒腺比分别提高22.27%、38.93%和44.78%(P<0.05);同时,与抗生素组相比,AL2组和AL5组肉鸡21 d回肠的绒毛长度分别提高15.57%和20.51%(P<0.05),绒腺比提高13.63%和18.41%(P<0.05)。(2)AL2组和AL5组42 d的脾脏指数、胸腺指数和法氏囊指数分别较对照组提高29.76%和31.95%、36.519%和43.70%、47.61%和63.37%(P<0.05);AL2组和AL5组42 d的胸腺指数分别较抗生素组提高24.39%和30.95%(P<0.05)。(3)抗生素组、AL2组和AL5组的胸肌肉色值分别较对照组提高22.21%、15.27%和22.97%(P<0.05),腿肌肉色值分别提高14.98%、15.81%和16.83%(P<0.05),腿肌的滴水损失分别降低12.85%、20.26%和26.92%(P<0.05);AL2组的胸肌肉色a值和b值较抗生素组分别提高24.30%和26.84%(P<0.05),腿肌肉色的b值较对照组降低17.64(P<0.05)%;AL5组的腿鸡滴水损失较抗生素组和AL2组分别降低16.14%和8.35%(P<0.05)。综上所述,日粮添加精氨酸和异亮氨酸能促进肉鸡的肠道和免疫器官发育,提高肉品质,可在一定程度上替代抗生素。

日粮补充异亮氨酸对肉鸡生长性能、肉品质和肠道形态的影响

试验旨在研究在日粮中补充异亮氨酸(Ile)对肉鸡生长性能、肉品质和肠道形态的影响。选取1日龄健康且状态良好爱拔益加(AA)肉仔鸡10500只,随机分为3组,每组7个重复,每个重复500只鸡。对照组(CON组)饲喂基础日粮,试验组饲喂在基础日粮基础上分别添加400 mg/kg Ile(ILE400组)和800 mg/kg Ile(ILE800组)的试验日粮。试验期42 d。结果表明:与对照组相比,ILE400组和ILE800组能够显著降低肉鸡的料重比(F/G)和死淘率(P<0.05),ILE400组肉鸡平均日增重(ADG)显著升高(P<0.05);ILE400组胸肌和腿肌亮度(L*)值和红度(a*)值显著升高(P<0.05),ILE400组胸肌黄度(b*)值显著高于ILE800组(P<0.05);ILE400组和ILE800组能够显著提高肉鸡腿肌中粗蛋白含量(P<0.05)。此外,与对照组和ILE800组相比,ILE400组能够显著提高胸肌雷帕霉素靶蛋白(mTOR)mRNA相对表达量和小肠绒毛高度(P<0.05)。ILE400组真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)mRNA相对表达量显著高于ILE800组(P<0.05)。由此可见,日粮中补充400 mg/kg Ile(前、中、后期日粮中总Ile水平为1.01%、0.90%和0.87%)能够提高肉鸡的生长性能,降低死淘率,改善肉鸡的肉色,通过激活mTOR通路相关基因的表达,提高肌肉中蛋白质的含量,并且有利于改善肠绒毛发育。

异亮氨酸缓解猪睾丸支持细胞氧化应激作用

目的:研究异亮氨酸缓解过氧化氢诱导的猪睾丸支持细胞氧化应激的保护作用,并确定不同浓度异亮氨酸对缓解氧化应激导致的睾丸支持细胞活力下降的最佳浓度,及最佳异亮氨酸浓度对猪睾丸支持细胞的增殖、凋亡和抗氧化水平的影响。方法:利用CCK-8法检测细胞活力,筛选在氧化应激模型下异亮氨酸保护猪睾丸支持细胞的最适浓度。应用流式细胞术检测最适异亮氨酸浓度下支持细胞的周期和凋亡情况。应用试剂盒检测总超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,T-SOD)、总抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity,T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-Px)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的表达量。结果:与氧化应激丙氨酸等氮对照组和其他浓度氧化应激异亮氨酸组相比,32 mmol/L氧化应激异亮氨酸组细胞增殖活力显著升高。与氧化应激不加药组和氧化应激丙氨酸等氮对照组相比,氧化应激异亮氨酸组细胞分化G_(0)/G_(1)期比例相对较低,S期和G_(2)/M期比例无明显差异。与氧化应激不加药组相比,氧化应激异亮氨酸组细胞凋亡比例呈显著降低,与氧化应激等氮对照组相比,氧化应激异亮氨酸组细胞凋亡比例无明显差异。与无氧化应激丙氨酸等氮对照组和氧化应激丙氨酸对照组相比,异亮氨酸极显著增强T-SOD的活性,也极显著增加氧化应激异亮氨酸组T-AOC,而对GSH-Px和MDA没有显著影响。结论:在本试验条件下32 mmol/L异亮氨酸效果最佳,有效缓解氧化应激导致的细胞活力下降、细胞周期紊乱和细胞凋亡。

