高脂饮食诱导肥胖大鼠生精障碍及睾丸支持细胞线粒体和内质网结构功能的改变

目的观察高脂饮食诱导肥胖对大鼠生精功能的影响及睾丸支持细胞线粒体和内质网结构功能改变,探讨肥胖致生精障碍的可能机制。方法将32只雄性SD大鼠随机分为对照组和模型组,对照组给予普通饮食,模型组给予高脂饲料喂养。20周模型复制成功后解剖,取附睾进行精子功能分析;血清酶联免疫吸附试验分析性激素水平变化;苏木精-伊红染色观察肝脏和睾丸组织病理改变;油红O染色观察肝脏和睾丸组织脂质沉积情况;免疫荧光染色法检测睾丸闭锁小带蛋白1(ZO-1)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及线粒体融合蛋白2(Mfn2)的定位及表达;Western blotting检测睾丸组织GRP78、Mfn2蛋白相对表达量;透射电镜观察睾丸支持细胞紧密连接及线粒体和内质网结构改变。结果模型组体重较对照组重(P<0.05),雌二醇较对照组高(P<0.05),睾酮较对照组低(P<0.05)。两组孕酮、泌乳素、促黄体生成素、卵泡刺激素比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组肝细胞脂肪变性明显,睾丸生精细胞排列稀疏,细胞变性,油红O染色均可见脂质沉积。对照组精子活力率高于模型组(P<0.05),畸形率低于模型组(P<0.05)。两组精子密度,直线速率和曲线速率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。模型组GRP78蛋白相对表达量较对照组高(P<0.05),Mfn2蛋白相对表达量较对照组低(P<0.05)。模型组睾丸支持细胞间紧密连接分离,紧密连接蛋白ZO-1表达较对照组减少;内质网和线粒体肿胀,呈空泡状,部分网膜断裂。结论高脂饮食诱导肥胖可引起大鼠生精障碍,其机制可能与睾丸支持细胞线粒体和内质网结构功能改变导致紧密连接损伤有关。

基于多组学解析布鲁氏菌BvfA对睾丸支持细胞线粒体NADH-泛醌氧化还原酶复合体的影响

【目的】明确布鲁氏菌BvfA对宿主睾丸支持细胞(TM4细胞)的损伤作用,以揭示布鲁氏菌对宿主的致病机制。【方法】利用RNA-Seq双端测序、Label-free蛋白组学技术和LC-MS非靶代谢组学技术分析感染布鲁氏菌S19△bvfA与S19菌株的TM4细胞的组学差异,采用KEGG数据库对差异表达蛋白及差异代谢物通路进行分析,并利用平行反应监测(PRM)对蛋白表达量进行验证。【结果】感染S19△bvfA和S19菌株的TM4细胞差异表达基因共400个,差异表达蛋白共422个,差异代谢产物共271种。多组学联合分析发现,S19△bvfA和S19菌株感染TM4细胞差异表达基因、差异表达蛋白和差异代谢产物共同富集的KEGG通路为内源性大麻素信号通路,在该通路中发现S19△bvfA菌株感染TM4细胞的线粒体NADH-泛醌氧化还原酶复合体(ComplexⅠ)中有20个蛋白表达量下调。PRM验证结果显示,ComplexⅠ中Ndufb11、Ndufa9、Ndufv1、Ndufv2、Ndufs8和Ndufs2蛋白的表达趋势与Label-free蛋白组学技术测定结果一致。【结论】BvfA在布鲁氏菌感染TM4细胞时能引起转录、蛋白质和代谢水平的变化,布鲁氏菌BvfA使睾丸支持细胞线粒体NADH-泛醌氧化还原酶复合体蛋白表达下调。

