水苏碱调节Hippo-YAP信号通路对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护作用

目的探究水苏碱(stachydrine,STA)对缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)新生大鼠的神经保护作用,并分析其作用机制。方法将新生SD大鼠随机分为假手术组、HIBD组、STA低剂量(5 mg/kg)组、STA中剂量(10 mg/kg)组、STA高剂量(20 mg/kg)组、维替泊芬(10 mg/kg)+STA高剂量(20 mg/kg)组,除假手术组外,其余大鼠构建HIBD大鼠模型。对各组大鼠进行神经功能缺损评分,采用Morris水迷宫实验进行认知功能评价,测定各组大鼠脑含水量和脑指数,HE染色、尼氏染色观察脑组织神经元损伤,TUNEL染色观察脑组织神经元细胞凋亡情况,Western blot法检测YES相关蛋白(YES associated protein,YAP)、p-YAP、哺乳动物STE20样蛋白激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)、p-MST1、具有PDZ基序的转录共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)蛋白表达。结果与假手术组比较,HIBD组海马组织损伤加重,尼氏小体减少(P<0.05),神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织含水量、脑指数、神经元细胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值显著增加(P<0.05),穿越平台次数、TAZ表达显著降低(P<0.05);与HIBD组相比,STA低、中、高剂量组海马组织损伤改善,尼氏小体增加(P<0.05),神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织含水量、脑指数、神经元细胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值显著降低(P<0.05),穿越平台次数、TAZ表达显著增加(P<0.05);与STA高剂量组相比,维替泊芬+STA高剂量组海马组织损伤加重,尼氏小体减少(P<0.05),神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织含水量、脑指数、神经元细胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值显著增加(P<0.05),穿越平台次数、TAZ表达显著降低(P<0.05)。结论STA可能通过调控Hippo-YAP信号通路、减少神经损伤和神经元细胞凋亡、改善神经功能,发挥对HIBD新生大鼠的神经保护作用。

常压高浓度氧对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤与Nrf2/HO-1信号通路的影响分析

目的探究常压高浓度氧(NBO)对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤及核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路的影响。方法取新生SD大鼠45只,采用随机数字表法分为常氧组、NBO组和NBO+Nrf2激活剂组,每组各15只。常氧组大鼠置于普通空气(21%氧气)中饲养,NBO组和NBO+Nrf2激活剂组大鼠置于90%常压氧气饲养,NBO+Nrf2激活剂组每日灌胃5 mg/kg Nrf2激动剂莱菔硫烷。测定脑组织伊文思蓝(EB)含量,采用酶联免疫法检测血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)含量,干湿重法检测脑组织含水量,HE染色和TUNEL染色观察脑组织病理变化,蛋白质印迹法检测海马组织Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达,水迷宫检测大鼠认知功能。结果与常氧组比较,NBO组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。病理染色结果显示,常氧组大鼠神经细胞形态及结构完整,未见明显病理变化和细胞凋亡;NBO组神经细胞形态及结构不规则,出现明显的水肿和空泡,并伴有大量的凋亡细胞;NBO+Nrf2激活剂组脑组织病理损伤较NBO组明显减轻。与常氧组比较,NBO组脑组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组Nrf2、HO-1蛋白相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与常氧组比较,NBO组第2~4天逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组第2~4天逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NBO可诱导新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤,导致远期认知功能障碍,可能与下调Nrf2/HO-1信号通路表达有关。

右美托咪定对依托咪酯麻醉新生大鼠海马PI3K/Akt信号通路的影响

目的研究右美托咪定在新生大鼠海马区域依托咪酯麻醉条件下对PI3K/Akt信号传导途径的影响。方法选取雄性SD大鼠80只,依据随机数字表法随机分为8组,每组10只,按照不同处理方式分别记作N组(生理盐水)、I组(脂肪乳剂)、D组(二甲基亚砜)、E组(依托咪脂60 mg/kg)、DE-1组(右美托咪定25μg/kg+依托咪脂60 mg/kg)、DE-2组(右美托咪定50μg/kg+依托咪脂60 mg/kg)、DE-3组(右美托咪定75μg/kg+依托咪脂60 mg/kg)、LY294002组(LY294002+右美托咪定75μg/kg+依托咪脂60 mg/kg)。于大鼠苏醒2 h后,每组取5只用透射电镜观察海马神经元的形态学变化,剩余5只采用Western blot法检测各组海马Akt和pAkt(ser473)蛋白含量。结果8组大鼠Akt蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。相较于E组、I组、D组,DE-1组、DE-2组、DE-3组和LY294002组pAkt(ser473)蛋白含量更低(P<0.05);与E组比较,DE-1组、DE-2组、DE-3组和LY294002组pAkt(ser473)蛋白含量更高于E组(P<0.05);与DE-3组比较,DE-1组、DE-2组、LY294002组pAkt(ser473)蛋白含量更低于DE-3组(P<0.05);LY294002组pAkt(ser473)蛋白含量高于DE-1组(P<0.05)。大鼠海马神经元细胞结构损伤随着右美托咪定剂量的增加而减轻。结论右美托咪定可能通过减轻对PI3K/Akt信号通路的抑制作用,来缓解依托咪酯对发育期大鼠海马神经元造成的损伤。