异亮氨酸在家禽生产中的应用研究进展

蛋白饲料资源短缺已成为制约畜牧业发展的重要因素,非常规蛋白质原料的开发以及低蛋白饲粮的配制技术已成为目前研究的重点之一。在当前深入推广实施的饲用豆粕减量替代行动与积极推广低蛋白质低豆粕多元化饲粮配制技术的行业背景下,异亮氨酸在家禽营养中的应用备受重视。异亮氨酸是畜禽机体内重要的必需氨基酸之一,具有促进蛋白质合成、修复肌肉、调控血糖水平和调节脂肪代谢等生理功能。本文就异亮氨酸的营养生理功能及其在家禽上的应用效果等方面进行综述,为其在家禽生产中的应用及相关机制研究提供参考。

低蛋白饲粮平衡异亮氨酸对育肥猪生长性能和经济效益的影响

本试验旨在研究低蛋白饲粮平衡异亮氨酸对育肥猪生长性能和经济效益的影响。试验选取142日龄、体重相近(78.77±4.46 kg)、健康的“大×白”或“长×白”纯种去势公猪24头,随机分为3组,每组8个重复,每个重复1头猪,仔猪代谢笼单栏饲喂,试验期26d。对照组饲喂粗蛋白水平为13%的饲粮,试验一组饲喂粗蛋白水平为12%的饲粮,试验二组饲喂粗蛋白水平为11%的饲粮,并外源添加赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸和异亮氨酸,保证三组日粮的可消化蛋、苏、色、缬、异亮氨酸水平与可消化赖氨酸比值保持一致。试验结果表明,降低饲粮粗蛋白水平至12%和11%同时进一步平衡异亮氨基酸对78kg~105 kg育肥猪平均日采食量、平均日增重和料肉比的影响差异不显著(P>0.05)。但进一步分析经济效益发现,试验一组和试验二组较对照组单位增重成本分别增加0.87和0.93元/kg。

新型异亮氨酸双加氧酶及其重组大肠杆菌合成羟基异亮氨酸

异亮氨酸双加氧酶(IDO)可特异性的转化底物L-异亮氨酸(L-Ile)生成4-羟基-L-异亮氨酸(4-HIL),该产物具有促进胰岛素分泌的功能,可用于抗糖尿病、降胆固醇等。本研究结合了酶标显色和薄层层析(TLC)的方法从自然界中筛到了具有IDO活性的菌株,并将该菌株中的目的基因ido克隆到大肠杆菌中,获得重组表达菌株,并且验证该菌具有IDO的转化功能。本研究优化了转化反应体系和条件,同时通过30℃过夜温育菌体细胞的方法,使该菌株全细胞转化合成4-HIL的产率达到85%以上。