精氨酸及其代谢物抑制热应激诱导仔猪支持细胞凋亡的机制

旨在分析精氨酸及其代谢物在调节热应激诱导仔猪支持细胞凋亡中的作用。本试验选择3周龄健康雄性仔猪25只,采集睾丸并从中分离支持细胞,随机分为3组,每组3个重复。将体外培养的仔猪睾丸支持细胞在44℃条件下处理30 min作为热应激模型,质谱多重反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)氨基酸代谢物,添加外源精氨酸和精胺,运用流式细胞术检测细胞的凋亡率,使用Western blotting检测iNOS、BAX、FAS、ARG1,ODC和SSAT1的表达,通过荧光定量PCR检测Arg1、Arg 2和Odc mRNA水平,通过试剂盒检测精胺水平。结果显示,热应激显著降低了精氨酸(P<0.01)和瓜氨酸(P<0.05)水平,提高了腐胺(P<0.05)和鸟氨酸(P<0.01)水平,但精胺(P>0.05)水平无显著变化;热应激也显著增加了Inos(P<0.01)、Arg1(P<0.01)、Arg2(P<0.01)和Odc(P<0.05)mRNA的表达以及NO(P<0.01)的含量并导致细胞凋亡率上升(P<0.01)。添加0.05 mmol·L^(-1)外源精氨酸提高了热应激条件下SCs的活力(P<0.05)和精氨酸(P<0.01)含量,降低了BAX(P<0.05)和FAS(P<0.05)蛋白水平和相对凋亡率(P<0.01),同时也显著降低了iNOS(P<0.01)蛋白水平和NO(P<0.01)含量,提高了精胺(P<0.01)含量,缓解了热应激下SCs的凋亡(P<0.01);添加外源精胺也得到了类似的结果。以上结果表明,热处理通过增强Arg-NO代谢途径诱导SCs凋亡;添加外源性精氨酸和精胺可增强Arg-精胺代谢,减少NO的产生,从而抑制热应激诱导的SCs细胞凋亡。

益气解毒方对12 Gy^(60)Coγ射线诱导的支持细胞铁死亡的防护作用及机制研究

目的研究12 Gy^(60)Coγ射线对睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)铁死亡的影响,并探究益气解毒方干预对支持细胞铁死亡的防护机制。方法支持细胞分为空白(NC)组,模型(IR)组、铁死亡激动剂(Erastin)组、铁死亡抑制剂(Lip-1)组、益气解毒方高剂量(YQJD-H)组、益气解毒方低剂量(YQJD-L)组,分别按照相应的条件培养,除NC组和Erastin组外,其余各组细胞均使用12 Gy^(60)Coγ射线进行一次性照射,建立支持细胞辐射损伤模型。照射后24 h,用细胞计数试剂(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞活性;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;铁离子比色法检测细胞内Fe^(2+)水平;ELISA法检测细胞上清液高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein box-1,HMGB1)水平;JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位改变;实时荧光定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测细胞GPX4、ACSL4、LPCAT3 mRNA的表达。结果照射后24 h,与NC组比较,Erastin组和IR组支持细胞活性及线粒体膜电位均显著下降(P<0.01),ROS、Fe^(2+)、HMGB1水平均明显升高(P<0.01),GPX4 mRNA表达水平下降(P<0.05);IR组ACSL4、LPCAT3 mRNA表达水平升高(P<0.05)。与IR组比较,YQJD-H组、YQJD-L组、Lip-1组的细胞活性均显著升高(P<0.01),ROS、Fe^(2+)、HMGB1水平均明显降低(P<0.01);YQJD-H组GPX4 mRNA表达水平升高(P<0.05),ACSL4、LPCAT3 mRNA表达水平下降(P<0.05)。结论12 Gy^(60)Coγ射线诱导支持细胞发生铁死亡,而益气解毒方能减轻支持细胞铁死亡,起到辐射防护作用,其作用机制可能与GPX4/ACSL4/LPCAT3信号通路有关。

Bta-miR-101对牛睾丸支持细胞增殖、凋亡及分泌的影响

旨在探究bta-miR-101对牛睾丸支持细胞增殖、凋亡及分泌的影响。本研究采集3日龄(n=3)与13月龄(n=3)健康公牛的睾丸组织,构建安格斯牛组织表达谱,验证bta-miR-101在两个时期的差异表达。利用在线工具(TargetScan、miRTarBase、miRDB及miRWalk)预测miR-101的靶基因,并利用KOBAS对其进行GO和KEGG通路富集分析。将miR-101的模拟物与抑制物分别转染至牛睾丸支持细胞中,利用RT-qPCR、Western Blotting以及CCK-8等技术检测细胞增殖、凋亡及分泌相关基因表达量以及细胞增殖系数。通过4种在线软件预测到26个bta-miR-101的共同靶基因,GO和KEGG富集分析发现这些基因主要富集在核质、蛋白质结合、JAK-STAT的受体信号通路上,这些信号通路与细胞分化、细胞周期、细胞凋亡等生物过程有着不同程度的关联。RT-qPCR结果显示,bta-miR-101在牛初生期睾丸组织中的表达量显著高于性成熟时期(P<0.05),与实验室前期测序结果一致。转染miR-101的模拟物与抑制物后,发现相较于对照组,miR-101 mimics可以促进增殖相关基因在mRNA和蛋白水平的表达量,并显著升高支持细胞的增殖系数,同时抑制凋亡基因在mRNA和蛋白水平的表达量(P<0.05);miR-101 inhibitor可以抑制增殖相关基因在mRNA和蛋白水平的表达量,同时促进凋亡基因在mRNA和蛋白水平的表达量(P<0.05)。在细胞分泌方面,miR-101对分泌标志基因GDNF、BMP4的转录有影响,但对雄激素结合蛋白的分泌影响不显著。综上所述,miR-101促进牛睾丸未成熟支持细胞的增殖并抑制其凋亡,对雄激素结合蛋白的分泌无显著影响。

