薄壳山核桃SSR-PCR体系优化及引物筛选

【目的】为建立薄壳山核桃SSR-PCR的最佳反应体系,筛选薄壳山核桃高多态性SSR引物,为薄壳山核桃构建指纹图谱、亲缘关系分析、品种鉴定等后续的相关研究提供有力工具。【方法】采用单因素试验与L_(16)(4^(5))正交试验设计相结合的方法,以薄壳山核桃DNA作为模板,对影响薄壳山核桃SSR-PCR反应体系中的6个影响因素(DNA、Mg^(2+)、10×PCR Buffer、引物、Taq酶、dNTPs)进行单因素试验,根据单因素试验的结果确定各影响因素的适宜用量范围,再据此设计正交试验。【结果】根据正交试验扩增结果,确立薄壳山核桃的最佳反应体系(10μL)为:Taq酶0.15 U,Mg^(2+)2.0 mmol/L,dNTPs 0.1 mmol/L,引物1.0μmol/L,50 ng模板DNA 1.0μL,10×PCR Buffer 1.0μL,ddH_(2)O5.8μL。5个因素影响薄壳山核桃SSR-PCR反应体系的扩增效果,其影响程度大小依次为Taq酶>引物=DNA>Mg^(2+)>dNTPs。以8种薄壳山核桃DNA为模板,4对薄壳山核桃引物对优化后的薄壳山核桃SSR-PCR反应体系进行验证,均扩增出明亮清晰的条带,证明优化后的反应体系稳定可靠。利用优化后的反应体系在283对核桃及山核桃引物中筛选出高多态性薄壳山核桃引物12对,其多态性位点信息数均高于0.5。【结论】优化后的反应体系及筛选出的12对薄壳山核桃引物可直接用于后续的SSR分子标记试验,为薄壳山核桃亲缘关系鉴定、交配系统分析等研究奠定理论基础。

山豆根ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

以山豆根为试验材料,采用正交试验考察DNA、引物、Mg^(2+)、dNTPs、Taq酶5个因素对ISSR-PCR反应体系的影响,建立并优化山豆根ISSR-PCR反应体系条件。结果表明:山豆根ISSR-PCR反应体系(20μL)最优条件为Mg^(2+)浓度3 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq酶1 U,引物0.5μmol/L,模板DNA 100 ng,运用该体系从100条UBC引物中筛选到10条清晰、多态性好的引物。采用正交试验设计可有效建立山豆根ISSR-PCR反应的最优体系,为山豆根的亲缘关系,种质资源遗传多样性评价及品种鉴定和系统分类等研究提供科学依据。

鸡血藤ISSR体系优化及引物筛选

以鸡血藤的入药部位藤茎为试验材料,采用改良CTAB法进行DNA提取,利用正交试验和单因素试验对ISSR-PCR反应体系进行优化和构建。结果表明,鸡血藤最佳ISSR-PCR反应体系为DNA模板60 ng,Taq酶2.00 U,Mg2+浓度1.75 mmol/L,dNTP浓度0.25 mmol/L,引物浓度0.20 μmol/L,最佳退火温度44.6℃。从100条ISSR引物筛选出20条适合鸡血藤的ISSR引物。

