花生冠腐病抗病性快速鉴定方法的建立及应用

【目的】建立一种花生冠腐病抗病性快速鉴定方法,为抗冠腐病花生品种筛选、抗病育种提供参考。【方法】以萌发期花生种作为接种材料,在无菌培养皿中进行接种,设置冠腐病孢子悬浮液不同接种浓度(6×10^(5)个/mL、8×10^(5)个/mL、1×10^(6)个/mL、2×10^(6)个/mL、4×10^(6)个/mL)及时间(3 d、4 d、5 d、6 d、7 d)试验,筛选最优接种条件,对徐花甜30、驻花18号、周科花18等104个花生品种(系)进行冠腐病抗病性鉴定,验证其有效性并进行抗病种质资源筛选。【结果】当冠腐病孢子悬浮液接种浓度为2×10^(6)个/mL、培养时间为5 d时,各品种(系)间感染情况差异明显,能有效鉴定不同品种(系)的抗性差异。利用该方法对104个花生品种(系)进行冠腐病抗病性鉴定,能有效区分不同品种(系)的抗性差异,并筛选出12个抗病品种(系)、40个中抗品种(系)、38个感病品种(系)和14个高感品种(系)。【结论】在萌发期建立的花生冠腐病抗病性快速鉴定方法能够快速有效鉴定不同花生品种(系)对冠腐病的抗性水平。

基于种特异性COI引物(SS-COI)的桉树枝瘿姬小蜂A、B隐种快速鉴定技术

隐种A和隐种B是桉树枝瘿姬小蜂Leptocybe invasa两种重要的全球入侵隐种,对多国林业生产造成了严重危害。由于桉树枝瘿姬小蜂体型微小,且无法从形态上区分隐种类型,给该害虫的防治造成困难。本研究基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I(mtDNA COI)基因序列的种特异性(species-specific COI,SS-COI)PCR方法,研究桉树枝瘿姬小蜂隐种快速分子检测技术。基于隐种A、B的COI序列分别设计特异性SS-COI引物各1对(AF/AR和BF/BR)。使用这两对引物扩增同一桉树枝瘿姬小蜂样品DNA,即可有效进行隐种鉴定,同时两对引物也能互相验证鉴定结果。引物鉴定灵敏性检测结果显示,AF/AR与BF/BR均具有较高的鉴定灵敏性,其对DNA的有效鉴定浓度阈值分别为11.42 pg/μL和28.32 pg/μL。本研究开发的桉树枝瘿姬小蜂隐种A、B的快速鉴定方法解决了桉树枝瘿姬小蜂入侵地区隐种鉴别的难题,极大缩短鉴定时间、降低鉴定费用,为进一步探究桉树枝瘿姬小蜂隐种A、B的生物学差异以及它们对不同抗性品种桉树的适应能力提供技术参考。

微生物培养体系预处理在MALDI-TOF MS快速鉴定血培养阳性病原菌的应用价值

目的分析微生物培养仪(HB&L)微生物培养体系预处理在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)快速鉴定血培养阳性样本病原菌的临床应用价值。方法收集2022年1月至2022年12月安阳市人民医院实验室常规方法鉴定的120份血培养报警后单一细菌感染的阳性样本,所有样本均接受HB&L微生物培养体系预处理、分离胶促凝管法预处理,将传统方法的鉴定结果作为“金标准”对照,运用MALDI-TOF MS鉴定。对比HB&L微生物培养体系预处理、分离胶促凝管法预处理下MALDI-TOF MS快速鉴定的鉴定率;另外对比HB&L微生物培养体系预处理、分离胶促凝管法在不同分值下MALDI-TOF MS样本细菌菌属快速鉴定结果。结果HB&L微生物培养体系预处理下MALDI-TOF MS快速鉴定例数为116例,鉴定率为96.67%;分离胶促凝管法预处理下MALDI-TOF MS快速鉴定例数为92例,鉴定率为76.67%,两种预处理方法鉴定率对比差异有统计学意义(P<0.05);在3.000~2.300分值下HB&L微生物培养体系MALDI-TOF MS样本细菌菌属快速鉴定率均高于分离胶促凝管法,差异有统计学意义(P<0.05);在2.299~2.000、1.999~1.700、<1.700分值下两种预处理方法菌属鉴定率对比差异无统计学意义(P>0.05)。结论HB&L微生物培养体系是MALDI-TOF MS快速鉴定血培养阳性样本病原菌优质的预处理方法,可大幅提升鉴定率,值得应用。