敲低锌转运蛋白ZIP7抑制小鼠睾丸支持细胞增殖的研究

目的探讨敲低锌转运蛋白ZIP7对小鼠睾丸支持细胞增殖的影响及其可能的作用机制。方法使用小鼠睾丸支持细胞系(TM4细胞)进行实验,TM4细胞培养后采用细胞免疫荧光染色法观察ZIP7在TM4细胞中的亚细胞定位;将TM4细胞分为对照组和ZIP7 siRNA组(采用siRNA转染敲低TM4细胞中ZIP7表达),采用CCK8法检测两组细胞的增殖能力,使用DHE荧光探针检测两组细胞内活性氧(ROS)的水平,实时荧光定量PCR(qPCR)检测两组细胞内ZIP7 mRNA的相对表达量,Western blot法检测两组细胞内ZIP7、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)及磷酸化ERK(p-ERK)蛋白表达水平。结果细胞免疫荧光染色法结果显示ZIP7定位于TM4细胞的内质网上。siRNA干扰使得ZIP7 siRNA组细胞中ZIP7的mRNA和蛋白表达显著低于对照组(P<0.05);siRNA转染敲低TM4细胞内ZIP7的表达后,ZIP7 siRNA组细胞增殖能力显著低于对照组(P<0.001),细胞内ROS水平显著高于对照组(P<0.001)。与对照组比较,ZIP7 siRNA组细胞的p-ERK/ERK蛋白表达无显著差异(P>0.05),而p-JNK/JNK蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论敲低ZIP7可以明显抑制TM4细胞增殖,该过程可能通过细胞内ROS水平的升高及JNK磷酸化的激活介导。

miR-542-3p生物信息学分析及对未成熟猪睾丸支持细胞的影响

为了探讨miR-542-3p的生物信息学信息及其对未成熟猪睾丸支持细胞的影响,试验通过AliBaba 2.1和AnimalTFDB 3.0软件预测miR-542-3p转录因子结合位点(TFBS);并分析miR-542-3p在不同物种间的保守性;采用CCK-8试剂、ATP试剂盒、流式周期检测试剂盒和实时荧光定量PCR方法探究过表达miR-542-3p对未成熟猪睾丸支持细胞的影响;利用TargetScan、miRDB和miWalk 3种在线软件预测miR-542-3p靶基因后取交集,并对猪源靶基因进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析;最后利用Cytoscape 3.2.0软件构建TF-miR-542-3p-靶基因相互作用网络。结果表明:经预测miR-542-3p受GATA1、TBP、Sp1、Ap1、SRF等多个转录因子调控,且在多物种间具有高度的保守性;miR-542-3p可显著或极显著抑制未成熟猪睾丸支持细胞增殖活性(P<0.05或P<0.01),极显著降低细胞内ATP含量(P<0.01),显著或极显著抑制细胞增殖基因和周期基因的相对表达量(P<0.05或P<0.01),进而抑制细胞周期和细胞增殖;转染miR-542-3p mimic后G1期猪睾丸支持细胞比例显著升高(P<0.05),S期细胞比例极显著降低(P<0.01);共发现7个猪源miR-542-3p潜在靶基因,miR-542-3p调控的UBE2E1基因相对表达量极显著下降(P<0.01),KCMF1、ILK基因相对表达量显著下降(P<0.05),HIPK3基因相对表达量极显著升高(P<0.01),AP3D1、PLEKHM3基因相对表达量显著升高(P<0.05),各靶基因主要在激酶活性和结合上发挥作用;miR-542-3p靶基因主要参与MAPK、cAMP、TGF-β和cGMP-PKG等信号通路;构建的TF-miR-542-3p-靶基因相互作用网络包含5个转录因子和50个mRNA。说明miR-542-3p受多种转录因子调控,在多物种间高度保守,能够抑制未成熟猪睾丸支持细胞增殖,并通过调控下游靶基因的表达参与MAPK、cAMP和TGF-β等信号通路,从而调控未成熟猪睾丸支持细胞生长。