广西壮瑶药瘤果紫玉盘SCoT-PCR反应体系建立及引物筛选

【目的】建立瘤果紫玉盘SCoT-PCR最佳反应体系,并筛选出适宜的SCoT引物,为瘤果紫玉盘种质鉴定分类、亲缘关系分析和遗传多样性分析提供理论参考。【方法】以广西河池、百色、柳州、南宁4份瘤果紫玉盘野生种质为试材,通过单因素试验和正交试验对瘤果紫玉盘SCoT-PCR反应体系的DNA模板用量、引物用量和Mix预混液用量3个因素进行优化,并使用优化后最佳反应体系进行SCoT引物筛选。最后将SCoT-PCR最佳反应体系和筛选出的引物用于瘤果紫玉盘种质的遗传多样性分析。【结果】单因素试验结果显示,DNA模板用量为40~70 ng,引物(10μmoL/L)用量为1.0~1.4μL,Mix预混液用量为9.0~12.0μL范围内扩增效果较好,通过L16(43)正交试验确定瘤果紫玉盘的SCoT-PCR最佳反应体系20.0μL:DNA模板(40 ng/μL)1.0μL,引物(10μmoL/L)1.2μL,Mix预混液10.0μL,7.8μL ddH2O。利用最佳反应体系筛选出26条适用于瘤果紫玉盘的SCoT引物,并确定了各引物最适的退火温度。26条SCoT引物在4份瘤果紫玉盘材料中共扩增出305个基因位点,其中多态性位点204个,多态性比率为66.89%,平均每条引物扩增出11.7个基因位点,有8.7个多态性位点。4份瘤果紫玉盘种质的平均等位基因数(Na)为1.7377,平均有效等位基因数(Ne)为1.5344,Nei’s基因多样性指数(H′)为0.3053,Shannon指数(I)为0.4449。4份瘤果紫玉盘间的遗传相似系数为0.5443~0.6492,遗传距离为0.4320~0.6083,说明4份瘤果紫玉盘种质间存在较大的遗传变异,遗传多样性水平较高。【结论】建立的SCoT-PCR最佳反应体系和筛选出的26条SCoT标记引物扩增效果较好,可用于瘤果紫玉盘种质资源的鉴定分类、亲缘关系分析和遗传多样性分析。

药食同源蔬菜赤苍藤SCoT分子标记体系的优化及引物筛选

笔者以24份不同来源地的野生赤苍藤种质为试验材料,采用L9(33)正交试验对赤苍藤SCoT-PCR反应体系进行优化,并通过优化后的体系进行引物筛选,结果表明,PCR体系中各因素对多态性结果的影响程度排序为DNA模板量>引物用量>2×Taq Master Mix用量。最佳反应体系(20μL)为1 μL DNA模板(50 ng·μL^(-1))、1.2 μL引物(10 μmoL·μL^(-1))、10 μL 2×Taq Master Mix和7.8 μL ddH2O。通过该体系从36条SCoT引物中筛选出14条稳定性好、多态性高的引物,并确定了最佳退火温度。该体系的建立和引物的筛选将为后续开展赤苍藤种质资源收集与保护、遗传多样性研究和分子育种提供参考依据。

玉米新品种中研1603制种技术及纯度鉴定引物筛选

中研1603是由中国农业科学院棉花研究所选育的玉米新品种,在2020年和2022年分别通过陕西省(陕审玉2020032号)和宁夏回族自治区(宁审玉20220023)审定,详细介绍中研1603纯度鉴定引物的筛选和杂交种制备技术。

葡萄SRAP反应体系优化及引物筛选

本试验利用L16(45)正交试验设计探寻葡萄SRAP-PCR反应体系中的关键因子,同时结合单因素试验简单、快捷的特点逐个对PCR反应体系的主要成分进行优化。充分利用两种方法的优点并降低试验工作量取得了较好的效果,建立了适于葡萄的SRAP反应体系。结果表明Mg2+浓度为影响葡萄SRAP-PCR反应的关键因素;优化的20μL SRAP-PCR反应体系中各组分的最适含量为:10×Buffer2.0μL,Mg2+2.5mmol/L,dNTPs0.3mmol/L,引物0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0U,模板DNA1.0ng/μL。利用SRAP反应体系,从100对SRAP引物组合中筛选出扩增稳定,条带清晰,多态性好的引物19对。本研究建立的适于葡萄SRAP-PCR扩增的反应体系,将为葡萄种质遗传多样性评价、基因组分析、指纹图谱构建,分子标记辅助育种和遗传改良研究提供基础。

