SR9009联合吲哚丙酸通过核因子κB信号通路减轻C2C12成肌细胞的炎症反应

背景:钟基因Rev-erbα参与调节炎症,但激活Rev-erbα会增加心脑血管疾病风险。为降低相关风险,探索Rev-erbα激动剂SR9009联合其他药物来减轻骨骼肌成肌细胞炎症,奠定治疗炎症相关性骨骼肌萎缩的理论基础。目的:探讨脂多糖刺激C2C12成肌细胞时吲哚丙酸、SR9009与核因子κB信号通路的关系。方法:①1μg/mL脂多糖刺激C2C12成肌细胞,RNA转录组测序结合KEGG通路富集分析信号通路。②CCK-8法检测C2C12成肌细胞活性,筛选吲哚丙酸的最佳给药浓度;然后将细胞分为空白对照组、脂多糖(1μg/mL)组、SR9009(10μmol/L)+脂多糖组、吲哚丙酸(80μmol/L)+脂多糖组、吲哚丙酸+SR9009+脂多糖组,ELISA检测细胞上清液中白细胞介素6水平,RT-qPCR检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、Toll样受体4、CD14 mRNA表达,Western blot检测NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达。③siRNA敲减Rev-erbα,RT-qPCR评估敲减效率,检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA表达。结果与结论:①与空白对照组比较,脂多糖时间依赖性抑制成肌细胞融合形成肌管,白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA表达水平升高,细胞上清液中白细胞介素6水平显著升高;KEGG通路分析支持脂多糖刺激激活核因子κB信号通路。②吲哚丙酸浓度>80μmol/L时抑制C2C12成肌细胞活性;吲哚丙酸和SR9009通过抑制核因子κB信号通路发挥抗炎作用,降低白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、Toll样受体4、CD14 mRNA表达水平,p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达比值低于脂多糖组。SR9009联合吲哚丙酸显著降低脂多糖诱导的炎症,Toll样受体4、CD14、白细胞介素6和肿瘤坏死因子αmRNA表达水平进一步下调,p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达比值显著低于吲哚丙酸+脂多糖组和SR9009+脂多糖组。③Rev-erbα随脂多糖刺激时间依赖性升高;siRNA敲减Rev-erbα效率达58%以上,成功敲减Rev-erbα后添加脂多糖,白细胞介素6和肿瘤坏死因子αmRNA表达较脂多糖组显著上调。④结果说明,Rev-erbα可以作为调节炎症反应的靶点,SR9009靶向激活Rev-erbα联合吲哚丙酸能抑制核因子κB信号通路显著减轻C2C12成肌细胞的炎症反应,联合抗炎效果优于单独干预。

叶酸通过JNK/p38 MAPK信号通路调节小鼠C2C12成肌细胞分化

目的:观察叶酸(folic acid,FA)对小鼠C2C12成肌细胞增殖和分化的影响并探讨其作用机制。方法:(1)在小鼠C2C12成肌细胞增殖阶段,采用不同浓度(0、2.5、5、10和20μmol/L)的FA处理C2C12细胞,显微镜下观察各组细胞的状态,MTT法检测细胞活力,EdU法检测细胞增殖情况。(2)在小鼠C2C12成肌细胞分化阶段,将细胞分为对照(control,Ctrl)组(0μmol/L FA)和FA组(10μmol/L FA),于分化的第2天和第4天,采用免疫荧光染色和Western blot检测成肌细胞分化相关蛋白成肌细胞决定蛋白1(myoblast determination protein 1,MyoD)、成肌蛋白(myogenin,MyoG)和肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的表达水平,并统计各组细胞肌管形成情况。(3)在小鼠C2C12成肌细胞分化第4天时,加入FA处理0、1、3和6 h,采用Western blot检测各时点c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,p-JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK)蛋白水平。(4)将分化4 d的小鼠C2C12成肌细胞分为Ctrl组、FA组、SP600125(JNK特异性抑制剂)组、SB2035805(p38 MAPK特异性抑制剂)组、FA+SP600125组和FA+SB203580组。C2C12成肌细胞先接受10μmol/L的SP600125或SB203580处理1 h,再经10μmol/L的FA处理24 h,FA组经10μmol/L FA处理24 h,Ctrl组不作处理。采用Western blot检测p-JNK、JNK、p-p38 MAPK、p38 MAPK和MyHC蛋白水平。结果:(1)与0μmol/L FA组相比,其余各浓度组的细胞数量明显增多,细胞活力显著提高(P<0.05),EdU阳性细胞率均显著增加(P<0.05)。(2)与Ctrl组相比,FA组MyoD、MyoG和MyHC的表达水平均显著提高(P<0.05),肌管融合指数显著增加(P<0.05或P<0.01)。(3)与0 h组相比,FA处理1、3和6 h后p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值均显著升高(P<0.05或P<0.01),且随着处理时间的延长,p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值呈现逐渐升高的趋势。(4)与Ctrl组相比,FA组p-JNK、p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著升高(P<0.01);与FA组相比,FA+SP600125组p-JNK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05),FA+SB203580组p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:FA可以通过激活JNK/p38 MAPK信号通路促进小鼠C2C12成肌细胞分化。