核酸斑点杂交技术快速鉴定转基因大豆品系

为了建立转基因大豆品系高通量检测方法,本研究以转基因大豆DAS-68416-4、DAS-44406-6、DAS-81419、DP305423作为试验对象,根据品系特异的宿主与插入片断间连接区域的基因序列作为检测靶标,设计特异性引物。以转基因标准品为材料,提取DNA作为模板进行定性PCR扩增,尼龙膜点样,生物素探针制备,杂交与显色,并对探针浓度、杂交温度与时间与显色时长进行优化,利用优化后的反应条件对转基因大豆DAS-68416-4、DAS-44406-6、DAS-81419、DP305423及空白对照样品进行检测,验证体系的特异性。将4种转基因大豆的DNA进行10倍系列稀释,利用优化后的反应条件测定灵敏度。对实验室收集的7个品系的转基因大豆标准品和8个能力验证样品进行适用性检测分析,并采用双盲验证法对17份盲样进行核酸斑点杂交测试分析,进一步验证体系的可靠性。结果表明,以转基因大豆DAS-68416-4、DAS-44406-6、DAS-81419、DP305423为模版的扩增产物均有且只有一条清晰明亮的条带,大小均与理论相符,空白对照与内参照基因结果正常。4种转基因大豆特异性探针除对应样品有显色反应,对其他3种样品均未显色,具有方法特异性。样品DAS-68416-4、DAS-81419、DP305423最低检出限为20 pg·μL^(-1),样品DAS-44406-6最低检出限为2 pg·μL^(-1),具有较高的灵敏度。对7个标准品、8个能力验证样品和17份盲样的测试结果与SN/T 1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检测方法》中的结果一致,可用于日常样品检测。本研究建立的定性PCR结合的核酸斑点杂交方法能对4种转基因大豆进行快速准确鉴定,对有序推进生物育种产业化应用,严查非法转基因种子市场流通和田间种植,保障粮食安全具有重要意义。

叶绿素a和叶绿素b的快速鉴定

利用微型质谱仪技术,开发了叶绿素a和叶绿素b的快速检测方法,在短时间内获得物质组分信息。通过微型质谱仪的实际操作,为学习内容引入分析化学、样品前处理以及色谱的概念。其方法高效快捷,更加精确地说明各色素分离条带中物质的性质。同时,该技术方法在研究中的引入,不仅拓展学生的知识眼界和探究活动,学生还可以更加深入地了解科学研究的过程和方法,提高科学素养,为将来的学习和发展打下坚实的基础。

MALDI-TOF MS在血流感染快速鉴定病原菌中的应用

目的探讨基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)结合短时培养在快速鉴定血流感染病原菌中的应用。方法对南京医科大学附属淮安第一医院微生物室2020年11月至2021年12月血培养报告阳性的标本进行革兰染色分类,并采用4h和6h短时培养法及MALDI-TOF MS技术快速鉴定感染病原菌并实时报送病区单元。结果4h短时培养革兰阴性菌共351株,339株(96.6%)细菌鉴定到种属,与24h鉴定结果相同,11株无鉴定结果,1株鉴定错误;6h短时培养革兰阳性菌共216株,212株(98.1%)鉴定到种属,与24h鉴定结果相同,3株无鉴定结果,1株鉴定错误。跟踪321株革兰阴性菌的临床反馈,287例(89.4%)给予临床关注,89例(27.7%)进行药物调整,238例(74.1%)临床疗效良好;跟踪183株革兰阳性菌的临床反馈,其中150例(82.0%)给予临床关注,49例(26.8%)进行药物调整,131例(71.6%)临床疗效良好。结论MALDI-TOF MS技术结合短时培养方法可有效提高血流感染病原菌鉴定准确率,改善血流感染患者抗菌药物治疗时机。

