导入β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因可育油菜及其抗菌核病的研究

利用农杆菌转化法,将组成型表达β1,3葡聚糖酶及几丁质酶基因的双价植物表达载体pBLGC转化优质甘蓝型油菜品种H165,并得到了抗卡那霉素(Kanamycin,Kan)的再生植株。我们对所得到的抗Kan的再生苗进行了初步分子生物学检测,结果表明,在K15(Kan15mg/L)培养基上的绿苗中有30%为PCR阳性植株,而在K25(Kan10mg/L)培养基上的绿苗有53%的阳性率。对部分PCR阳性的转基因植株进行了点杂交分析,结果均表现出较强的杂交信号,这初步说明外源基因已整合到油菜基因组中。转基因植株的活体接种油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorium)试验表明,部分转基因植株比对照显示较强抗病性。

抗菌核病双低油菜新品种中双9号选育及其重要防御酶活性变化规律的研究

中双 9号是采用复合杂交和小孢子培养技术选育的双低甘蓝型油菜新品种 ,具有高抗菌核病、高抗倒伏、丰产性突出、稳产性好、品质优良、适应性广等优点。 2 0 0 2年油菜中双 9号通过湖北省农作物品种审定委员会审定。在 2 0 0 0～ 2 0 0 2年湖北省区域试验中该品种平均单产 2 4 82 .2kg·ha-1,比对照中油 82 1增产 15 .33%。中双 9号种子芥酸含量 0 .2 3% ,商品籽硫甙含量 2 2 .6 9μmol·g-1(饼 ) ,含油量 4 2 %。经大田自然侵染鉴定 ,中双 9号平均菌核病发病率为 13.31% ,比对照中油 82 1降低 2 8% ,病情指数为 6 .4 7,降低 36 %。经离体叶菌丝接种鉴定 ,中双 9号病斑面积仅为 4 .70 9cm2 ,显著小于中抗品种中油 82 1(5 .933cm2 ) ;经牙签接种鉴定 ,中双 9号病斑扩展长度仅为1.2 75cm ,极显著小于中抗品种中油 82 1(1.94 3cm)。还研究了不同抗性油菜品种在接种菌核病菌丝后植株体内苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶、β 1,3 葡聚糖酶、过氧化物酶、多酚氧化酶活性变化规律 ,探讨了中双

油菜分子标记图谱构建及抗菌核病性状的QTL定位

以油菜品种 ０８５（抗菌核病）与湘油 １３号杂交得到的 Ｆ２代作为作图群体，以 ＲＡＰＤ标记 来构建油菜连锁图谱、通过对３００个１０－ｍｅｒ随机引物的筛选，共获得２００个多态性ＰＡＰＤ位 点。经Ｍａｐｍａｋｅｒ／ＥＸＰ３．０软件处理，构建了１张含１９３个标记位点、１９个连锁群、覆盖长度为 １３２４ｃＭ的连锁图谱、在此基础上利用 Ｍａｐｍａｋｅｒ／ＱＴＬ１．１将抗菌核病基因定位在第四、八和 十四３个连锁群上，即：Ｓｃ１、Ｓｃ２和Ｓｃ３。其中Ｓｃ２解释表型变异的２９％，相对Ｓｃ１和Ｓｃ３而言，Ｓｃ２具有主效基因的特征。 ３个 ＱＴＬｓ的联合贡献率约为 ５６％。

抗菌核病双低油菜新品种中双9号的选育

中双9号是采用复合杂交和小孢子培养技术相结合选育的双低甘蓝型油菜新品种,具有高抗菌核病,高抗倒伏,丰产性突出,稳产性好,品质优良,适应性广等优点。2000—2002年湖北省区域试验中,菌核病抗性强,菌核病平均发病率为13.31%,比对照中油821降低了28%;病情指数为6.47,比对照中油821降低了36%,平均产量2482.2kg/hm2,比对照中油821增产15.33%。种子芥酸含量0.23%,商品籽硫甙含量22.69μmol/g,含油量42.0%。2002年通过湖北省农作物品种审定委员会审定,是一个极具推广应用前景的优良品种,是油菜抗菌核病和抗倒性育种的优良资源。

抗菌核病转基因油菜植株的获得

将携带菜豆几丁质酶基因的植物表达载体pBch 通过农杆菌介导法导入甘兰型油菜H165 中。经卡那霉素对T0 、T1 和T2 代植株进行连续的筛选和菌核病(sclerotiniasclerotinorium) 接种试验, 共获得33 株抗菌核病的T2 代植株。对其中的22 株进行PCR 检测, 从6 株扩增得到与菜豆几丁质酶基因大小对应的DNA 带型,Southern 杂交证实其中2 株呈现阳性结果, 表明外源基因已整合到油菜基因组中。对转化植株抗菌核病的接种试验及在菌核病高发区的种植试验表明, 含几丁质酶基因的转化体对菌核病具有抗性, 并已得到T3