小麦肽对小鼠成肌细胞C2C12凋亡的影响及机制研究

目的:采用小鼠成肌细胞C2C12探究小麦肽对其增殖和凋亡的影响,并探明可能的作用机制。方法:CCK-8法检测小麦肽组C2C12和对照组C2C12的增殖和凋亡指数,采用高通量转录组测序进行差异表达分析,通过STRING分析构建差异基因的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络,经Cytoscape可视化,探究C2C12中受小麦肽影响的潜在靶标基因及其功能。结果:5mg/mL小麦肽组抑制细胞凋亡较对照组差异显著(T>1.67,P<0.05)。相较对照组,小麦肽组C2C12中鉴定出370个差异基因,上调基因表达109个、下调基因表达261个,FC≥3/2or≤2/3。经分析,上调基因表达主要富集于炎症响应、免疫响应、TNF信号通路和IL-17信号通路等相关通路,下调基因表达主要富集于氧化还原过程等相关通路,PPI互作参数interactionscore≥0.7。从PPI的差异基因中得到前10个hub基因,并筛选到趋化因子CXCL1、CCL5、CCL2、CXCL5、CXCR4、Il6、MMP3。经分析,hub基因倾向于在趋化因子介导的信号通路、细胞对趋化因子的反应和趋化因子的反应作为生物学过程方面富集,其中趋化因子CXCL1、CCL2、CCL5基因与C2C12相关。结论:本研究揭示小麦肽可促进C2C12增殖,抑制细胞凋亡。并且小麦肽通过调节CXCL1、CCL5、CCL2、CXCL5、CXCR4等趋化因子表达,抑制成肌细胞的凋亡。

亮氨酸通过PI3K-AKT信号通路促进牛成肌细胞的增殖

旨在探究外源补充亮氨酸(Leu)对牛成肌细胞增殖的影响及其作用机理。本试验以牛成肌细胞为研究对象,利用CCK-8法和EdU染色法检测不同浓度的Leu对牛成肌细胞增殖的影响,确定Leu的最佳添加浓度;以最佳浓度Leu为处理组、0 mmol·L^(-1)Leu为对照组进行转录组测序(RNA-Seq),筛选Leu调控牛成肌细胞增殖的关键通路。利用qRT-PCR验证关键通路中的关键调控基因,并通过添加抑制剂进行进一步验证。结果显示,添加Leu可提高牛成肌细胞活力,其中0.5 mmol·L^(-1)Leu显著提高成肌细胞活力和EdU阳性率(P<0.05)。Leu组和对照组差异表达基因有1290个,其中688个上调,602个下调。KEGG富集分析,所注释的309个上调基因涉及47条显著富集通路,其中与骨骼肌生长发育相关通路中最为显著的是PI3K-AKT信号通路,包含34个上调基因。随机挑选PIK3 R1、FOXO3、IRS1、RPTOR、MTOR和MET等6个差异表达基因进行qRT-PCR验证,结果与RNA-Seq一致。添加PI3K-AKT信号通路中PI3K的抑制剂LY294002后,阻断了Leu对牛成肌细胞增殖的促进作用。综上所述,Leu可通过PI3K-AKT信号通路促进牛成肌细胞的增殖。