基于干种子DNA的洋葱杂交种纯度分子标记快速鉴定

为了寻找一种从洋葱种子中快速提取高质量DNA的方法,并能满足大量准确鉴定洋葱杂交种纯度的要求,本研究首先对全式金PlantZol试剂盒、天根快捷型植物基因组DNA提取系统、TPS法和CTAB法提取的洋葱种子DNA质量进行比较,筛选出最佳提取方法,并对不同发芽天数的种子及提取有效DNA的种子数量进行优化筛选,然后利用SCAR分子标记对洋葱杂交种的纯度进行鉴定,进一步验证洋葱种子DNA的提取质量。结果表明,天根快捷型植物基因组DNA提取系统未能成功得到洋葱干种子基因组总DNA;CTAB法提取的基因组总DNA带型整齐一致、单一明亮,条带无拖尾和降解现象,也没有明显的RNA和蛋白污染;洋葱干种子以1粒和发芽3 d提取的DNA更加完整,纯度更高。以CTAB法提取的1粒洋葱干种子基因组总DNA为模板,对杂交种Ms位点的基因型进行SCAR标记鉴定,PCR扩增条带清晰明亮,根据条带的迁移位置可以清楚区分洋葱不同细胞核基因型之间的差异。综上,本研究确定了CTAB法为洋葱干种子基因组总DNA提取的最佳方法,1粒洋葱干种子获得的有效DNA完全可以满足杂交种分子标记鉴定的要求,实现洋葱杂交种纯度的早期鉴定。

中药材和中药饮片快速鉴定技术研究进展

中药是中医治疗疾病的物质基础,其质量问题关乎临床用药的疗效和中医药事业的发展。中药材和中药饮片作为中药产业的重要支柱,其质量问题尤为重要。尽管国家在监管政策层面采取了多种措施应对其造假、掺伪现象,也取得了一定成效,但其整体质量现状仍不容乐观。科技水平的快速发展为保障中药质量安全提供了更多样的选择。作为科技创新发展的重要产物,快速检测技术是各领域高质量发展的重要助推剂,中药领域也不例外。因此,该文对现阶段中药材和中药饮片常用的快速鉴定技术进行了综述,探讨了现有的快速鉴定技术在实际操作中的适用性和时效性,初步总结了快速检测技术的若干共性特点及实现策略,并对其未来的发展方向提出设想,以为中药快速质量评价的深入研究提供参考。

木毒蛾蛹性别的快速鉴定

木毒蛾是我国东南沿海木麻黄防护林最主要的食叶害虫。通过对木毒蛾雌、雄蛹(老熟)外部形态特征进行观测,发现其主要差异如下:雌蛹平均体长(30.36±2.30)mm,平均质量(1.73±0.35)g,平均体宽(10.57±0.78)mm,均大于雄蛹[平均体长(23.51±1.65)mm,平均质量(0.74±0.14)g,平均体宽(8.46±0.60)mm];雌蛹头部腹面较为平整,雄蛹更为立体;雌蛹的中足明显较雄蛹宽且长;雌蛹的生殖孔与产卵孔均位于第8~9腹节连接处向第9腹节延伸的纵裂缝上,而雄蛹的生殖孔位于第9腹节中间处;雌蛹的排泄孔距生殖孔较远,而雄蛹较为接近。综合以上外部特征判断木毒蛾蛹性别,准确率可达100%。这可为木毒蛾的野外采样、林间性比研究及其监测预警提供一定依据。

多重荧光定量PCR快速鉴定转基因玉米品系

采用多重实时荧光PCR技术的高通量特征,对转基因玉米MIR604、GA21、DAS-40278-9和98140的特异性靶标序列设计TaqMan-MGB荧光探针,通过退火温度和引物探针浓度梯度优化建立了四重实时荧光PCR检测方法,经特异性,重复性和灵敏性等方法学验证确认了方法的可靠性。MIR604、GA21、DAS-40278-9、981404个特异性基因的标准曲线回归方程分别为y=-3.263 x+36.632,y=-3.422 x+36.384,y=-3.294 x+38.978和y=-3.278 x+37.514;Ct值变化范围分别在23.556~37.524、22.893~37.412、25.304~39.110和24.501~37.618之间;标准偏差分别在0.078~0.476,0.085~0.463,0.120~0.487和0.148~0.353之间;相关系数R 2分别为0.997,0.996,0.995和0.993;检出限可达10个拷贝,扩增效率满足欧盟等国际要求。