重组大肠杆菌全细胞催化合成4-羟基异亮氨酸

4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种很有前景的药物,它具有促进胰岛素分泌、改善外周组织对胰岛素的抵抗性和调节血脂异常等作用,而L-异亮氨酸羟化酶(IDO)常用于4-HIL的生产。首先,克隆了苏云金芽孢杆菌来源的L-异亮氨酸羟化酶,实现了其在E.coli BL21(DE3)中的异源表达。其次,通过同源建模和蛋白质结构分析,本着将与底物氨基酸侧链结合的氨基酸残基从亲水性或长链疏水性结构突变成丙氨酸Ala的原则,对I156位点进行了定点突变,以增大底物结合口袋,扩宽底物通遒进而提高4-HIL的产量。最后,对野生酶及突变酶的酶学性质、突变酶的羟基化反应体系进行研究,在最优催化条件下,分批补料转化底物进行4-HIL的生产。酶学性质结果显示,野生酶及突变酶I156A的最适温度均为25℃,最适pH均为7.0;突变酶I156A比酶活比野生酶提高了1.9倍,L-ILe转化率提高了28%。羟基化反应体系的最优转化条件为:20 mmol/L L-ILe,20 mmol/Lα-酮戊二酸,8 mmol/L Fe^(2+),30 mmol/L抗坏血酸和HEPES(50 mmol/L,pH 7.0)缓冲液。在最优转化条件下,重组菌E.coli BL21/pET28a-ido^(I156A)进行分批补料转化底物,时间间隔为4 h,32 h后得到77.3 mmol/L 4-HIL,底物最高转化率98.35%e。

利用谷氨酸棒杆菌转化法合成4–羟基异亮氨酸

4–羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)具有葡萄糖依赖的促进胰岛素分泌的活性,在L–异亮氨酸(Lisoleucine,L-Ile)生产菌株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YILW中过表达来源于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)TCCC11826的L–异亮氨酸羟化酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)编码基因ido,以期利用微生物转化法合成4-HIL,并研究α–酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)和Fe2+添加量对菌株合成4-HIL的影响.结果表明:构建的C.glutamicum YILW-IDO菌株能够表达出有活性的IDO,并能够利用菌体自身合成的L-Ile以及培养基中的α–酮戊二酸合成4-HIL.此外,α–酮戊二酸和Fe2+均能影响4-HIL的合成,在其添加量分别为40,mmol/L和4,mmol/L条件下,培养50,h,4-HIL产量达(35.7±1.0)mmol/L.本研究可为4-HIL及氨基酸衍生物的生物制造提供理论依据.

气相S-异亮氨酸向R-别异亮氨酸的旋光异构机理及水溶剂化效应

采用密度泛函理论的B3LYP方法,微扰理论的MP2方法及自洽反应场(SCRF)理论的SMD模型方法,研究气相S-异亮氨酸向R-别异亮氨酸的旋光异构机理及水溶剂化效应.结果表明:该反应有a,b,c 3个通道,在通道a和c实现旋光异构反应需经过3个基元反应,在通道b实现旋光异构反应需经过4个基元反应;a为主反应通道,决速步骤Gibbs自由能垒为255.0kJ/mol,由质子从α手性C向氨基N迁移的过渡态产生,决速步骤的反应速率常数为1.25×10-32 s^(-1);水溶剂效应使决速步骤能垒降至114.1kJ/mol,反应速率常数增至2.73×10-7 s^(-1),即水环境对S-异亮氨酸旋光异构具有较好的催化作用.

利用离子交换法提取L-异亮氨酸的研究

利用离子交换法从Ｌ异亮氨酸发酵液中分离提取Ｌ异亮氨酸．考察了发酵液酸化ｐＨ值，不同浓度洗脱剂以及单柱与双柱串连吸附对Ｌ异亮氨酸分离提取的影响．确定了发酵液酸化ｐＨ低于２５，双柱串连吸咐，用０２ｍｏｌ·Ｌ－１ＮＨ４Ｃｌ０１ｍｏｌ·Ｌ－１ＮＨ４ＯＨ复合洗脱剂洗脱的分离效果较好．提取总收率可达４５％以上．