缺氧对鸡成肌细胞肌纤维类型转化作用的机制探究

旨在利用氯化钴(CoCl_(2))模拟肌细胞缺氧,并结合转录组测序分析缺氧对肌纤维类型及相关基因的影响。本试验以鸡原代成肌细胞为研究对象,使用不同浓度氯化钴(0、50、100、200和400μmol·L^(-1))处理细胞,每组设3个重复孔。通过检测缺氧标志基因表达和观察细胞形态筛选氯化钴浓度,确定最适宜浓度用于建模。随后,将收集的细胞通过Illumina测序检测缺氧组和对照组鸡成肌细胞的转录表达谱,并分析差异基因和富集到的信号通路。结果表明,200μmol·L^(-1)氯化钴最适合构建鸡胚成肌细胞缺氧模型,通过转录组测序发现,在24和48 h时,缺氧组和对照组分别筛选出1 474个和2 028个差异表达基因,其中有959个差异基因在两个时间点共有。GO和KEGG分析发现,在缺氧环境下,鸡成肌细胞的信号受体活性调节、质膜组成成分、神经活性配体受体作用、PI3K-AKT、肌肉收缩等信号通路关键因子发生明显表达变化。测序和qRT-PCR结果一致显示,缺氧处理后慢肌纤维特异性基因如MYH7B、CSRP2显著上调,而快肌纤维特异性基因如MYH1F、MYH1D、TNNI2、SOX6显著下调,表明缺氧能够诱导鸡成肌细胞快肌纤维向慢肌纤维转换。本研究初步揭示了缺氧对鸡成肌细胞肌纤维类型转换的机制,并提供相关基因表达数据库,为未来家禽肉质和哺乳动物缺氧研究提供了重要参考。

热应激对羊成肌细胞部分miRNA的影响及其生物信息学分析与靶基因预测

[目的]本文旨在探究热应激对羊成肌细胞部分miRNA的影响,并对miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p进行生物信息学分析与靶基因预测,揭示热应激下miRNA影响骨骼肌发育的调控机制。[方法]通过RT-qPCR技术研究热应激对羊成肌细胞miRNA表达量的影响;利用miRBase数据库获取不同物种中miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p的前体序列和成熟序列,并利用MEGA X软件构建系统进化树进行相似性分析;通过TargetScan、miRDB、RNA22、miRWalk对上述miRNA进行靶基因预测,使用DAVID对预测出的共同靶基因进行GO功能与KEGG通路富集分析,最后进行miRNA、共同靶基因与KEGG通路的关联分析。[结果]热应激显著下调羊成肌细胞在增殖阶段与分化阶段miRNA的表达。miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a在不同物种间的保守性较高,除了牛的miR-24以外,成熟序列基本相同,种子序列完全一致。预测出的共同靶基因主要富集在细胞增殖、分化、周期、凋亡、迁移等GO条目,以及mTOR、TGFβ、MAPK、Ras、ErbB、FoxO和PI3K-Akt等KEGG通路。关联分析表明miR-24和miR-27a-3p可能靶向NLK和TAOK1以参与MAPK和FoxO信号通路来调控骨骼肌的发育。[结论]miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a在不同物种中保守性较高,热应激下调羊成肌细胞部分miRNA的表达,可能影响骨骼肌的发育。

INTS11通过介导CDK2和CYCLIND1的转录促进牛成肌细胞增殖

旨在验证牛INTS11基因在成肌细胞中的功能作用,通过生物信息学分析探讨INTS11的CDS区序列及其编码蛋白的特征,并使用不同分子试验技术验证其在牛成肌细胞增殖过程中发挥的作用。本研究对牛INTS11基因序列与其他物种进行同源性对比并构建生物进化树,对其编码蛋白进行理化性质和功能结构分析以及亚细胞定位。并以体外分离培养的3月龄健康胎牛成肌细胞为试验材料,克隆成肌细胞中INTS11的全部CDS区序列,构建INTS11的过表达载体并设计基因的干扰序列,通过CCK8、Edu、RT-qPCR等技术探究其对成肌细胞增殖的影响。生物信息分析结果表明,CDS区序列全长为1800 bp,具有MBL-foldmetallo-hydro和β-CASP基序两个功能结构域,属于非跨膜蛋白,且细胞定位主要分布于细胞质。在成肌细胞中转染pcDNA3.1-INTS11质粒,结果显示在72~96 h时试验组的成肌细胞比对照组的增殖速度显著增加(P<0.05);Edu试验发现阳性细胞数目显著增加(P<0.05);RT-qPCR结果表明增殖标志因子CDK2、CYCLIND1的mRNA表达水平与对照组相比显著上升(P<0.05)。转入干扰序列后,细胞增殖速度显著下降(P<0.05),同时增殖标志因子CDK2、cyclin D1的mRNA表达水平与对照组相比显著下降(P<0.05)。本研究预测了INTS11在家养动物中的保守性,并且INTS11蛋白具有两个功能结构域,发现其通过介导CDK2、CYCLIND1的mRNA转录促进牛成肌细胞增殖,其结果完善了调控骨骼肌的基因网络,为后序探讨调控骨骼肌生长机制提供理论支持。