异亮氨酸缓解猪睾丸支持细胞氧化应激作用

目的:研究异亮氨酸缓解过氧化氢诱导的猪睾丸支持细胞氧化应激的保护作用,并确定不同浓度异亮氨酸对缓解氧化应激导致的睾丸支持细胞活力下降的最佳浓度,及最佳异亮氨酸浓度对猪睾丸支持细胞的增殖、凋亡和抗氧化水平的影响。方法:利用CCK-8法检测细胞活力,筛选在氧化应激模型下异亮氨酸保护猪睾丸支持细胞的最适浓度。应用流式细胞术检测最适异亮氨酸浓度下支持细胞的周期和凋亡情况。应用试剂盒检测总超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,T-SOD)、总抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity,T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-Px)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的表达量。结果:与氧化应激丙氨酸等氮对照组和其他浓度氧化应激异亮氨酸组相比,32 mmol/L氧化应激异亮氨酸组细胞增殖活力显著升高。与氧化应激不加药组和氧化应激丙氨酸等氮对照组相比,氧化应激异亮氨酸组细胞分化G_(0)/G_(1)期比例相对较低,S期和G_(2)/M期比例无明显差异。与氧化应激不加药组相比,氧化应激异亮氨酸组细胞凋亡比例呈显著降低,与氧化应激等氮对照组相比,氧化应激异亮氨酸组细胞凋亡比例无明显差异。与无氧化应激丙氨酸等氮对照组和氧化应激丙氨酸对照组相比,异亮氨酸极显著增强T-SOD的活性,也极显著增加氧化应激异亮氨酸组T-AOC,而对GSH-Px和MDA没有显著影响。结论:在本试验条件下32 mmol/L异亮氨酸效果最佳,有效缓解氧化应激导致的细胞活力下降、细胞周期紊乱和细胞凋亡。

睾丸非特殊型支持细胞瘤3例临床病理分析

目的探讨睾丸非特殊型支持细胞瘤(sertoli cell tumor,SCT)的临床特点、免疫表型、影像学表现、诊断及鉴别诊断。方法回顾性分析3例睾丸非特殊型SCT的临床病理资料,采用免疫组化法对睾丸非特殊型SCT进行检测,并复习相关文献。结果睾丸非特殊型SCT好发于年轻男性,平均发病年龄33岁,肿瘤界限相对清楚,肉眼可见肿瘤呈实性或囊实性,镜下形态以中空或实性小管状结构伴不同程度的纤维间隔为主要特征,胞质淡染或嗜酸性,细胞无明显异型性。免疫表型:肿瘤细胞WT-1、CD56、SOX9、vimentin、β-catenin、AR、Cyclin D1、CD10和CK(AE1/AE3)均阳性,α-inhibin、Calretinin、PAX-8、OCT3/4和D2-40均阴性。结论睾丸非特殊型SCT是一类相对少见的肿瘤,联合β-catenin、Cyclin D1及CD10等多种抗体标记,可以辅助诊断及鉴别诊断。

竹节参总皂苷减轻高脂饮食诱导的小鼠睾丸支持细胞连接功能损伤

目的探究竹节参总皂苷(TSPJ)对高脂饮食诱导的小鼠睾丸支持细胞功能损伤的保护作用及机制。方法将40只C57BL/6J雄性小鼠随机分为正常饮食组、高脂饮食组、TSPJ低剂量(25 mg/kg)组和TSPJ高剂量(75 mg/kg)组,10只/组。正常饮食组给予普通饲料喂养,其余组均给予高脂饲料喂养,TSPJ连续灌胃给药5月,小鼠称重处死,取出睾丸和附睾组织称重并计算其指数;取附睾组织进行精液分析;HE染色观察小鼠睾丸组织形态变化,测量统计生精上皮厚度与生精小管直径;Western blot检测睾丸支持细胞紧密连接功能蛋白ZO-1、Occludin和Claudin11以及外质特化功能蛋白N-cadherin、E-cadherin和β-catenin的表达水平;免疫荧光法检测睾丸组织中ZO-1和β-catenin蛋白定位及表达;免疫荧光双标法检测睾丸支持细胞中LC3B、p-AKT和p-mTOR表达变化。结果与高脂饮食组相比,TSPJ能明显减轻高脂饮食小鼠体质量(P<0.001),增加睾丸和附睾指数(P<0.05,P<0.01),提高精子浓度与精子活率(P<0.05,P<0.01),改善睾丸组织形态异常,增加生精上皮厚度(P<0.05,P<0.001),但对生精小管直径无明显影响。Western blot结果显示,TSPJ能增加ZO-1、Occludin、N-cadherin、E-cadherin和β-catenin的蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01,P<0.001),但对Claudin11的表达无显著性影响;免疫荧光结果显示,TSPJ能增加睾丸组织中ZO-1和β-catenin蛋白的表达(P<0.001),下调睾丸支持细胞中LC3B的表达,上调p-AKT和p-mTOR蛋白表达。结论TSPJ能减轻高脂饮食诱导的睾丸支持细胞连接功能损伤,改善小鼠生精功能减退,其机制可能与激活支持细胞AKT/mTOR信号通路抑制自噬有关。

