动态压力刺激下BMSCs细胞膜片中LRP5/6及成软骨标记物的表达

目的适宜的力学刺激能够促使骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞膜片向软骨细胞分化,这为修复髁突软骨缺损提供了新的思路。然而,其中的力学信号转导机制尚未明确。本研究旨在探究动态力学环境下BMSCs细胞膜片中低密度脂蛋白相关蛋白(LRP)5/6及成软骨标记物的表达。方法使用课题组自主研发的多功能细胞正负压加载系统装置,对BMSCs细胞膜片给予不同时段0~120 k Pa动态静水压力刺激。Real-time PCR检测LRP5/6、SOX9、Aggrecan及COL-Ⅱ的m RNA表达水平;Western blotting检测LRP5/6、SOX9、Aggrecan及COL-Ⅱ的蛋白表达水平。结果0~120 k Pa,连续加压1~7 h时,BMSCs细胞膜片中LRP5/6、SOX9、Aggrecan及COL-Ⅱ的m RNA及蛋白表达量高于空白对照组,各实验组LRP5/6及成软骨标志物的m RNA及蛋白表达量无显著差异;0~120 k Pa,加压1 h/d,连续加压1~7 d时,BMSCs细胞膜片中LRP5/6、SOX9、Aggrecan及COL-Ⅱ的m RNA及蛋白表达量均高于空白对照组,各实验组LRP5/6及成软骨标志物的m RNA及蛋白表达量无显著差异。结论动态压力加载条件下,BMSCs细胞膜片中LRP5/6及成软骨标志物表达量显著提高,说明LRP5/6参与了动态压力刺激下BMSCs细胞膜片成软骨响应过程。

淫羊藿苷含药血清促进3种细胞共培养体系中软骨细胞增殖和干细胞成软骨分化

背景:关节软骨损伤修复能力十分有限,组织工程技术为修复受损软骨提供了新的治疗方案,其中软骨细胞、骨髓间充质干细胞和滑膜间充质干细胞之间的相互影响和诱导作用是自体软骨损伤愈合的基础。目的:构建软骨细胞-骨髓间充质干细胞-滑膜间充质干细胞共培养体系用以模拟软骨细胞体内微环境,并探究其最佳细胞接种比例,同时观察淫羊藿苷含药血清对该体系中软骨细胞增殖和干细胞成软骨分化的影响。方法:提取、培养、鉴定大鼠膝关节软骨细胞、骨髓间充质干细胞和滑膜间充质干细胞,按不同细胞接种比例构建软骨细胞-骨髓间充质干细胞-滑膜间充质干细胞非接触共培养体系,共培养72 h后观察软骨细胞增殖活性和表型能力,选择综合效应最佳的共培养体系;用淫羊藿苷溶液(0.25 mg/m L)灌胃新西兰大白兔制备淫羊藿苷含药血清,对照组共培养体系用含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的高糖DMEM培养液培养,实验组共培养体系在此基础之上加入体积分数为10%淫羊藿苷含药血清进行干预,24,48 h后检测两组软骨细胞增殖活性和Ⅱ型胶原表达,14 d后采用免疫荧光染色检测骨髓间充质干细胞、滑膜间充质干细胞成软骨分化情况。结果与结论:(1)3种细胞以不同比例共培养时均可正常贴壁生长,当软骨细胞、骨髓间充质干细胞、滑膜间充质干细胞接种比例为2∶1∶1时,共培养体系中软骨细胞表现出最佳增殖活性和表型能力;(2)与对照组相比,实验组培养24 h后软骨细胞增殖活性和Ⅱ型胶原表达显著升高(P<0.01),48 h后两组仍有差异(P<0.05),培养14 d后两组骨髓间充质干细胞和滑膜间充质干细胞出现明显的软骨分化,部分细胞呈现圆形或椭圆形,胞浆Ⅱ型胶原免疫荧光染色为阳性,实验组荧光强度明显高于对照组(P<0.01);(3)结果表明,以非接触共培养方法可以成功建立软骨细胞-骨髓间充质干细胞-滑膜间充质干细胞共培养体系且细胞比例为2∶1∶1时软骨细胞增殖活性和表型能力最佳;同时淫羊藿苷含药血清具有促进该体系中软骨细胞增殖及骨髓间充质干细胞、滑膜间充质干细胞成软骨分化的作用。