干扰和过表达CHRNG对牛成肌细胞增殖分化的影响

旨在研究CHRNG基因对牛成肌细胞增殖分化的影响及其潜在的分子作用途径。本研究从健康3日龄秦川牛背最长肌和后腿肌中分离到成肌细胞,利用腺病毒在秦川牛成肌细胞中过表达及干扰CHRNG基因,分为干扰组(sh-CHRNG)、干扰对照组(sh-NC)、过表达组(OE-CHRNG)、过表达对照组(OE-NC),每组3个重复,采用CCK-8、EdU、qRT-PCR、Western blot、免疫荧光染色等方法分别检测了干扰及过表达CHRNG基因对牛成肌细胞增殖分化的作用;通过RNA-Seq进一步筛选差异基因,富集信号通路。结果表明,过表达及干扰CHRNG均显著下调了细胞周期因子PCNA、CCNB1、CCND2的表达(P<0.01),显著上调了CDKN1A的表达(P<0.01),减少了发生增殖的细胞数量(CCK-8,P<0.01)且减少了处于S复制期的阳性细胞比例(EdU)。在牛成肌细胞上过表达和干扰CHRNG并诱导分化后D2、4、6进行形态学观察和免疫荧光染色,结果表明干扰和过表达CHRNG抑制牛成肌细胞的分化和肌管形成。qRT-PCR和Western blot结果表明,过表达及干扰CHRNG下调了MYOD1、MYOG、MYH3基因mRNA和蛋白水平的表达(P<0.01)。通过RNA-Seq测序分析发现,过表达CHRNG筛选到的差异基因主要富集在内质网蛋白质加工、IL-17、甲状腺激素合成、PPAR、PI3K-Akt等信号通路,KEGG分析富集的前20条通路中有10条通路与细胞分化相关;干扰CHRNG筛选到的差异基因主要富集在轴突导向、MAPK、PI3K-Akt等信号通路,KEGG分析富集的前20条通路中有8条通路与细胞分化相关。本研究结果表明,过表达和干扰CHRNG基因均能抑制牛成肌细胞的增殖和分化,且过表达和干扰CHRNG引起的差异基因所富集的通路大多与细胞分化相关。

许氏平鲉Myomaker通过调控成肌细胞融合促进肌肉肥大生长的调控机制

为探究Myomaker在硬骨鱼肌肉生长过程中调控作用,本研究以肌肉具有无限生长能力的许氏平鲉(Sebastes schlegelii)为研究对象,证明Myomaker在其肌肉生长过程中发挥重要作用。许氏平鲉myomaker基因全长5386 bp,编码序列长870 bp,编码289个氨基酸。胚胎整体原位杂交实验结果表明,myomaker的表达始于体节期,信号主要集中在体节位置,而在孵化前期和仔鱼期信号主要集中在头部和躯干前部。用myomaker过表达质粒投喂仔鱼30 d后,myomaker表达量显著升高,且过表达组小面积肌纤维(500~1000μm^(2))数目显著少于对照组,而大面积肌纤维(>1000μm^(2))数目显著多于对照组。之后停止投喂myomaker过表达质粒,继续培养90 d,过表达组大面积肌纤维(>5000μm^(2))占比仍大于对照组,这说明Myomaker在促进许氏平鲉肌肉肥大生长方面发挥了重要作用。此外,体外细胞实验证明许氏平鲉Myomaker可以促进小鼠C2C12成肌细胞发生融合,这说明Myomaker促进许氏平鲉肌纤维面积增大可能是通过调控成肌细胞融合实现的。本研究结果丰富了Myomaker调控非模式动物肌肉生长发育的资料,为进一步加深对大体型硬骨鱼类肌肉无限生长调控分子机理的理解奠定了基础。