微囊藻毒素亮氨酸精氨酸(MC-LR)损伤睾丸支持细胞免疫反应及细胞生物学行为的机制研究进展

微囊藻毒素亮氨酸精氨酸(MC-LR)是水华爆发时微囊藻属、鱼腥藻属等蓝藻产生的一种对人类有致癌性的藻毒素。MC-LR可对雄性动物生殖系统产生毒性,导致不育,主要表现为诱导细胞凋亡、破坏细胞骨架、干扰DNA损伤修复途径或损伤血睾屏障(BTB)功能等。睾丸支持细胞(Sertoli细胞)是生精小管中与生精细胞直接接触的体细胞,可通过分泌多种细胞因子和免疫抑制因子调节免疫反应以维持睾丸免疫稳态,亦可与邻近生殖细胞形成BTB,为各级生精细胞提供营养、支持和保护作用的微环境。MC-LR可引发睾丸Sertoli细胞炎症、诱导细胞凋亡、破坏BTB完整性,进而造成睾丸生精功能障碍。

基于转录组学研究双酚A对猪睾丸支持细胞炎症和氨基酸代谢通路的影响

旨在研究猪睾丸支持细胞(ST)暴露于环境雌激素双酚A(BPA)不同时间后的基因表达谱变化。本研究将猪ST细胞设为C、B两组,每组设置3个重复,C组为空白对照组,B组细胞暴露于50μmol·L^(-1)浓度的BPA。BPA暴露6、24 h后,收集C6、B6、C24、B24组细胞总RNA样品,构建测序文库,通过双端150 bp测序方法进行高通量转录组测序。对组装数据进行功能注释、差异基因分析以及GO和KEGG富集分析。通过Real-time PCR方法对关键差异基因表达进行验证。BPA暴露24 h后差异基因数量(6928个)较BPA暴露6 h差异基因数量(3940个)明显增加。编码分泌型磷蛋白1的SPP1基因在BPA暴露6 h后表达增加,但在BPA暴露24 h后表达降低。管腔结合蛋白编码基因BIP、泛素B编码基因UBB、泛素C编码基因UBC、鸟氨酸脱羧酶1编码基因ODC1表达量在BPA暴露6和24 h后均显著上调。富集分析结果表明,BPA暴露6 h后,TNF信号通路富集差异倍数最高,p53、IL-17以及MAPK信号通路等也均显著富集,暗示ST细胞表现出明显的促炎反应。在BPA暴露24 h后,氨基酸及糖代谢通路富集差异倍数最高,包括精氨酸和脯氨酸、组氨酸以及糖酵解代谢通路。Real-time PCR验证结果显示,BPA暴露6 h后炎性反应通路相关的PTGS2等以及BPA暴露24 h后氨基酸代谢通路相关ARG1等差异基因表达显著上调。综上可知,BPA对猪睾丸支持细胞的损伤机制呈现明显的时间效应,ST细胞在BPA暴露初期表现出以TNF等信号通路激活为特征的炎性反应,在BPA暴露后期氨基酸及糖代谢显著激活。

雌激素受体α下调导致小鼠睾丸TM4支持细胞连接功能损伤的作用机制

目的探究雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)下调导致的小鼠睾丸TM4支持细胞连接功能损伤是否与自噬相关。方法不同浓度ERα抑制剂ICI182780(ICI)处理TM4细胞,CCK-8法检测细胞增殖活性;将细胞分为正常对照组、不同浓度ICI处理组。光镜观察细胞数量及形态变化;Western blot法检测ERα蛋白、连接功能相关蛋白、自噬标志物蛋白表达变化;免疫荧光法检测缝隙连接蛋白43(Cx43)表达与定位;氯喹(chloroquine,CQ)与ICI联合作用细胞24 h,Western blot法检测自噬及连接功能相关蛋白表达水平。结果ICI 50 nmol·L^(-1)及以上浓度时,细胞活力明显下降;光镜观察ICI组细胞空泡增多;与正常对照组相比,ICI用药组ERα、闭锁小带蛋白1(ZO-1)、闭锁蛋白(occludin)、紧密连接蛋白11(claudin-11)、β-联蛋白(β-catenin)及Cx43表达水平均下降,而神经钙黏蛋白(N-cadherin)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)表达无明显变化;微管相关蛋白轻链3(LC3)上升,p62表达下降;免疫荧光结果显示,ICI用药组Cx43荧光表达量明显下降,位置无明显变化;与ICI组相比,CQ+ICI组LC3Ⅱ、p62、ZO-1、β-catenin、Cx43表达水平均上升。结论ERα下调可导致TM4细胞连接功能损伤,其机制可能与激活自噬有关。