牡丹SCoT分子标记正交优化及引物筛选

以牡丹基因组DNA为模板,采用L16(45)正交试验设计对影响目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应(SCoT-PCR)的五因素(Taq酶用量、Mg2+浓度、模板DNA用量、dNTPs浓度和引物浓度)进行优化试验,建立了优化的牡丹SCoT-PCR反应体系:Mg2+2.50 mmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.60μmol/L、Taq DNA聚合酶0.50 U、模板DNA 1.00 ng/μL,1×PCR-Buffer,总体积20.00μL。比较各因素对扩增反应的结果,其中以Mg2+浓度的影响最大,DNA模板用量的影响最小。运用牡丹17个品种验证了该体系稳定可靠,并从36个SCoT引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的24个引物。这一体系的建立及多态性引物的筛选为今后利用SCoT标记技术对牡丹进行相关研究提供了科学依据。

正交设计优化假俭草SRAP-PCR反应体系及引物筛选

以假俭草叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶4种因素3个水平,对假俭草SRAP反应体系进行研究,并比较了不同浓度模板DNA对扩增效果的影响,建立了假俭草的SRAP最佳反应体系。结果表明,假俭草SRAP-PCR最佳反应体系为:2μL 10×PCR buffer、60 ng模板DNA、Mg2+1.50 mmol/L、dNTP 260μmol/L、引物0.25μmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U,总体积为20μL。各因素对扩增反应结果均有不同影响,其中以Mg2+浓度影响最大,Taq DNA聚合酶的影响最小。运用该体系对4份假俭草种源进行验证,证明该体系稳定可靠,并从45个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的26个引物组合。这一体系的建立及多态性引物组合的筛选为今后利用SRAP标记技术进行假俭草分子遗传学研究提供了科学依据。

葛根SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

【目的】优化葛根SCoT-PCR反应体系,筛选适用于葛根的SCoT引物,为利用SCoT分子标记进行葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析及分子标记辅助育种提供技术支持。【方法】采用正交设计对SCoT-PCR反应体系中的DNA模板量、dNTPs浓度、Mg^(2+)浓度、Taq DNA聚合酶量和引物浓度5个因素进行优化,利用最佳SCoT-PCR反应体系筛选出适用于葛根的SCoT引物,并对该体系进行验证。【结果】最佳葛根SCoT-PCR反应体系20.00μL:DNA模板50.00 ng,dNTPs 0.25 mmol/L,Mg^(2+)1.50 mmol/L,引物0.80μmol/L,Taq DNA聚合酶0.50 U。利用该体系从36条SCoT引物中筛选出35条可从葛根中扩增出清晰条带的引物。使用3条引物对18个葛根材料进行PCR扩增,PCR产物表现出良好的重复性、稳定性和丰富的多态性。【结论】建立的最佳葛根SCoT-PCR反应体系和筛选获得的35条SCoT引物可适用于葛根种质资种鉴定、遗传多样性分析、相关分子标记开发等研究。

鸭茅SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

应用L16（44）正交设计对影响鸭茅SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适于鸭茅的SSR反应体系和扩增程序。在15μL体系中各反应的最适合含量为：50ng模板DNA,240μmol/LdNTP,0.4μmol/LSSR引物,1.0UTaqDNA聚合酶,1.5μL10×PCRBuffer,2.5mmol/LMgCl2。PCR适宜扩增程序为：94℃预变性4min,94℃变性30s,52℃复性30s,72℃延伸1min,共35个循环,72℃延伸10min,4℃保存。并对引物最适合退火温度进行优化,最终确定引物退火温度为48～52℃。同时选用100对鸭茅引物对4份材料进行扩增,筛选出条带清晰,多态性好的引物30对。用于鸭茅SSR标记的进一步研究。

苦楝SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

[目的]借鉴以往楝属文献报道的SSR引物,筛选高度多态性、稳定性高、重复性好的苦楝SSR引物,为苦楝遗传图谱构建、QTL定位和分子标记辅助选择育种等研究领域应用奠定基础。[方法]本研究采用单因素法和正交试验设计进行SSR-PCR反应体系优化,并利用该体系以8个不同种源的苦楝基因组DNA为模板,从135对候选SSR引物中进行引物筛选。[结果]苦楝SSR-PCR最优反应体系为:1.0μL 50 ng·μL^(-1)模板DNA,1.2μL 100μmol·L^(-1)引物,1.0μL 10 mmol·L^(-1)d NTPs,0.8μL 25 mmol·L^(-1)Mg^(2+),0.15μL 5 U·μL^(-1)Taq酶,1.5μL 10×Buffer,补dd H2O至15μL;最终筛选出15对具有高度多态性、稳定性高、重复性好的SSR引物。[结论]本研究成功优化了苦楝SSR-PCR反应体系,并成功筛选出15对适用于苦楝的SSR引物。