BPGM下调对静原鸡成肌细胞生长发育的影响

旨在探讨二磷酸甘油酸变位酶(BPGM)对鸡成肌细胞生长发育的影响。对宁夏大学动物科技学院张娟课题组前期转录组学和蛋白组学数据进行联合分析,筛选出可能影响生长发育的差异表达基因,探究其对成肌细胞增殖、凋亡和相关标志基因表达水平的影响,并对糖酵解通路上下游基因的表达进行定量分析。ELISA检测肌苷酸(IMP)含量;比色法检测腺苷三磷酸(ATP)含量,深入揭示关键候选基因对静原鸡肌肉发育和肉质风味的重要作用。结果表明,静原鸡胸肌与腿肌间共鉴定到差异表达基因/蛋白139个,其中在转录组和蛋白组同时上调的差异基因/蛋白75个,在转录组和蛋白组同时下调的差异基因/蛋白45个,在转录组上调蛋白组下调的差异基因/蛋白13个,在蛋白组上调转录组下调的差异基因/蛋白6个;从糖酵解/糖异生通路筛选出7个差异表达基因,分别是BPGM、磷酸甘油酸激酶1基因(PGK1)、葡萄糖-6-磷酸异构酶基因(GPI)、磷酸甘油酸变位酶基因(PGAM1)、乳酸脱氢酶A基因(LDHA)、乳酸脱氢酶B基因(LDHB)、磷酸丙糖异构酶1基因(TPI1),结合KEGG通路富集分析和蛋白网络互作分析筛选出差异表达基因BPGM。BPGM在静原鸡母鸡组织中均有表达,在胸肌中的表达量最高,且在成肌细胞分化过程中呈上调趋势。用分离培养的原代成肌细胞进行细胞转染,干扰BPGM抑制了成肌细胞的增殖而促进细胞凋亡,并调控糖酵解通路上下游基因的表达,同时抑制了IMP和ATP的生物合成。综上所述,下调BPGM可以抑制成肌细胞的生长发育及IMP和ATP的生物合成。

成纤维细胞生长因子2重组蛋白对鸡原代成肌细胞增殖和分化的影响

为研究成纤维细胞生长因子2(FGF2)对鸡原代成肌细胞增殖和分化的影响,试验以鸡原代成肌细胞为研究对象,体外培养使其增殖并分化为肌管。在成肌细胞中添加不同浓度的FGF2重组蛋白,通过EdU和CCK8技术检测FGF2对原代成肌细胞增殖的影响,通过荧光定量PCR检测分化因子MYOD、MYOG的表达情况,分析FGF2对成肌细胞分化的影响。进一步通过转录组测序分析FGF2处理组和对照组的基因表达差异,挖掘调节肌肉发育的潜在分子机制。结果显示:添加FGF2重组蛋白能够显著促进成肌细胞增殖,抑制成肌细胞分化,在5 ng/mL时对细胞增殖促进效果最强。转录组测序数据显示,在FGF2处理组和对照组中存在424个差异表达基因,GO富集分析结果显示差异基因富集到细胞增殖、分化等通路,KEGG分析结果显示差异基因富集到MAPK通路。研究表明,FGF2可能通过影响MAPK通路进而调控成肌细胞的增殖和分化。

马度米星铵对成肌细胞转录组和超微结构的影响

探究马度米星铵对成肌细胞基因表达和超微结构的影响。马度米星铵处理C2C12细胞后,于细胞实时分析仪中记录细胞生长情况;利用Illumina HiSeq平台进行转录组测序,筛选差异表达基因并进行基因本体富集分析;显微镜下观察细胞空泡情况并拍照;透射电镜下观察拍照细胞超微结构。结果表明,马度米星铵抑制C2C12细胞生长,呈浓度和时间相关性;1μM马度米星铵处理细胞8 h后,差异表达基因共2450个,其中下调基因为1411个,上调基因1039个;基因本体分析发现,差异表达基因显著富集到空泡、DNA修复、转移酶活性正调控等;细胞内空泡显著增加;1μM马度米星铵处理细胞24 h后,细胞器明显肿胀、线粒体嵴结构髓样变、粗面内质网表面附着核糖体脱颗粒。由此可知,马度米星铵体外可诱导C2C12细胞空泡化,破坏细胞器结构,抑制细胞生长,从而导致其骨骼肌成肌细胞毒性作用,干预细胞空泡化是预防和治疗马度米星铵中毒的重要途径。