线粒体调控在玉米赤霉烯酮与脱氧雪腐镰刀菌烯醇联合染毒诱导仔猪睾丸支持细胞内质网途径凋亡中的作用

本试验旨在研究线粒体在玉米赤霉烯酮(ZEA)与脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)联合染毒诱导仔猪睾丸支持细胞(SCs)内质网途径凋亡中的调控作用机制。将对数生长期仔猪SCs分为对照、ZEA+DON、线粒体分裂抑制因子-1(Mdivi-1)和ZEA+DON+Mdivi-14个处理,处理24 h后,采用荧光显微镜观察细胞存活率,采用透射电镜检测细胞超微结构、线粒体及内质网形态变化,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞内质网途径凋亡相关基因蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、活化转录因子4(ATF4)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和真核生物翻译起始因子2α(eIF2α)mRNA相对表达量,并采用蛋白质印迹法(Western blot)检测内质网途径凋亡相关蛋白PERK、ATP4、CHOP和eIF2α蛋白相对表达量。结果表明:1)与ZEA+DON处理相比,添加Mdivi-1可极显著提高细胞存活率(P<0.01),缓解细胞、线粒体及内质网结构损伤。2)与对照处理相比,Mdivi-1处理细胞凋亡率无显著差异(P>0.05),而ZEA+DON处理和ZEA+DON+Mdivi-1处理细胞凋亡率极显著提高(P<0.01);但与ZEA+DON处理相比,ZEA+DON+Mdivi-1处理细胞凋亡率极显著降低(P<0.01)。3)与对照处理相比,ZEA+DON处理和ZEA+DON+Mdivi-1处理PERK、ATF4、CHOP及eIF2αmRNA相对表达量和蛋白相对表达量极显著提高(P<0.01);但与ZEA+DON处理相比,ZEA+DON+Mdivi-1处理PERK、ATF4、CHOP、eIF2αmRNA相对表达量和蛋白相对表达量显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。由此可知,线粒体通过内质网途径在ZEA与DON联合染毒仔猪SCs凋亡中发挥重要作用,干预该过程可为霉菌毒素的生殖毒性危害解除提供新思路。

SMAD6对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的影响

睾丸未成熟支持细胞的增殖活性对种公畜繁殖性能有重要影响,睾丸基因组DNA甲基化(5mC)不同发育阶段特异性引起的基因差异表达可以调控支持细胞的增殖活性。在课题组前期研究中,SMAD6被鉴定出是睾丸发育过程中受3′UTR甲基化水平调控的枢纽基因之一,但其生物学功能尚未被发掘。本研究旨在探究SMAD6对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的作用。在体外培养的猪未成熟支持细胞中过表达SMAD6或干扰SMAD6表达后,检测细胞周期和增殖相关基因的相对表达量、细胞增殖情况、细胞ATP水平、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的表达情况。结果显示:过表达SMAD6后细胞周期及增殖相关基因的相对表达量上升(P<0.05或P<0.01)、细胞增殖增加(P<0.05或P<0.01)、细胞ATP水平升高(P<0.01)、细胞的凋亡率下降(P<0.05)、促凋亡相关蛋白BAX和Caspase3的表达降低(P<0.05);干扰SMAD6表达结果则与之相反。研究结果提示,SMAD6促进猪未成熟支持细胞的增殖且抑制其凋亡。