敲低NIPBL基因对TGF-β1与IGF-1联合诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

目的:探讨敲低NIPBL基因对TGF-β1与IGF-1联合诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响。方法:将慢病毒转染的NIPBL shRNA骨髓间充质干细胞分为TGF-β1组、TGF-β1+IGF-1组、NIPBL-空白对照组,并设立未转染的NIPBL+组,对上述四组细胞进行成软骨诱导分化;在培养7、14、21天时应用Western blot技术分别检测Sox-9、Collagen-Ⅱ的蛋白表达水平。结果:(1)在成软骨诱导的各阶段,Sox-9、Collagen-Ⅱ的蛋白表达量均为TGF-β1+IGF-1组高于TGF-β1组,NIPBL+组高于TGF-β1组和NIPBL-对照组(P<0.05);(2)在诱导7、21天时,Sox-9基因的蛋白表达量TGF-β1+IGF-1组高于NIPBL-对照组(P<0.05);(3)在各诱导阶段,TGF-β1+IGF-1组和NIPBL+组间差异无统计学意义。结论:敲低NIPBL基因导致TGF-β1与IGF-1联合诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的能力降低。

压力作用下血小板反应蛋白-2通过调控黏着斑形成促BMSCs成软骨分化的研究

目的力学刺激在软骨发育和软骨组织稳态维持中有重要作用。前期研究发现,动态压力刺激促进BMSCs成软骨分化的过程中,伴随血小板反应蛋白-2(TSP-2)的表达上调,且TSP-2与BMSCs成软骨分化密切相关,但其作用机制尚未完全阐明。本研究采用外源性TSP-2多肽以及慢病毒干扰TSP-2表达后,检测动态压力下TSP-2在BMSCs成软骨分化中的作用及机制。方法体外分离培养BMSCs,分为对照组、TSP-2组、sh TSP-2组、压力组、压力+TSP-2组和压力+sh TSP-2组;免疫荧光染色法检测细胞中FAK的表达,并对黏着斑数量进行统计分析;采用超低黏附培养皿对BMSCs行3D培养,倒置光学显微镜观察细胞团块并拍照;Western blotting检测细胞团块中成软骨标志蛋白Sox9的表达;结果贴壁培养的sh TSP-2组、压力组和压力+sh TSP-2组BMSCs中,FAK的表达水平和黏着斑数量显著高于对照组(P<0.05),压力+TSP-2组与压力组相比黏着斑数量显著下调(P<0.05);sh TSP-2组和压力+sh TSP-2组中细胞团块存在大量未聚集的细胞;Western blotting结果显示TSP-2组、压力组、压力+TSP-2组细胞团块中Sox9的表达显著高于对照组(P<0.05)。结论动态压力刺激下TSP-2通过抑制BMSCs黏着斑的形成,促BMSCs向成软骨方向分化。