鸡苗来源成肌细胞的分离培养与鉴定

本研究旨在建立一种鸡苗来源成肌细胞的分离培养方法,进一步探讨鸡骨骼肌生长发育机理。选用1~5日龄的健康鸡苗,取其胸肌组织,用胶原酶Ⅰ37℃消化1.5 h,再利用胰酶消化25 min,随后用差速贴壁法分离纯化2 h,获得成肌细胞。结果表明:分离纯化得到的细胞生长状态良好,呈梭形,诱导分化效果较好;免疫荧光染色鉴定结果中结蛋白(Desmin)、肌球蛋白重链(MyHC)呈阳性。本研究成功分离出鸡苗来源成肌细胞,为后期研究鸡骨骼肌发育奠定基础。

Myostatin表达规律及其在鹅胚成肌细胞分化过程中的作用分析

肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)对肌细胞的增殖和分化起着重要调控作用。本研究旨在探究鹅MSTN基因在狮头和乌鬃鹅不同组织中的表达规律及对鹅胚胎成肌细胞分化的影响。检测胚胎期第15天(E15)、第23天(E23)和1日龄狮头和乌鬃鹅的腿肌组织和1日龄雏鹅的心、肝、脾、肺、肾、小肠、脑和腿肌MSTN基因的表达情况,并在狮头鹅胚腿肌成肌细胞诱导分化后,使用免疫荧光染色来检测肌管标志蛋白MyHC在干扰和过表达后的变化。2个鹅种在E15、E23和1日龄的各组织表达量存在差异,MSTN在胸腿肌的表达量高于其他组织(P<0.000 1);在胚胎期,2个鹅种MSTN的表达量随时间逐渐增加,在E15时期几乎不表达,E23和1日龄时期2种鹅该基因都有表达,且表达量增长迅速,E23至1日龄时期的MSTN表达增长量高于E15至E23时期,1日龄时MSTN表达量最高,且乌鬃鹅MSTN表达量在2个时期都高于狮头鹅(P<0.001)。成肌细胞MSTN过表达和干扰效率均达到显著;通过免疫荧光检测结果,MSTN干扰后成肌细胞肌管融合率均高于对照组(P<0.000 1);鹅胚成肌细胞MSTN基因过表达后肌管融合率低于对照组(P<0.000 1)。综上所述,MSTN在不同鹅种中主要在骨骼肌表达,并在胚胎期表达量逐渐上升,在1日龄时表达量最高,其对鹅胚成肌细胞分化具有显著抑制作用。本研究为进一步明确不同鹅种胚胎期骨骼肌发育差异的分子机制提供了理论基础。

转人类胰岛素样生长因子-Ⅰ基因成肌细胞对骨骼肌急性钝挫伤后Ⅱb型肌球蛋白重链及波形蛋白mRNA表达的影响

目的:观察转人类胰岛素样生长因子-Ⅰ(HumanInsulin -likeGrowthFactor-Ⅰ,hIGF -Ⅰ)基因成肌细胞回输小鼠骨骼肌钝挫伤局部后,对小鼠骨骼肌愈合过程中Ⅱb型肌球蛋白重链(MyosinHeavyChain -Ⅱb ,MHC -Ⅱb)及波形蛋白(Vimentin)mRNA表达的影响。方法:将90只7～12周雄性C3H小鼠右下肢腓肠肌中段内侧实施急性钝挫伤后,随机分为自然愈合组、单纯成肌细胞注射组和转基因成肌细胞注射组。挫伤后第3天,对单纯成肌细胞注射组、转基因成肌细胞注射组损伤局部分别注射等量单纯成肌细胞和转基因成肌细胞,并于损伤后第1、5、10、2 0、30天取材。检测不同时间点MHC -Ⅱb和VimentinmRNA表达水平,观察比较各组骨骼肌修复情况。结果:(1)在急性骨骼肌钝挫伤修复期,3组小鼠骨骼肌MHC -ⅡbmRNA均明显升高,第2 0天达到峰值。转基因成肌细胞注射组MHC -ⅡbmRNA表达水平最高,其次为单纯成肌细胞注射组。(2 )急性骨骼肌钝挫伤修复过程中,转基因成肌细胞注射组VimentinmRNA的表达水平始终在3组中表达最低。结论:急性骨骼肌钝挫伤修复过程中,注射转基因成肌细胞能提高损伤后MHC -IIbmR NA表达水平,促进肌纤维的增生,加速骨骼肌愈合进程。同时,损伤局部注射转hIGF -Ⅰ基因的成肌细胞后,使得损伤局部VimentinmRNA表达低于另两组。