褪黑素通过PI3K/AKT通路减轻缺氧缺血性脑损伤新生大鼠大脑皮层神经细胞自噬的研究

目的 观察褪黑素(melatonin,Mel)对缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)新生大鼠大脑皮层神经细胞自噬的影响,并从PI3K/AKT信号通路探讨其机制,为Mel的临床应用提供依据。方法 将7日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为假手术组、HIBD组及Mel组(各组n=9)。采用经典RiceVannucci法构建新生大鼠HIBD模型。采用苏木精-伊红和尼氏染色法观察新生大鼠大脑皮层神经细胞形态;免疫荧光染色和Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3)及Beclin-1蛋白表达水平;免疫组化和Western blot法检测磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylated phosphoinositide 3-kinase,p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B (phosphorylated protein kinase B,p-AKT)蛋白表达水平;通过Pearson相关性分析探讨Mel组与HIBD组自噬与PI3K通路的相关性。结果 建模后24h,假手术组新生大鼠大脑皮层神经细胞大小形态正常、排列规则,HIBD组神经细胞胞体肿胀、排列不规则,Mel组神经细胞排列较规整、形态相对正常。假手术组尼氏小体形态规整,HIBD组尼氏小体形态异常,Mel组尼氏小体形态尚规整。HIBD组LC3及Beclin-1平均荧光强度较假手术组增加,Mel组较HIBD组减少(P<0.05)。HIBD组p-PI3K^(+)、pAKT^(+)细胞数较假手术组减少,Mel组较HIBD组增加(P<0.05)。HIBD组LC3、Beclin-1蛋白表达水平较假手术组增加,p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平较假手术组减少(P<0.05);Mel组LC3、Beclin-1蛋白表达水平较HIBD组减少,p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平较HIBD组增加(P<0.05)。相关性分析显示,Mel组与HIBD组损伤侧大脑皮层LC3、Beclin-1蛋白平均荧光强度差值与p-PI3K^(+)、p-AKT^(+)细胞数差值均呈负相关(P<0.05)。结论 Mel可抑制HIBD新生大鼠大脑皮层神经细胞过度自噬,从而减轻HIBD,其机制与PI3K/AKT通路相关。

鸢尾素对新生大鼠高胆红素血症细胞凋亡的影响

目的:探究鸢尾素对新生大鼠高胆红素血症细胞凋亡的影响。方法:将96只新生SD大鼠随机分为对照组(N组)和模型组(M组),于7和10日龄腹腔注射胆红素溶液进行造模。造模成功后将M组随机分为T0组、T1组、T2组、T3组。T1、T2、T3组分别侧脑室注射40、60和80μg/kg的鸢尾素溶液,余各组注射等量磷酸盐缓冲液溶液。侧脑室注射24h后,神经行为学、苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining,HE)、原位末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,Tunel)检测海马区病理改变并统计凋亡率,Western Blot检测海马Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相对表达量。结果:侧脑室注射鸢尾素后。平面翻正反射:T3组所需时间少于T0、T1、T2组且多于N组(P<0.01);负趋地性反射:T3组所需时间少于T0、T1、T2组(P<0.01,P<0.05)。HE染色:M组海马神经细胞核固缩、裂解,排列紊乱。T1、T2、T3组细胞形态等不同程度改善。Tunel染色:M组Tunel+细胞增多,布满视野;N组Tunel+细胞少,呈零星分布;T3组凋亡率低于T0、T1组(P<0.05)。Western Blot:各组Bcl-2蛋白相对表达量无显著性意义(P>0.05);T0组Bax蛋白高于其余各组(P<0.05),T3组低于T1组(P<0.05);T0组Bcl-2/Bax值低于N、T3组(P<0.05),T1、T2组均低于T3组(P<0.05);T0组Caspase-3蛋白高于其余各组(P<0.05),N组低于T1组(P<0.05),T1组高于T3组(P<0.05)。结论:鸢尾素可能通过减少Bax、Caspase-3蛋白表达,升高Bcl-2/Bax值来减轻神经细胞凋亡且与鸢尾素注射剂量相关。