BMP4在牦牛和犏牛睾丸组织及支持细胞中的差异表达分析

【目的】从牦牛和犏牛睾丸组织中分离培养支持细胞,检测骨形态发生蛋白4基因(BMP4)及其受体基因在牦牛、犏牛睾丸组织及支持细胞中的表达情况,为深入研究BMP4对犏牛精子发生过程的作用提供理论基础。【方法】采集12月龄牦牛和犏牛睾丸组织,使用Trizol法提取各睾丸组织总RNA,利用RT-PCR技术检测BMP4及其受体基因(骨形态发生蛋白受体1B型(ALK6)、骨形态发生蛋白受体2型(BMPR2)、激活素A受体2A型(ACVR2A)、激活素A受体2B型(ACVR2B))的mRNA表达水平。通过两步酶法消化睾丸组织制备细胞悬液,经差速贴壁、饥饿处理和胰酶消化分离纯化牦牛和犏牛睾丸支持细胞。采用HE染色、油红O染色、碱性磷酸酶(ALP)染色、免疫荧光染色鉴定支持细胞,用Trizol法提取细胞总RNA,RT-PCR检测支持细胞、生精细胞、间质细胞、类肌细胞标志基因和BMP4及其受体基因的mRNA表达水平。采用实时荧光定量PCR检测BMP4及其受体基因在牦牛和犏牛睾丸支持细胞中的差异表达情况。【结果】HE染色结果显示,第3代(F3)支持细胞呈长条形或梭形。油红O染色结果显示,体外培养的细胞胞质中有明显脂滴积累,且在细胞核内可观察到支持细胞特有的双极小体结构。ALP染色结果显示,细胞不着色。免疫荧光染色结果显示,支持细胞标志蛋白GATA结合蛋白4(GATA4)呈阳性表达。RT-PCR检测结果显示,支持细胞标志基因BMP4、SRY-box转录因子9基因(SOX9)、波形蛋白基因(Vimentin)、Wilm肿瘤抑制基因(WT1)、FAS细胞表面死亡受体基因(FAS)和胶质细胞源性神经营养因子基因(GDNF)存在明显表达,而生精细胞标志基因出局区解旋酶4(DDX4)和类肌细胞标志基因半胱氨酸的血管生成诱导剂61(CYR61)无明显表达,间质细胞标志基因细胞色素P450家族11亚家族A成员1(CYP11A1)则有少量表达。BMP4在牦牛和犏牛睾丸支持细胞中都有表达,且在牦牛支持细胞中的表达量显著高于犏牛支持细胞,而其受体基因ALK6、BMPR2、ACVR2A和ACVR2B在牦牛支持细胞中的表达量显著或极显著低于犏牛支持细胞。【结论】从牦牛和犏牛睾丸组织中分离获得支持细胞,BMP4在牦牛支持细胞中表达量较高,暗示BMP4对犏牛精子发生具有潜在调控作用。

ssc-miR-152生物信息学及对未成熟猪睾丸支持细胞功能的分析

为研究ssc-miR-152生物信息学特征及对未成熟猪睾丸支持细胞功能的影响,本研究通过NCBI数据库确定ssc-miR-152在猪基因组中的位置,通过MethPrimer和EMBOSS在线软件分析ssc-miR-152上游序列CpG岛,使用Netural Network Promoter Predictio和Promoter-2.0预测其启动子区域,结合AliBaba 2.1和AnimalTFDB3.0软件预测其转录因子结合位点;Clustal W软件分析ssc-miR-152在物种间的保守性,采用CCK-8、流式细胞术和实时荧光定量PCR技术检测细胞增殖、周期及凋亡情况,运用miRanda、EIMMO、TargetScan和PITA在线软件预测ssc-miR-152的靶基因并取交集,并对预测的靶基因进行GO功能及KEGG通路分析,最后利用Cytoscape构建TF-miRNA-mRNA互作网络。结果表明:ssc-miR-152位于猪12号染色体反义链的24 292 249~24 292 328位置,其转录起始位点在上游序列200 bp处,启动子范围为393~4 619,并在该范围内存在1个CpG岛,且有RELA、SP1、SRF、IRF1和EGR1等多个转录因子调控ssc-miR-152的表达。同时发现ssc-miR-152具有高度保守性,在未成熟猪睾丸支持细胞中过表达ssc-miR-152后增强细胞增殖活性、加快细胞的周期进程、抑制细胞凋亡率。互作网络显示ssc-miR-152可调控下游NOG、S1PR1和FBN1等多个基因,参与TGF-β、PI3K/AKT和FoxO等信号通路。本研究说明,ssc-miR-152对未成熟猪睾丸支持细胞生长发育有重要作用,本研究为后续进一步探索未成熟猪睾丸支持细胞机理并对雄性精子发生机理提供理论科学依据。