胶原结合域-骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架制备及其成软骨诱导

背景:天然骨形态发生蛋白2在体内弥散和降解速度较快,降低了局部浓度和治疗效果,单纯将骨形态发生蛋白2与组织工程支架复合后不能在体内长期停留,无法达到良好的缓控释效果。目的:制备并检测胶原结合域-骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架的生物性能及成软骨诱导效果。方法:提取SD大鼠鼠尾胶原,采用真空冷冻干燥及化学交联法制备胶原软骨支架。通过快速克隆C112-同源重组法构建表达胶原结合域-骨形态发生蛋白2质粒,通过基因工程构建并导入大肠杆菌,分离纯化胶原结合域-骨形态发生蛋白2。将天然骨形态发生蛋白2与胶原结合域-骨形态发生蛋白2分别与胶原软骨支架结合,检测支架中骨形态发生蛋白2释放水平,采用CCK-8法及F-Actin染色法检测胶原结合域-骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架的生物相容性;将骨髓间充质干细胞分别种植在两种胶原软骨支架上进行成软骨诱导,检测其成软骨诱导活性。结果与结论:①胶原结合域-骨形态发生蛋白2与胶原软骨支架的结合率高于天然骨形态发生蛋白2(P<0.05);体外浸泡于PBS中7 d,胶原结合域-骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架中骨形态发生蛋白2的释放量小于天然骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架(P<0.05);CCK-8实验及F-Actin染色结果显示,胶原结合域-骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架无明显细胞毒性,具有良好的生物相容性;②成软骨诱导14 d后的ELISA检测显示,胶原结合域-骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架组聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白A1的表达均高于天然骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架组(P<0.05);扫描电镜下可见,两组支架孔隙内壁上均可见较多骨髓间充质干细胞贴附生长,细胞形态及大小一致,排列紧密,未出现细胞碎裂或形态异常;③结果表明,胶原结构域-骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架具有良好的生物性能及成软骨诱导活性。

骨髓间充质干细胞的成软骨分化及其在骨关节炎软骨损伤修复中的研究进展

骨关节炎(OA)软骨损伤修复一直是临床治疗面临的难题,目前尚无合适的药物和外科手术能够完全修复受损软骨。随着干细胞疗法的不断进步,骨髓间充质干细胞(BMSCs)在治疗软骨损伤方面体现出独特优势。BMSCs具有增殖能力强、免疫原性低及良好的成软骨分化潜能等生物学特性,现已逐步应用于OA软骨损伤的再生和修复,成为软骨组织工程中的热门种子细胞,但目前临床应用BMSCs的治疗方式较为单一。未来应加强BMSCs成软骨分化的机制研究,从生物支架材料、转化生长因子以及理化诱导环境等多方面探索高效的BMSCs成软骨转化过程,以期优化BMSCs在OA软骨损伤修复中的应用。

人脂肪间充质干细胞成软骨分化过程中差异表达长链非编码RNA鉴定及功能

背景:人脂肪间充质干细胞成软骨分化过程受多种因素影响。研究证实,长链非编码RNAs在表观遗传调控、转录以及转录后水平调控等过程中扮演着重要角色,而目前其在人脂肪间充质干细胞成软骨分化过程中表达谱的改变以及调控作用鲜有报道。目的:探讨人脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化过程中差异表达长链非编码RNAs及其功能。方法:以人脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化0 d(未诱导组)、14 d(诱导组)细胞为研究对象,利用转录组测序技术筛选成软骨诱导分化前后差异表达倍数变化2倍及以上的长链非编码RNAs和mRNAs,并通过qRT-PCR对测序结果进行验证。采用生物信息学分析对差异表达基因行GO功能分析和KEGG通路富集分析,并筛选长链非编码RNAs邻近基因以及共表达基因。结果与结论:①与未诱导组相比,诱导组中显著差异表达的长链非编码RNAs共有816条,mRNAs共有5138条;②GO功能和KEGG信号通路分析发现,差异表达基因富集的主要生物学过程包括细胞进程、生物调节和代谢过程等;主要通路包括黏附斑激酶、胰岛素信号通路、Wnt信号通路等;③对差异表达长链非编码RNAs行邻近基因和共表达基因分析发现,部分长链非编码RNAs如SNHG16、XLOC_003886可能在脂肪间充质干细胞成软骨分化和软骨退变中发挥重要作用;④结果表明,长链非编码RNA的表达谱在脂肪间充质干细胞诱导成软骨分化过程中发生了明显改变;差异表达长链非编码RNAs的生物学功能可能与邻近基因和共表达基因功能密切相关,从而调控脂肪间充质干细胞成软骨分化。然而,其具体调控作用和分子机制有待实验进一步证实。

视黄醇酸受体拮抗剂LE135诱导大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化

用成体干细胞修复软骨损伤是目前的研究热点,其中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)可以诱导成软骨细胞,转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)可以通过活化成软骨标志物诱导BM-MSCs成软骨,但分化软骨细胞容易肥大且生长因子可能引发免疫反应。