蓝莓SRAP—PCR反应体系的建立优化及引物筛选

为进一步利用分子标记技术进行蓝莓品种鉴定及种质资源遗传多样性的分析,拟建立蓝莓新型SRAP标记(相关序列扩增多态性)的优化PCR体系并进行引物组合的筛选。运用改良CTAB法所提取的蓝莓幼嫩叶片的DNA,采用单因子试验,分析了模板DNA浓度、引物浓度、退火温度等影响SRAP-PCR的主要参数,建立了适合蓝莓SRAP-PCR的优化体系,20μL的PCR反应体系:模板DNA浓度120 ng、引物浓度0.40μmol/L、2×TaqPCR Master Mix 10μL,剩余体积用去离子水补足;最佳PCR扩增程序的退火温度为50℃。并从80对SRAP引物组合中筛选出条带清晰且多态性丰富的15对引物组合。

风信子ISSR-PCR体系的优化及引物筛选

以风信子基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对影响PCR扩增体系中Mg2+浓度、dNTPs、模板DNA及引物浓度、Taq酶的用量5个因素进行研究,建立了风信子ISSR-PCR扩增最佳反应体系,即:20μL反应体系中分别加入2μL10×Buffer、1.4μL Mg2+(25mmol/L)、1.5μL dNTPs(2.5mmol/L)、1.5μL引物(10pmol/μL),0.2μLTaq酶(5U/μL),1.2μL模板(30ng/μL),ddH2O补足体积。并以此体系对110条引物进行筛选,最终获得了多态性高,重复性好的引物12条。

猕猴桃EST-SSR引物筛选及通用性分析

应用SSRHunter软件对NCBI公共数据库中的猕猴桃EST序列进行筛查,利用Primer 5.0软件设计引物并进行筛选,同时对其在部分柑橘类植物的通用性进行分析。以漓江猕猴桃DNA为模板,对所设计的97对EST-SSR引物进行筛选,结果表明其中77对引物能扩增出清晰条带,有效扩增率为79.38%。随机选取20对引物对10份猕猴桃资源进行检测,结果发现有17对引物对所有材料都有扩增产物并呈现出多态性,多态性扩增率为85%。随机应用20对有效EST-SSR引物对兴津、金柑、枳壳、椪柑、酸柚、甜橙、胡柚、尾张、宫川等柑橘类植物基因组DNA进行扩增,结果表明,其中有11对引物在供试材料中有扩增产物,占引物总数的55%;有8对引物的扩增产物具有多态性,扩增率为72.7%。据此,基于猕猴桃EST序列而筛选的SSR引物在柑橘类植物中具有一定的通用性。

红椿SSR-PCR体系建立和多态性引物筛选

[目的]本研究旨在建立红椿SSR-PCR最佳反应体系,并筛选适于红椿SSR分析的高多态性引物。[方法]通过L16(45)正交试验设计,确立红椿SSR-PCR最佳反应体系;利用优化后的体系对来自楝科植物的135对SSR引物,在6个不同的红椿居群中进行扩增,筛出能有效扩增的引物并进一步筛选出适于红椿的高多态性引物。[结果](1)10μL基于荧光d UTP的SSR-PCR体系中包含:10×buffer 1.0μL,Taq酶(5 U·μL-1)0.1μL,Mg Cl2(25mmol·L-1)0.8μL,d NTP(200 mmol·L-1)0.025μL,荧光d UTP(1 nmol·μL-1)0.01μL,引物(10 mmol·L-1)0.8μL,DNA模板45 ng剩余用dd H2O补足;(2)筛选出29对能有效扩增的引物,复选后获得了12对适于红椿SSR分析的高多态性引物。[结论]建立了SSR-PCR最佳反应体系并筛选出高多态性引物,为红椿的分子标记等遗传学研究提供了基础。