蔊菜幼苗抗菌核病及抗旱和耐湿特性的鉴定

以3个甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品种‘中油821’(‘Zhongyou No.821’)、‘中双9号’(‘ZhongshuangNo.9’)及‘中油杂2号’(‘Zhongyouza No.2’)为对照,采用离体叶片菌丝块接种法、人工模拟干旱和湿害胁迫处理法对蔊菜〔Rorippa indica(L.)Hiern〕的抗菌核病〔Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary〕、抗旱和耐湿特性进行了鉴定。结果表明:菌核病菌接种后,蔊菜幼苗叶片的病斑直径为1.75 cm,极显著小于3个甘蓝型油菜品种的病斑直径(3.25～3.60 cm)。经干旱胁迫后,3个油菜品种的幼苗严重萎蔫,茎粗、根长以及地上部分、根和全株的鲜质量和干质量均极显著低于对照;蔊菜幼苗轻度萎蔫,仅茎粗和根鲜质量分别极显著和显著低于对照,其他生长指标与对照差异不显著;蔊菜幼苗各生长指标的伤害指数均显著或极显著低于3个油菜品种。经湿害胁迫后,蔊菜和3个油菜品种幼苗的总叶片数和绿叶数较对照明显减少、黄叶数增加,但蔊菜幼苗的黄叶数显著少于3个油菜品种;3个油菜品种幼苗的茎粗、根长以及地上部分、根和全株的鲜质量和干质量总体上显著或极显著低于对照,而蔊菜幼苗仅茎粗、根长和根干质量显著低于对照,其他生长指标与对照差异不显著;蔊菜幼苗的茎粗,根长,地上部分、根和全株的鲜质量以及根和全株的干质量的伤害指数均显著或极显著低于3个油菜品种。研究结果显示:蔊菜对菌核病的抗性及抗旱和耐湿性均强于供试的3个甘蓝型油菜品种,是十字花科(Brassiaceae)中对菌核病抗性强、抗旱耐湿的优质基因源。

芸薹属植物抗菌核病的研究进展

从芸薹属植物菌核病的发病原因、侵染过程及侵染方式,菌核病的致病机理和芸薹属植物的抗病机制等方面,以油菜为例综述菌核病的抗性遗传及抗菌核病的研究进展。

油菜抗菌核病材料宁RS-1的选育与利用

宁RS-1由甘蓝型油菜军农1号、3-67、Midas、Wesroona及花椰菜和白菜型油菜灌县花叶等亲本复合杂交育成。田间抗性鉴定结果表明,宁RS-1对油菜菌核病的相对抗病效果RRA和RRB分别为57.4%和55.7%,达到中抗水平;人工接种鉴定为低抗。利用宁RS-1为亲本,育成了多个双低油菜新品系以及宁杂花叶等双低抗病杂交油菜新组合,在各级产量鉴定试验中均表现良好。宁RS-1还被用于油菜菌核病抗性遗传与抗病基因分子标记研究。

抗菌核病双低油菜——中双9号

该品种是由中国农业科学院油料作物研究所利用高产、稳产、抗菌核病及广适应性的中油821作母本，双低优良品系84004作父本杂交，得到杂种F1，再以上述杂种F1作母本．双低常规品种中双4号作父本进行复合杂交，所获得的复合杂交F1，并对复合杂交后代的优良单株(株系)进行小孢子培养和染色体加倍培育的双低油菜品种。该品种2002年通过湖北省农作物品种审定委员会审定。

两种抗菌剂对油菜幼苗抗菌核病能力的影响

本试验以甘蓝型油菜渝黄1号为试材,分别用五种浓度的多菌灵溶液和五种浓度的百菌清溶液制成包衣剂,包衣处理油菜种子后,研究其对油菜幼苗抗菌核病能力的影响,并分析了不同浓度和不同种类的药品对油菜种子种子的萌发指数和幼苗的根茎长度、根系活力,电导率的影响。试验结果表明,0.45-0.71 g/L多菌灵和0.83-1.5 g/L百菌清都对提高甘蓝型油菜幼苗抗菌核病能力有作用,但综合比较得出:0.45-0.56 g/L效果最好,它既能提高幼苗的抗病能力又不会对幼苗生长产生不利影响。

油菜抗菌核病和抗逆相关基因的克隆和功能分析

主要研究成果： 油菜抗菌核病和抗逆相关基因的克隆 已经通过分子标记、突变体筛选、基因芯片、致病因子为诱饵蛋白的酵母双杂交等技术定位和克隆了20多个功能基因，其中4个基因有重要利用价值；发现了乙烯／茉莉酸信号途径及ROS在抗病中起主要作用；