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化

目的探讨小香猪骨髓间充质干细胞(MSC)向成骨细胞和成软骨细胞诱导分化的能力。方法选用早期贴壁培养的小香猪骨髓MSC,在传代两三次后加入条件培养基,观察了细胞的形态学变化,同时检测碱性磷酸酶、钙盐沉积以及细胞外基质和II型胶原的表达。结果MSC在骨形成蛋白(BMP)、地塞米松和β-磷酸甘油钠的作用下,两三天细胞从梭形变为圆形或类圆形,细胞体积增大,12～15d时细胞集落的表面可见有颗粒状物质分泌,碱性磷酸酶染色为阳性,20～25d时,分泌颗粒更加明显,核固红染色为阳性,表现出成骨细胞的特点;在培养体系中加入地塞米松和转化生长因子-β1后两三天,可见细胞由类成纤维状变为圆形或椭圆形状,有的呈肾性,体积增大,10d后可见细胞周围有基质分泌,II型胶原染色为阳性,表现为软骨细胞分化的特点。结论在一定培养条件下成功诱导小香猪骨髓MSC向成骨细胞和成软骨细胞分化,为我们进一步的研究打下基础。

成软骨细胞瘤的影像学表现及诊断价值

目的 探讨成软骨细胞瘤的影像学特征及诊断价值。资料与方法 分析经病理证实的成软骨细胞瘤 15例的临床及影像学表现 ,所有病例均作X线平片检查 ,9例同时行CT扫描。结果 肱骨 5例 ,股骨 6例 ,胫骨、锁骨、髂骨和腰椎各 1例 ;病灶呈圆形或椭圆形骨质破坏 ,部分呈膨胀、偏心性生长 ,管状骨病变多起源于骨骺 ,可累及干骺端 ;病灶内常有钙化 ,周围见硬化带 ,骨皮质破裂 ,软组织肿块 ,少数有骨膜反应。X线平片正确诊断 8例 ,未定性 3例 ,误诊 4例 ,诊断准确率 5 3.3% ;CT正确诊断 6例 ,误诊 3例 ,诊断准确率 6 6 .7%。结论 多数成软骨细胞瘤有典型的影像特征 ,影像学检查对其具有重要诊断价值 ;X线平片仍是基本检查方法 。

中药血清对大鼠bMSCs体外成软骨分化中Col2a1和Acan表达的影响

目的观察中药雪莲花、丹参、仙灵脾、黄芪和复方右归饮含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(bMSCs)成软骨分化中Ⅱ型胶原α1(Col2a1)和软骨聚糖蛋白(Acan)表达的影响。方法 2月龄SD大鼠分离骨髓间充质干细胞,置含15%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基中培养。传至第3代后,将培养细胞分为未诱导组、TGF诱导组、中药血清诱导组和TGF-中药血清联合诱导组。中药血清的使用浓度为5%,由上述中药连续大鼠灌胃3 d后,分离外周血获得。各组细胞诱导至7 d和14 d时,分别提取总RNA,逆转录成cDNA,荧光定量PCR法检测Col2a1和Acan的表达,同时应用细胞免疫化学法检测诱导14 d的Ⅱ型胶原的表达。结果 bMSCs在TGF-β1的诱导下可以分化为软骨样细胞,在诱导后7 d和14 d,TGF诱导组Col2a1的表达量显著高于未诱导组,分别为14.272倍和35.833倍,中药血清组Col2a1的表达量变化不显著,TGF-中药血清联合诱导组Col2a1的表达量虽高于未诱导组,但显著低于TGF诱导组。Acan基因的表达量在各组中均显著低于未诱导组。结论骨髓间充质干细胞在体外可以分化为软骨样细胞,中药对细胞成软骨分化没有明显的促进作用,并对TGF诱导效应具有一定的抑制作用。

脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞成软骨能力的比较

背景:脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞是软骨组织工程中应用较多细胞,二者在生物学特性上有诸多相似之处。目的:比较脂肪来源和骨髓来源的2种间充质干细胞的成软骨分化能力。方法:选取3月龄新西兰大白兔,取腹部脂肪,分离提取脂肪干细胞。取兔双侧股骨,采用贴壁筛选法分离提取骨髓间充质干细胞。绘制第3代脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞的生长曲线,比较2种细胞的倍增时间。对第3代脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞进行成软骨诱导,分别对诱导14d的2种细胞行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果与结论:骨髓间充质干细胞原代细胞呈聚集样生长,而脂肪干细胞原代细胞呈单个、散在生长。脂肪干细胞增殖速度要快于骨髓间充质干细胞,倍增时间短于骨髓间充质干细胞h。2种细胞成软骨诱导14d后,均表达糖胺聚糖和Ⅱ型胶原,且骨髓间充质干细胞成软骨诱导后表达Ⅱ型胶原水平高于脂肪干细胞。说明脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞体外增殖皆迅速且稳定,但是脂肪干细胞的生长增殖速度更快。单层培养时,特定条件下,脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞均能向软骨细胞转化,但是骨髓间充质干细胞比脂肪干细胞具有更高的潜能。

骨形态发生蛋白-2、-3对胚胎小鼠椎间盘细胞的成软骨及成骨作用

目的探索成骨作用的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)及抑制成骨作用的骨形态发生蛋白-3(BMP-3)对胚胎小鼠椎间盘细胞的成软骨及成骨作用,为BMPs临床治疗椎间盘相关疾病提供实验依据。方法运用腺病毒介导的BMP-2和BMP-3在胚胎小鼠椎间盘细胞中表达,RT-PCR检测Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)、蛋白多糖(ACAN)、骨钙素(OC)、骨保护素(OPG)和骨桥蛋白(OPN)成软骨及成骨相关指标mRNA水平的表达,甲苯胺蓝染色检测软骨基质的表达,碱性磷酸酶(ALP)读数及ALP染色检测ALP的活性。结果 BMP-2和BMP-3表达对于椎间盘纤维环(AF)细胞的成软骨和成骨均没有作用。对椎间盘髓核(NP)细胞的软骨相关指标ColⅠ、ColⅡ、ACAN mRNA的表达同样没有影响,但可促进NP细胞的成骨,其中BMP-2和BMP-3均可促进OC mRNA的表达升高,而仅BMP-2可促进其OPG和OPN的mRNA表达升高。甲苯胺蓝染色证明BMP-2和BMP-3对椎间盘细胞软骨基质分泌的影响并不显著。NP细胞在BMP-2和BMP-3腺病毒感染后ALP活性明显增强,在AF细胞中则未观察到这种变化。结论 BMP-2和BMP-3均可促进胚胎小鼠NP细胞的成骨作用,但对AF细胞的成骨及成软骨作用及对NP细胞的成软骨作用没有影响。

大鼠来源滑膜间充质干细胞的成软骨分化

背景:相比其他组织来源的间充质干细胞,滑膜间充质干细胞有着较强的成软骨特性和克隆能力,因此将是软骨组织工程中最有前景的种子细胞之一。目的:培养及体外扩增SD大鼠滑膜间充质干细胞,鉴定其多向分化潜能及在添加生长因子后三维立体培养条件下的成软骨能力。方法:无菌条件下获取SD大鼠滑膜组织,Ⅰ型胶原酶消化法分离大鼠滑膜间充质干细胞。体外扩增、培养,取第3代滑膜间充质干细胞进行吉姆萨、生长曲线测定、成脂诱导、成骨诱导和三维条件下成软骨诱导,成软骨诱导21 d后通过甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色及RT-PCR对成软骨诱导后产物进行检测。结果与结论:获取的大鼠滑膜细胞具有间充质干细胞的特性,滑膜间充质干细胞在体外培养呈成纤维样形态,并维持着多向分化的能力。使用生长因子诱导软骨细胞21 d后,可见软骨样组织,蛋白聚糖和Ⅱ型胶原可以在甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色后被检测到。RT-PCR检测结果显示软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA呈阳性表达。提示大鼠来源的滑膜间充质干细胞具有成软骨能力。