8种柱花草属牧草SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

柱花草(Stylosanthes)是优良的豆科牧草,叶片中含有大量的多糖多酚,本研究利用改良CTAB法抽提柱花草叶片中总DNA。通过正交试验设计L16(45),确立了柱花草SSR-PCR最佳反应体系:20μL体系中1μL 50ng·μL-1模板DNA,1.6μL 5μmol·L-1引物,1.6μL 10mol·L-1dNTPs,1.2μL 25mol·L-1 Mg2+,0.3μL 5U·μL-1 Taq聚合酶,2μL 10×PCR Buffer(Mg2+free),剩余用ddH2O补足。扩增反应程序为94℃变性40s,Tm(不同退火温度)退火时间40s,72℃延伸45s,循环数35个。利用优化体系对来自7种柱花草的123对SSR引物在8个不同种柱花草中进行转移,共筛选出44对引物在8种柱花草中都能有效扩增,并从中筛选出26对在8个不同种柱花草中富含多态性引物,为今后利用SSR标记对柱花草属的指纹图谱构建、遗传多样性分析、分子育种和品种鉴定与保护等工作提供重要依据。

正交设计优化辣椒SRAP-PCR反应体系及引物筛选

以辣椒基因组DNA为模板,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP反应体系中的5种关键因素(TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA)进行优化,结果表明,辣椒SRAP-PCR最佳反应体系为:TaqDNA聚合酶0.75 U、Mg2+0.6 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.8μmol/L、模板DNA 50 ng,总体积为10μL。运用该体系对辣椒3份种质材料进行验证,证明该体系稳定可靠,并从198个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的35个引物组合。该体系的建立与多态性引物组合的筛选为SRAP标记技术在辣椒分子遗传学中的应用提供科学依据。

芦笋SRAP反应体系优化及引物筛选

本研究以芦笋基因组总DNA为模板,通过对芦笋SRAP反应体系的重要参数进行优化,建立了一套适用于芦笋的SRAP反应体系:25μL的反应体系中,模板DNA量80ng、Mg2+浓度3.0mmol/L、上下游引物各0.2μmol/L、dNTPs0.3mmol/L、Taq DNA聚合酶1U以及1×Buffer。扩增程序为:94℃预变性3min;94℃30s、35℃30s、72℃1.5min,5个循环;然后退火温度提高到50℃,35个循环;最后72℃延伸10min。比较琼脂糖凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SRAP扩增产物的多态性,结果发现:6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物比琼脂糖的效果好。利用该优化体系筛选引物,从256个SRAP引物组合中筛选出239个,它们具有扩增条带清晰、丰富、重复性好的优点,证明了此优化体系稳定可靠。

东方百合SRAP体系优化及引物筛选

以东方百合商品种‘索蚌’(‘Sorbonne’)和‘康斯坦撒’(‘Constantsa’)及其F1代杂交群体为实验材料,从100对SRAP引物中筛选出59对扩增产物丰富、具有较高多态性的引物,同时对PCR反应体系进行了优化。采用正交设计,对Mg2+、dNTPs、Taq聚合酶及引物浓度进行4因素4水平优化,并在此基础上对Mg2+、引物浓度和退火温度进行了单因素优化。结果表明,东方百合SRAP的最佳体系为:1×Buffer,Mg2+浓度2.7 mmol/L,dNTPs浓度0.25 mmol/L,引物浓度0.8μmol/L,Taq聚合酶1.5μmol/min,模板DNA 60～100 ng。SRAP两步反应最佳退火温度为第1步35℃,第2步退火59.3℃。最后用‘索蚌’、‘康斯坦撒’和部分F1植株对优化体系进行稳定性检测,发现所筛选出的59对引物在优化的体系下均有稳定的扩增产物。