油莱抗菌核病和抗逆相关基因的克隆与功能分析

课题目标、内容：本项目由中国农业科学院油料作物研究所刘胜毅研究员主持，参加单位包括华中农业大学、湖南农业大学、中国科学院遗传与发育研究所和江苏省农业科学院经济作物研究所。本项目主要通过功能基因组和比较基因组学等方法克隆油菜抗菌核病、磷高效、抗倒基因并研究这些基因的功能，获得有应用价值的功能基因。

拟南芥cDNA芯片和油菜-拟南芥比较作图相结合筛选甘蓝型油菜抗菌核病先验基因

以拟南芥cDNA芯片筛选核盘菌侵染时甘蓝型油菜的局部抗(耐)病相关基因,共获得在病斑周围局部组织中受核盘菌胁迫后表达变化达2倍以上的基因61个.这些基因中,36个基因为上升表达,25个基因为下降表达.RT-PCR和Northern杂交验证了部分芯片杂交筛选的结果, 表明拟南芥cDNA芯片可用于甘蓝型油菜基因转录谱的研究.结合油菜-拟南芥基因组比较作图, 将一些cDNA芯片筛选得到的油菜菌核病抗性相关基因定位于甘蓝型油菜抗菌核病QTL区间内. 取定位于QTL峰值区域的少数基因为先验基因,值得优先对这些基因进行深入研究.

扬州大学王幼平团队克隆到调控油菜菌核病抗性的关键基因

2024年6月13日,扬州大学王幼平教授团队在国际学术期刊Nature Communications在线发表了题为“Natural variation in BnaA07.MKK9 confers resistance to Sclerotinia stem rot in oilseed rape”的研究论文。该研究克隆了调控油菜菌核病抗性的关键基因BnaA07.MKK9并揭示该基因调控油菜菌核病性的分子机制。

用基于PCR的分子标记分析甘蓝型油菜抗感菌核病品系间的遗传距离

用离体叶接种法鉴定了甘蓝型油菜选系对菌核病的抗感性，结果表明绝大多数抗性品系与感病品种间的差异达到显著或极显著水平。以两种基于ＰＣＲ的标记估计所选１０ 份材料间的遗传距离。１９ 个随机引物扩增出了２６ 条重复性很好的ＲＡＰＤ 标记，１ 对依据植物Ｒ基因的ＮＢＳ区段设计的简并引物扩增出了３ 条多态性的带。依据２９ 个标记进行聚类分析，结果表明抗、感性材料在遗传距离为０．１２０６ 处被明显地区分开。５份抗性材料中，宁ＲＳ—１ 与中油８２１、中Ｒ８８８

甘兰型油菜品质性状的变化与抗(耐)菌核病的关系

经1987～1992年时甘兰型油菜品质资源田间自然抗病性的连续观察鉴定(包括同一品种不同品质的单株)和同一品种不同发病级别单株种子内芥酸、硫甙、油份等品质的测试分析。结果是油菜菌核病的发病程度与这些品质性状的关系密切。即抗病性的强弱与芥酸、硫甙的含量成正相关,与油份的含量成反相关,不同发病级别的单株种子与产油量成反相关。根据分析结果笔者认为,在进行双低油菜育种过程中,应将低代材料置于易于发生菌核病的环境中选择,在发病极度严重时还要注重保留那些耐病的单株,这是集优质、丰产、耐病为一体的有效途径。同时在优质油菜生产中要作好防病工作。

茎中可溶性色素水平法鉴评大豆资源对菌核病的部分抗性

为了快速、准确地筛选大豆耐菌核病候选资源,采用茎中可溶性色素水平测定法,评价了150份部分核心种质和国外种质及100份近15年东北育成品种的菌核病耐病性,并通过草酸浸根产生的植株萎蔫反应,验证了鉴定结果的准确性;同时,分析了花色(茎色)、叶形、生育期与耐病性的相关性。聚类分析将资源耐病性分为5个级别,分别是高耐(3.20%)、耐(7.60%)、中感(21.60%)、感病(46.00%)和高感(21.60%),并筛选出27份高耐病和耐病的候选资源,其中种质材料中具有相对较多的耐病性资源。草酸浸根植株萎蔫反应与茎中可溶性色素评价结果相符。耐病强度与农艺性状相关分析表明:叶形和生育期与耐病性不相关,但花色(茎色)与耐病性显著相关。可见,在反映草酸致病机制方面,茎中可溶性色素水平测定法能够进行大豆资源菌核病耐病性鉴定和评价;在遗传多态性丰富的大豆资源中可能会筛选到更多的耐菌核病的资源,可能多以紫花为主。