流体静压力及雌激素共同作用对骨髓间充质干细胞成骨及成软骨分化的影响

目的观察流体静压力联合雌激素对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖、细胞骨架及成骨、成软骨向分化的影响,检测这两种刺激共同作用是否具有生物叠加效应。方法采用全骨髓贴壁分离法分离培养BMSCs,流式细胞仪进行BMSCs表面标志物分子鉴定。细胞分为对照组(C组)、1 nmol/L17β-雌二醇作用组(E组)、1 nmol/L雌激素受体拮抗剂TAM作用组(T组)、90 kPa压力加载1 h组(P组)、17β-雌二醇预处理12 h后再加压1 h组(P+E组)以及TAM预处理12 h后再加压1 h组(P+T组)。流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期变化;FITC-鬼笔环肽染色后激光共聚焦显微镜下观察F-actin细胞骨架表达与重组情况;各组细胞经成骨诱导7 d和14 d后茜素红染色观察钙结节形成量、Real-time PCR检测成骨细胞标志基因Col I、ON、OPN及BSP的mRNA表达;成软骨诱导14 d和28 d后甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖表达、Real-time PCR检测成软骨细胞标志基因Sox9、Aggrecan及ColⅡ的mRNA表达。采用SPSS 16.0对数据进行单因素方差分析,后续Dunnett t检验进行各时间点上实验组与空白对照组数据之间及各实验组之间的组间比较。结果流体静压力(90 kPa,1 h)及1 nmol/L 17β-雌二醇作用下细胞增殖能力以及细胞骨架的活性均增强,但并不具有生物整合效应。成骨诱导14 d后,钙结节形成。Real-time PCR结果显示,17β-雌二醇作用组中成骨标志基因Col I、ON、OPN及BSP的表达水平显著增加。两种刺激在成骨诱导分化7 d时均可提高标志基因的表达,具有生物协同效应,但成骨诱导14 d时两者则表现出相互拮抗的作用。成软骨诱导28 d后,甲苯胺蓝染色阳性。成软骨诱导过程中,单纯压力刺激组成软骨标志基因Sox9、Aggrecan及ColⅡ的表达显著升高,雌激素预调则削弱压力对间充质干细胞的促成软骨分化作用。结论流体静压力及雌激素仅在骨髓间充质干细胞成骨分化早期表现生物整合效应,而在增殖、细胞骨架活性方面则无此效应。在成骨分化晚期及成软骨分化中两种刺激因素表现出拮抗作用,雌激素可促成骨分化,而压力则表现为促成软骨分化的作用。

子宫内膜基质干细胞的成骨及成软骨诱导分化研究

目的研究子宫内膜基质干细胞在特定培养条件下向成骨及成软骨细胞分化,探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性。方法取15例因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的内膜组织,磁珠分选法获得子宫内膜基质干细胞,用成骨诱导和成软骨诱导培养基诱导,组织化学染色检测其向成骨和成软骨细胞分化的情况。结果从人子宫内膜组织中培养出基质干细胞,能稳定增殖传代。在成骨诱导培养基诱导下子宫内膜基质干细胞茜素红染色出现钙结节;成软骨诱导培养基诱导下,阿利新兰染色呈阳性。结论从子宫内膜组织中可获得具有多向分化潜能的基质干细胞,并能在体外稳定增殖传代,经诱导后可分化为成骨细胞和成软骨细胞,有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一。