多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162

为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通,建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法,通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针,摸索和优化多重荧光PCR体系和参数,开发建立多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162。结果表明,转基因玉米MIR162品系标准品和平行样品中内标基因和品系特异性基因均出现明显扩增曲线,其他转基因玉米品系标准品仅内标基因有扩增曲线,空白对照无扩增曲线,说明该TaqMan-MGB探针对转基因玉米MIR162品系具有扩增特异性。该方法可作为鉴定筛查转基因玉米MIR162品系及其转化体成分的有效方法,用于规范管理转基因产品在市场上的流通。

PCR法快速鉴定小儿咳喘灵颗粒中大肠埃希菌

目的建立快速鉴定药品中大肠埃希氏菌的聚合酶链反应(PCR)法。方法以小儿咳喘灵颗粒为试验样本,选择22种(共24株)实验室常见菌株,提取样品增菌液中菌株DNA,采用PCR法对目标基因uidA、ipaH、invE进行检测,分析方法的可行性和可靠性,并通过与传统生化鉴定方法比较以考察其特异性。结果PCR法通过3种基因检测结果的不同组合,能快速准确筛查出供试液中大肠埃希菌,特别是可有效区分大肠埃希菌及与其同源性较高的志贺菌。结论与传统微生物鉴定方法相比,PCR法在特异性和鉴定效率方面均有较大优势,可应用于采用直接接种法的药品微生物限度大肠埃希菌的快速鉴定。且单一基因检测无法区分时,可加入多种基因,一次检测即可获得满意效果。

苏北地区凡纳滨对虾3种主要病毒的分离及快速鉴定

从连云港和盐城等地收集了来自不同对虾养殖池塘的587个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)样本,采用基因芯片快速检测技术对样本白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)和虾血虹彩病毒(shrimp henocyte iridescent virus,SHIV)等3种病原体进行分离与快速鉴定。共检测出18个阳性样本,其中13个样本WSSV呈阳性,4个样本IHHNV呈阳性,1个样本SHIV呈阳性;阳性样本占样本总数的3.07%,且阳性样本中WSSV又占了阳性样本总数的72.22%。对这些病原的快速鉴定,可为病害诊断、预警预报、科学防控等提供依据,从而减少暴发性病毒病给对虾养殖带来的经济损失。

MALDI-TOF MS快速鉴定联合直接药敏试验在尿路感染诊断中的应用评估

目的评估基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)快速鉴定联合直接药敏试验在尿路感染(urinary tract infection,UTI)诊断中的临床应用价值。方法收集2022年5月至12月首都医科大学附属世纪坛医院清洁中段尿培养样本共2610份。全部通过MUS9600全自动尿液分析系统筛选后,经差速离心浓缩纯化后使用MALDI-TOF MS直接鉴定,使用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定和药敏系统,K-B法及ATB FUNGUS3进行直接药敏试验,并根据美国临床实验室标准化研究所(CLSI)发布的药敏试验标准进行结果判读。将其结果与清洁中段尿培养鉴定药敏结果进行比较。结果2610例清洁中段尿培养样本中经常规鉴定后共有阳性483例(483/2610,18.51%),阴性或疑似污染2127例(2127/2610,81.49%)。与MUS9600计数结果相比,阳性样本符合率为97.92%(472/483):其中杆菌97.90%(280/286),球菌98.48%(130/132),真菌92.31%(60/65)。阴性及污染样符合率为98.92%(2104/2127)。在这483个样本中,质谱快速鉴定符合率为90.48%(437/483),其中,革兰氏阴性菌92.86%(260/280),革兰氏阳性菌89.13%(123/138),真菌83.10%(54/65)。对部分阳性样本进行了直接药敏试验。革兰阴性杆菌数据显示,直接药敏试验与传统药敏试验的符合率为94.42%(5552/5880),微小错误率、严重错误率和非常严重错误率分别为4.42%(260/5880)、0.95%(56/5880)和0.20%(12/5880)。革兰氏阳性球菌数据显示,直接药敏试验与传常规药敏试验的符合率为91.91%(1340/1458),微小错误率、严重错误率和非常严重错误率分别为5.69%(83/1458)、1.65%(24/1458)和0.75%(11/1458)。假丝酵母菌药敏数据显示,直接药敏试验与传统药敏试验的符合率为77.69%(101/130),微小错误率、严重错误率和非常严重错误率分别为16.15%(21/130)、4.62%(6/130)和1.54%(1/130)。结论我们的发现表明,以MUS9600筛选,MALDI-TOF MS直接鉴定和Vitek 2 Compact、K-B法及ATB FUNGUS3直接药敏试验的组合为清洁中段尿培养提供了较直接、快速和可靠的鉴定和药敏结果,在尿路感染的早期诊断和合理治疗中具有显著的临床价值。