L-异亮氨酸高产菌育种机理的初步研究

研究了黄色短杆菌生物合成Ｌ－异亮氨酸代谢控制途径，结果表明，选育Ｌ－异亮氨酸高产菌必须首先活化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ＰＣ）、天冬氨酸激酶（ＡＫ）、高丝氨酸脱氢酶（ＨＤ）、苏氨酸脱氢酶（ＴＤ）和乙酰羟基酸合成酶（ＡＳ）这五个关键酶，并减弱由丙酮酸激酶（ＰＫ）、柠檬酸合成酶（ＣＳ）、天冬氨酸β－脱羧酶（ＡＤ）、二羟吡啶二羟酸合成酶（ＰＳ）和高丝氨酸－Ｏ－转乙酰酶（ＨＴ）引起的五条分支代谢强度，从而强化生物合成Ｌ－异亮氨酸的主代谢流。根据这一育种思想，以黄色短杆菌（ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍＡＴＣＣ１４０６７）为出发菌株，采用相关的氨基酸结构类似物进行定向育种，有目的地活化ＰＣ、ＡＫ、ＨＤ、ＴＤ和ＡＳ等酶，筛选获得的Ｌ－异亮氨酸高产菌ＺＱ－４，产酸达２８～３０ｇ／Ｌ．

L-异亮氨酸发酵的代谢控制育种

本文对L-异亮氨酸的基本性状、用途、生产方法、生产现状、生物合成途径与代谢调节机制，以及产生菌育种作了综述。

酶法拆分制备D-异亮氨酸的工艺研究

以DL-异亮氨酸为原料经过乙酰化、氨基酰化酶拆分和水解制备D-异亮氨酸。使乙酸酐与DL-异亮氨酸在0～10℃下反应生成乙酰-DL-异亮氨酸,在氨基酰化酶的作用下,温度为37℃搅拌反应3d处理得到L-异亮氨酸和乙酰-D-异亮氨酸,乙酰-D-异亮氨酸经过盐酸水解得到D-异亮氨酸,收率为97.4%,光学纯度达到98%以上。另外,我们考察了酶拆分的时间和温度对拆分收率的影响。

游离异亮氨酸对鲫鱼的促生长作用

分别采用菜粕和血粉为主要原料,按照鲫鱼肌肉必需氨基酸(EAA)模式添加和倍量添加晶体异亮氨酸(Ile)配制饲料,和缺乏Ile的饲料对比进行养殖试验,测定了鱼体的生长速度和对饲料的利用效率。结果表明,菜粕饲料中添加游离Ile对鲫鱼生长没有明显促进作用,也没有提高饲料效率,但在血粉饲料中的添加显示了明显的促生长效果,饲料效率也获得提高。

大肠杆菌合成4-羟基异亮氨酸的代谢工程研究

为进一步提高大肠杆菌(Escherichia coli)合成4-羟基异亮氨酸的性能,以前期构建的重组菌株Escherichia coli IEOH-9为出发菌株进行代谢工程改造。首先,过表达解除反馈抑制作用的天冬氨酸激酶编码基因lysCC1055T以强化L-异亮氨酸代谢通量;然后,过表达吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB以提高胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)水平;在此基础上,分别敲除丙酮酸激酶编码基因pykF和pykA以增强磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸的代谢流;最后过表达柠檬酸合酶编码基因glt A以提高前体物α-酮戊二酸的供应。结果表明,基因lysCC1055T、pnt AB过表达菌株E. coli IEOH-10、E. coli IEOH-11的4-羟基异亮氨酸产量分别达到17.3 g/L、19.4 g/L;敲除基因pykF的效果优于pykA,基因pykF敲除菌株Escherichia coli IEOH-13的4-羟基异亮氨酸产量为21.5 g/L;过表达基因glt A菌株IEOH-14的4-羟基异亮氨酸产量增加至24.7 g/L,较出发菌株IEOH-9提高57.3%,生物量无明显差异(P>0.05)。