人骨髓间充质干细胞的扩增培养及向成软骨样细胞的定向诱导分化

从人骨髓中分离和培养间充质干细胞(MSCs),在原代和传代培养中其形态学上均为贴壁、纤维状的细胞,随着代次的增加细胞形态更加趋于一致.流式细胞仪鉴定CD45、CD34、CD117、HLA-DR阴性,CD29、CD166阳性,并随着培养代次的增加,阳性比率和阴性比率出现相应的上升和降低,说明细胞中MSCs纯度增加.第三代细胞大约有80%处于G0/G1期,S+G2+M期约20%,说明MSCs有强大的增殖潜能.在传代培养中的最适接种密度为5000个/cm2左右.MSCs在体外经历了滞缓期、对数生长期、平稳期3个时期,传代培养的MSCs生长速度比原代的MSCs明显快很多.采用程序降温法对MSCs进行冻存,60～90d后对冻存的MSCs进行复苏,发现MSCs仍可在体外良好生长4～6代,特定的MSCs样本可以扩增10代,说明经过冻存的细胞仍具有良好的增殖能力.对4例标本的前三代MSCs在体外利用TGF-β1和维生素C诱导两周后,用RT-PCR证明MSCs表达软骨特异性的II型前胶原的mRNA,说明培养的细胞具有向成软骨样细胞分化的潜能,由此进一步证实其为MSCs.

miR-155有助于骨髓间充质干细胞成软骨分化

背景:近年发现,mi RNA是能够对基因表达产生影响的一种新型调控子,mi RNA有助于多能干细胞分化增殖以及自我更新。目的:探讨mi R-155对大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化的调控机制。方法:12周龄健康SD大鼠60只,随机分为研究组与对照组,每组30只。于麻醉状态下将大鼠处死,获取下肢骨髓,进行骨髓间充质干细胞分离、培养,研究组给予mi R-155基因模拟物转染,对照组给予阴性对照序列转染,经成软骨诱导分化后进行RT-PCR检测Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan、Collagen X基因的表达,Western blot检测Sox9、Runx2蛋白的表达。结果与结论:研究组Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan基因表达高于对照组,Collagen X基因表达低于对照组,差异均有显著性意义(P<0.05)。研究组Sox9蛋白表达高于对照组,Runx2蛋白表达低于对照组,差异均有显著性意义(P<0.05)。结果表明mi R-155不仅有助于骨髓间充质干细胞成软骨分化,而且可以抑制骨髓间充质干细胞成软骨分化呈肥大趋势发展。

共沉默miR-221-3p/222-3p表达抑制骨髓间充质干细胞增殖及促成软骨分化

背景:基于干细胞的组织工程技术作为治疗骨关节损伤修复的有效手段,具有广泛的应用前景。研究表明miRNA在调控干细胞向软骨分化过程中具有重要的作用。目的:探讨共感染慢病毒介导的反义miR-221-3p/222-3p(microRNA-221-3p,microRNA-222-3p)对人骨髓间充质干细胞成软骨分化的作用,为临床软骨损伤修复提供新的策略。方法:利用miRNA基因芯片技术筛选转化生长因子β3诱导人骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中不同阶段表达差异的miRNA,并利用荧光实时定量PCR(RT-q PCR)验证;构建慢病毒人反义miR-221-3p/222-3p载体(Lv-miR-221-3p-inhibition,Lv-miR-222-3p-inhibition)并共转染人骨髓间充质干细胞,空载体组(Lv-GFP)以及未转染组作为对照。利用CCK-8法检测沉默miR-221-3p/222-3p 6 d后细胞的增殖情况;通过番红O染色法、免疫组织化学方法以及RT-PCR验证各组软骨诱导21 d后软骨分化相关标志物的表达。结果与结论:构建的Lv-miRNA-221-3p/222-3p inhibition共转染人骨髓间充质干细胞,成功沉默了细胞中的miR-221-3p/222-3p表达水平;miRNA基因芯片与RT-q PCR验证结果显示miR-221-3p/222-3p在软骨分化后期表达明显降低;转染组与未转染组以及空载体组相比:1细胞增殖明显受到抑制。2番红O染色以及免疫组织化学显示软骨分化特征标志物硫酸软骨素以及Ⅱ型胶原表达增强。3RT-qPCR也证实硫酸软骨素以及Ⅱ型胶原的mRNA表达也明显上调。结果显示沉默人骨髓间充质干细胞miRNA-221-3p/222-3p,抑制了细胞增殖并促进了成软骨分化。