ALOX15B-JNK在热应激诱导支持细胞氧化应激和凋亡中的作用

旨在研究花生四烯酸脂氧合酶15B(arachidonate lipoxygenase type B,ALOX15B)是否参与了热应激条件下丙二醛(malondialdehyde,MDA)与活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成,进而调控睾丸支持细胞凋亡,以及JNK信号通路(jun amino terminal kinase,JNK)是否在这一过程中发挥了作用。本研究从20只3周龄的三元杂交仔猪的睾丸组织中分离出支持细胞,随机分为3组,每组3个重复,将体外培养的仔猪睾丸支持细胞在44℃条件下处理30 min作为热应激模型,分别转染ALOX15B的siRNA、添加ALOX15B抑制剂(黄芩素)或JNK抑制剂后,运用流式细胞术检测细胞的凋亡率,使用Western blotting检测磷酸化JNK、ALOX15B和p53的蛋白表达,利用ELISA检测8-HETE与15-HETE的含量,采用试剂盒检测MDA和ROS的水平。结果显示,与单独的热应激组相比,黄芩素和热应激联合处理减少了8-HETE和15-HETE的含量(P<0.01),降低了MDA和ROS的水平(P<0.01),抑制了热应激诱导的细胞凋亡率(P<0.01);在热应激条件下,黄芩素和ALOX15B的siRNA均抑制了热应激诱导的JNK的磷酸化(P<0.01);JNK抑制剂SP600125可抑制热应激条件下p53的表达水平(P<0.01),降低细胞凋亡率(P<0.01)。与单独的热应激组相比,SP600125和热应激联合处理反馈抑制了ALOX15B的表达(P<0.01),减少了脂质过氧化物8-HETE(P<0.01)与15-HETE的含量(P<0.05),降低了MDA和ROS的水平(P<0.01)。这表明,在热应激条件下,ALOX15B使MDA和ROS的水平升高,诱导了支持细胞凋亡,JNK通过激活p53参与了ALOX15B调节的支持细胞凋亡;JNK可反馈调节ALOX15B、8-HETE、15-HETE、MDA和ROS的水平。

抑制猪支持细胞外泌体对精原干细胞自我更新及分化的影响

[目的]本文利用体外模型检测猪支持细胞分泌外泌体的能力及其对猪精原干细胞(porcine spermatogonial stem cells,pSSC)自我更新及分化状态的影响。[方法]通过两步酶消化法分离猪支持细胞和pSSC并建立猪支持细胞-pSSC体外共培养模型,抑制猪支持细胞外泌体的分泌,检测pSSC自我更新及分化指标,研究支持细胞外泌体对pSSC命运的影响。[结果]分离得到的支持细胞的Wilm肿瘤蛋白1(WT1)阳性率为(87.1±0.02)%,整合素β-1蛋白(ITGB1)阳性率为(94.2±0.01)%,分离得到pSSC的早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF)阳性率为(80.6±0.02)%;通过Western blot分析、免疫荧光检测证实支持细胞外泌体的存在;证实20μmol·L^(-1)GW4869可以抑制外泌体分泌且不损害支持细胞;GW4869处理后的支持细胞与pSSC共培养发现试验组较对照组pSSC状态差异较为明显,且RT-PCR结果显示猪精原干细胞PLZF基因表达水平显著升高;肥大/干细胞生长因子受体基因(KIT)、胸腺细胞抗原1基因(THY1)、死盒解旋酶4基因(DDX4)表达水平显著降低;Western blot结果显示猪精原干细胞蛋白基因产物9.5(PGP9.5)蛋白表达水平升高,DDX4蛋白表达水平降低。[结论]体外培养时支持细胞分泌的外泌体对pSSC自我更新和分化均具有调控作用,暗示外泌体是支持细胞调控精原干细胞命运的一种重要方式,这为种公猪生殖力的改善提供了新思路。

神经生长因子对脂多糖引起的奶山羊支持细胞毒性抵抗研究

为探究神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)对奶山羊支持细胞(Sertoli cells,SCs)的保护作用及机制,提取原代奶山羊SCs后用NGF处理,CCK-8检测发现,100~400 ng/mL的NGF能够显著提高细胞活力(P<0.05);此外,1000 ng/mL脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)处理SCs 24 h后细胞活力达到半数抑制效果。乳酸脱氢酶检测结果显示,NGF能够抑制LPS对SCs的毒性,其中,200 ng/mL NGF与LPS共处理6、12、24 h后,细胞毒性显著低于对照组(P<0.05),且200 ng/mL NGF对LPS的细胞毒性抵抗效果最佳。Western blot结果表明,NGF能够抑制LPS激活的PI3K/AKT/NFκB信号通路。综合以上研究,NGF能够通过PI3K/AKT/NFκB信号通路抑制LPS对SCs的细胞毒性。