草鱼幼鱼对异亮氨酸的需要量

以初始体重（8．25±0．37）g的草鱼幼鱼为试验对象，分别采用异亮氨酸（isoleucine，Ile）水平为0．77％、1．07％、1．37％、1．67％、1．97％和2．27％6组等氮（粗蛋白35．25％）半纯化日粮对草鱼进行了72d生长试验，研究其日粮异亮氨酸需要量。结果表明：（1）日粮Ile水平为1．67％时，草鱼增重率、特定生长率和蛋白质效率最高，饲料系数最低；鱼体空壳率和肥满度达到最大值，内脏指数最小；草鱼体水分、体脂最低，体蛋白、灰分最高；肌肉水分最低，粗蛋白最高。而各水平之间肌肉粗脂肪无显著差异（P〉0．05）；日粮Ile水平为1．67％时，草鱼肌肉Ile含量和肌肉氨基酸总量最高。（2）随日粮Ile水平增加，肌肉RNA／DNA呈先升后降趋势，Ile 1．67％水平组最高；而肝脏谷氨酸脱氢酶却呈先降后升趋势，Ile 1．67％水平组最低。血氨在Ile 0．77％～1．67％水平组之间处于稳定状态，高于1．67％水平后呈上升趋势。血清白蛋白受日粮Ile水平的影响不显著（P〉0．05）。（3）随日粮Ile水平增加，血清甘油三酯和胆固醇均呈先降后升趋势，且在Ile 1．67％水平组，两项指标均为最低值，显著低于其他水平组（P〈0．05）。根据增重率、特定生长率、饲料系数和蛋白质效率与日粮Ile水平的二次曲线关系，确定草鱼幼鱼日粮（粗蛋白35．25％）Ile适宜需要量范围为1．41％～1．49％（日粮基础）或4．0％～4．23％（日粮蛋白基础）。

组成型过表达ido基因对4-羟基异亮氨酸合成的影响及其发酵培养基的响应面优化

为考察组成型过表达异亮氨酸羟化酶(isoleucine dioxygenase,IDO)基因ido对4-羟基异亮氨酸合成的影响,构建ido组成型表达质粒pXM01-ido及菌株HIL017,其ido转录量及IDO活性较诱导型过表达菌株HIL016显著提升,4-羟基异亮氨酸产量较HIL016提高19.4%。为进一步提高4-羟基异亮氨酸产量,通过Plackett-Burman试验确定HIL017发酵培养基中玉米浆、谷氨酸和FeSO4·7H2O用量为主要影响因素,利用最陡爬坡试验和响应面法确定其最优用量为玉米浆34.1 mL/L、谷氨酸2.98 g/L、FeSO4·7H2O 0.016 7 g/L,此时4-羟基异亮氨酸理论产量为5.57 g/L。验证实验结果表明,最佳条件下4-羟基异亮氨酸产量为5.53 g/L,较优化前提高19.7%。

饲料异亮氨酸水平对卵形鲳鲹消化酶活性和免疫指标的影响

实验旨在研究饲料异亮氨酸(Ile)水平对卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)消化酶活性和免疫指标的影响。以鱼粉、豆粕、花生粕和L-晶体氨基酸为蛋白源,配制含粗蛋白430 g·kg^(-1)的6种等氮饲料,各组分别含有13.2 g·kg^(-1)、15.7 g·kg^(-1)、18.2 g·kg^(-1)、20.7 g·kg^(-1)、23.2 g·kg^(-1)和25.7g·kg^(-1)(以干物质计)异亮氨酸。每组3个重复,每个重复随机放置20尾鱼[初始体质量(6.36±0.03)g],实验时长8周。结果显示,各实验组的肠淀粉酶和胃蛋白酶活性、血清总抗氧化能力(T-AOC)、溶菌酶(LZM)活性、免疫球蛋白M和补体(C3和C4)浓度均随着饲料Ile水平的升高而先上升后下降,这5个指标的较高值出现在18.2 g·kg^(-1)和20.7 g·kg^(-1)组,而较低值则出现在13.2 g·kg^(-1)和25.7 g·kg^(-1)组,上述4组与其他2组差异显著。血清尿素氮和丙二醛(MDA)浓度的变化趋势则与上述7个指标相反,较低值出现在18.2 g·kg^(-1)和20.7 g·kg^(-1)组,且显著低于其他4组。血清超氧化物歧化酶(SOD)活性则随着饲料Ile水平的增加而显著升高,18.2~25.7 g·kg^(-1)这4组SOD活性没有显著性差异。综上所述,饲料Ile水平为18.2~20.7 g·kg^(-1)时,卵形鲳鲹具有较好的消化性能和免疫机能。