牛乳源致病性大肠杆菌分离鉴定、耐药性分析及快速鉴定方法的建立

为了解福建省南坪地区某规模化奶牛场乳源致病性大肠杆菌的耐药性,本研究采用K-B纸片扩散法药敏试验分析了牛乳源大肠杆菌的耐药性,并针对大肠杆菌PhoA基因设计特异性扩增引物,通过特异性和灵敏检测,建立牛乳源致病性大肠杆菌的快速鉴定方法。结果显示,75份隐性乳房炎牛乳样本中,共分离出9株致病性大肠杆菌,分离率为12%;所有菌株对β-内酰胺类、四环素类和糖肽类共6种抗菌药物具有较强的耐药性,对氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物高度敏感;PhoA基因特异性引物能准确鉴定出致病性大肠杆菌,最低检定DNA浓度为0.5ng/μL。综上,本研究建议使用庆大霉素和环丙沙星对该场奶牛进行隐性乳房炎治疗,同时建立了牛乳源致病性大肠杆菌的快速鉴定方法。

生态环保降解材料快速鉴定方法研究

传统可降解材料鉴定技术如红外光谱、拉曼光谱、堆肥降解等,虽然在一定程度上可实现对材料的鉴定,但由于技术复杂、设备昂贵、降解时间长等原因,难以满足政府监管的需求。因此,寻求一种高效快速的鉴定技术至关重要。本研究以可降解塑料购物袋为研究对象,将热裂解技术与气相色谱-质谱技术(Pyr-GC-MS)相结合,构建热裂解-气质联用方法,基于GC-MS技术对降解产物进行分析,从而实现对材料的快速鉴定。

我国南方常见的6种寡毛实蝇PCR-RFLP快速鉴定研究

应用PCR-RFLP技术,对我国南方发生和诱捕到的6种寡毛实蝇开展了快速鉴定方法研究,结果表明,设计出的2组引物对6种供试实蝇线粒体DNA(mtDNA)的PCR扩增片断大小分别约为350bp和450bp。用限制性内切酶MSEI和DRAI对PCR扩增产物进行酶切,得到的酶切位点可将供试的6种实蝇区分开来。该方法不受供试实蝇食物源的影响,对各种虫态(卵、幼虫、蛹)和不同性别的成虫均适用,可用于实蝇的快速鉴定。

广东地区环境水源和临床标本嗜肺军团菌培养与基因快速鉴定

目的建立嗜肺军团菌培养与基因快速鉴定方法,探讨广东地区环境水源和非典型肺炎患者嗜肺军团菌感染状况。方法对广东地区采集的57份中央空调冷凝塔水、30份湖泊水和53份临床标本,用本室改良BCYE-α培养基作培养和PCR试验。结果57份中央空调冷凝塔水培养检出嗜肺军团菌20株(35.1%),PCR检测LP-DNA阳性38份(66.7%);30份湖泊水细菌培养均阴性,PCR阳性4份(13.3%);53例非典型肺炎患者支气管洗液和痰液细菌培养均阴性,PCR阳性5例(9.4%);本实验设计的PCR扩增引物,只和标准嗜肺军团菌和本地分离株产生反应;不与其他病原菌扩增,而显示其良好特异性;本PCR敏感性可检出检体中0.6个细菌DNA含量。结论广东地区环境水源中普遍存在嗜肺军团菌,是引起非典型肺炎的重要病源之一。

利用SSR标记快速鉴定玉米杂交种农大108和豫玉27的种子纯度

本文利用 SSR标记技术分别筛选出玉米杂交种农大 10 8和豫玉 2 7的特异性引物 ,结合单籽粒 DNA快速提取方法 ,建立了两个品种的种子纯度鉴定试剂盒。实验表明 ,应用此试剂盒可快速、有效地鉴定两个杂交种的种子纯度。