巴戟天寡糖对成肌细胞增殖及分化的影响

目的：观察巴戟天寡糖（Morinda Officinalis How Oligosacchalide，MOO）对成肌细胞增殖分化的影响。方法：采用离体纯化培养乳鼠双侧后肢骨骼肌成肌细胞的方法，制成浓度为1×10^5／mm3的成肌细胞悬液，接种到25ml培养瓶中培养。实验分为5组：空白对照组5．氮杂胞苷（5-Aza）（10μmol／mL）对照组；MOO小、中、大剂量（100μg／ml、300μg／ml、500μg／m1）组；并检测以下指标：1．成肌细胞形态学变化。2．免疫细胞化学法鉴定结蛋白（Desmin）。3．免疫细胞化学法测定转化生长因子β1（TGF—β1）和增殖细胞核抗原（PCNA）。4．四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测巴戟天寡糖对成肌细胞增殖的影响。5．绘制生长曲线。结果：1．倒置显微镜下，成肌细胞培养24h后，可见大量折光率强的圆形细胞贴壁，且有极少量细胞有小突起；48h后，细胞呈梭形并出现单个细胞核；72h后，成肌细胞变得细长，并相互拉网，从单核期进入合体细胞阶段；继续培养，成肌细胞相互融合，形成多核性长管状初生肌管；培养第5天后，可观察到分化状态较好的肌管有自发性搏动的收缩；用desmin抗体对分裂增殖4～5天的成肌细胞进行间接免疫酶染色，细胞核外周及胞浆呈棕黄色的desmin阳性反应，表明培养的细胞为成肌细胞；成肌细胞生长曲线显示原代成肌细胞生长培养48h后开始增生，早期增殖较快，倍增时间为5d，6～7d进入平稳期。

干扰MSTN对绵羊成肌细胞增殖分化及相关基因表达的影响

旨在探讨MSTN基因对绵羊成肌细胞增殖和分化的作用及相关机制,进一步揭示MSTN在绵羊成肌细胞中的生物学功能。本研究利用重组腺病毒介导shRNA干扰绵羊成肌细胞内源性MSTN基因表达,通过CCK-8法检测成肌细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期变化,qRT-PCR检测p21基因表达。成肌细胞诱导分化后利用免疫细胞化学技术检测肌管的形成情况,统计细胞融合率,qRT-PCR检测诱导48、72、96h后MyoD、MyoG、Myf5、Myf6和HACD1基因的表达量变化。结果发现,干扰MSTN后成肌细胞的增殖受到抑制,细胞周期停滞在G0/G1期,并且p21的表达呈上升趋势。在对成肌细胞分化作用的研究中,发现干扰组与阴性对照组相比,诱导48h4个生肌调节因子的表达量均呈下降趋势,MyoG基因表达显著下调(P<0.05);诱导72h干扰组成肌细胞融合率极显著高于阴性对照组(P<0.01),Myf5和Myf6基因表达量极显著降低(P<0.01),MyoD基因表达量升高不显著(P>0.05),MyoG基因表达量极显著增加(P<0.01),诱导96h,Myf5基因表达量显著降低(P<0.05),MyoD基因表达量降低不显著(P>0.05),MyoG基因表达量极显著降低(P<0.01),Myf6基因表达量升高不显著(P>0.05)。另外诱导72h,HACD1基因的表达量在干扰组中显著高于阴性对照组(P<0.05),诱导48和96h无显著变化。研究表明,干扰MSTN表达对成肌细胞的增殖有抑制作用,对分化有促进作用,HACD1基因与成肌细胞融合相关。

C2C12成肌细胞体外诱导分化为肌管的实验

【目的】观察低浓度马血清体外诱导成肌细胞C2C12向成熟肌细胞分化、形成肌管的作用,探索定向诱导肌分化的途径及其分子机制。【方法】将C2C12成肌细胞用含不同浓度马血清的高糖DMEM培养基培养,收集细胞,在相差显微镜下观察形态变化,并通过免疫细胞化学(Imminocytochemistry,ICC)及RT-PCR方法分别检测肌性相关基因表达的改变。【结果】①20mL/L和50mL/L的马血清均能促使C2C12细胞形成肌小管,20mL/L浓度马血清诱导效率最好(第7天时肌小管形成率分别为31.4%±2.1%和19.0%±1.6%,P<0.001)。②20mL/L马血清诱导3～4d开始有肌管形成,之后肌管越来越多,到8～9d达高峰(第9天40.2%±1.3%),往后细胞逐渐衰老死亡。③20mL/L马血清诱导C2C12细胞向成熟肌细胞分化过程中,肌相关蛋白分子表达发生变化:结蛋白(desmin)、成肌分化抗原(MyoD)、生肌素(myogenin)和肌球蛋白(myosin)等表达逐渐增强(未刺激时分别约为49.6%±1.1%、23.4%±1.1%、4.8%±1.6%和2.6%±1.5%;第6天时分别提高为80.4%±1.8%、85.4%±1.1%、22.2%±1.1%和26.0%±1.6%;P<0.001);desmin、MyoD和myogenin相应的mRNA分子也可以通过RT-PCR检测到。【结论】①低浓度的马血清能够有效刺激C2C12成肌细胞向成熟细胞分化,以20mL/L浓度效果最好;②C2C12细胞是研究肌细胞发育分化的理想模板;③肌分化发育过程比较复杂,许多因素都可能起影响,研究设计要尽量标准化。

小肠黏膜下层复合上皮细胞及成肌细胞构建组织工程食管的初步研究

目的初步探索利用小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）作为支架材料，复合食管鳞状上皮细胞与成肌细胞构建组织工程食管的可行性。方法4周龄无胸腺小鼠20只，体重20．0±2．5g，雌雄不限。体外分离、培养人胚胎食管鳞状上皮细胞、成肌细胞，并行5-BrdU标记；制备SIS材料并切割成1cm×lcm大小，在SIS材料同一表面接种两种细胞，待细胞在材料表面贴附后将其植入裸鼠体内深筋膜下，于术后第3天及l、2、3周取材行组织学和抗角蛋白、平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin，SMA）免疫组织化学观察，以了解食管鳞状上皮细胞、成肌细胞在SIS材料上的增殖、分化情况和复合物在裸鼠体内的血管化情况。结果人胚胎食管鳞状上皮细胞、成肌细胞能够渗透、生长于SIS材料中，并形成数层结构。植入体内第3天可见细胞增殖为多层覆盖于材料表面，并分泌大量细胞间基质。第2周时已经形成7～8层细胞，并伴有血管长入。3周时细胞增殖为十几层，大量血管长入。通过5-BrdU标记抗体染色观察，示SIS支架材料上生长的细胞多为所植入细胞。抗角蛋白，SMA免疫组织化学染色示移植细胞能够在体内分化。结论成肌细胞与鳞状上皮细胞在SIS材料上的复合培养物，在体内能继续增殖分化形成多层细胞结构，并能快速血管化，可用于组织工程化食管的构建。

原代人胚成肌细胞体外培养增殖及分化特性

目的 分离培养人胚胎成肌细胞 ,观察原代细胞体外增殖与分化特性。方法 选择健康妇女捐赠的胎儿骨骼肌标本 ,参照 Blau等的胰蛋白酶与胶原酶混合、多步消化法分离成肌细胞。经差速贴壁法纯化后 ,在含 2 0 %胎牛血清的生长培养基中培养 ,以生长曲线评价其增殖情况 ;含 5 %胎牛血清的融合培养基中培养 ,以磷酸肌酸激酶 - MM型合成量及成肌细胞融合率评价其分化能力。通过光镜、透射电镜、免疫细胞化学方法 (小鼠抗人肌球蛋白单克隆抗体 )鉴定所得细胞。结果 电镜下可见所得细胞含大量游离核糖体 ,肌球蛋白免疫细胞化学染色强阳性 ,能合成磷酸肌酸激酶 ,能融合形成肌小管 ,证明其为骨骼肌成肌细胞。在生长培养基中原代细胞倍增时间为4.8天 ,在融合培养基作用下 ,肌小管融合率及磷酸肌酸激酶合成量明显增加。结论 多步酶消化法与差速贴壁法能获得足量、纯净成肌细胞 ,所得细胞增殖能力强 ,能表达骨骼肌特异的收缩蛋白 ;