不同剂量人脐带间充质干细胞移植对新生大鼠脑白质损伤的修复作用

目的比较不同剂量人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)对新生大鼠脑白质损伤(white matter injury,WMI)的修复作用。方法将2日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为5组:假手术组、WMI组和hUC-MSCs组(低剂量组、中剂量组、高剂量组),每组24只。成功制备新生大鼠WMI模型24 h后,WMI组经侧脑室注射无菌PBS,hUC-MSCs组注射不同剂量hUC-MSCs。造模后14 d、21 d,采用苏木精-伊红染色法观察各组侧脑室周围组织病理变化,实时荧光定量聚合酶链式反应法检测各组脑组织中髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)mRNA表达水平,免疫组化法观察GFAP、神经元核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)在侧脑室周围组织表达水平;TUNEL染色观察各组侧脑室周围组织细胞凋亡情况。造模后21 d,采用Morris水迷宫实验观察各组新生大鼠的空间学习记忆能力。结果造模后14 d、21 d,WMI组和低剂量组侧脑室周围组织均可见大量细胞核固缩、核破裂,神经纤维排列紊乱,与WMI组比较,中、高剂量组上述病理改变均减轻;与高剂量组比较,中剂量组神经纤维排列相对整齐。与WMI组比较,低剂量组MBP、GFAP mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05),中、高剂量组MBP mRNA表达水平升高,GFAP mRNA表达水平降低;中剂量组MBP mRNA表达水平高于高剂量组,中剂量组GFAP mRNA表达水平低于高剂量组(P<0.05)。与WMI组比较,低剂量组GFAP、NeuN阳性表达差异无统计学意义(P>0.05),中、高剂量组NeuN阳性表达升高,GFAP阳性表达降低(P<0.05);中剂量组NeuN阳性表达高于高剂量组,GFAP阳性表达低于高剂量组(P<0.05)。与WMI组比较,低剂量组凋亡细胞数差异无统计学意义(P>0.05),中、高剂量组凋亡细胞数少于WMI组(P<0.05);中剂量组凋亡细胞数少于高剂量组(P<0.05)。与WMI组比较,低剂量组逃避潜伏期时间差异无统计学意义(P>0.05);自潜伏期第3天开始,中剂量组逃避潜伏期时间少于WMI组(P<0.05);中、高剂量组穿越平台次数多于WMI组(P<0.05)。结论低剂量hUC-MSCs对新生大鼠WMI修复效果欠佳,中、高剂量hUC-MSCs均有修复作用,中剂量效果更优。

2-甲氧基雌二醇对新生大鼠缺氧性肺动脉高压的保护作用

目的探讨2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME)在新生大鼠缺氧性肺动脉高压中的保护作用。方法96只Wistar新生大鼠随机分为常氧组、缺氧组和缺氧+2ME组,每组随机分为3 d、7 d、14 d、21 d亚组,每个亚组8只。缺氧组和缺氧+2ME组分别予以每日皮下注射生理盐水和2ME(剂量240μg/kg),常氧组在常氧环境下饲养,每日皮下注射生理盐水。直接测压法测量右心室收缩压(right ventricular systolic pressure,RVSP);苏木精-伊红染色观察肺血管形态,计算肺血管重塑指标肺小动脉中层血管壁厚度占血管外径的百分比(MT%)和肺小动脉中层截面积占血管总截面积的百分比(MA%);免疫组化法检测肺组织中缺氧诱导因子-1α(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链反应检测HIF-1α、PCNA mRNA表达水平。结果与常氧组比较,缺氧3、7、14、21 d时缺氧组、缺氧+2ME组RVSP升高,HIF-1α、PCNA蛋白和mRNA表达水平上调(P<0.05),缺氧7、14、21 d时缺氧组MT%、MA%增加(P<0.05);与缺氧组比较,缺氧3、7、14、21 d时缺氧+2ME组RVSP降低,HIF-1α、PCNA蛋白和PCNA mRNA表达水平下调(P<0.05),缺氧7、14、21 d时缺氧+2ME组MT%、MA%减少(P<0.05)。结论2ME可能通过抑制HIF-1α、PCNA表达,减轻肺血管重塑,对新生大鼠缺氧性肺动脉高压发挥保护作用。

五味子乙素对缺氧缺血新生大鼠的脑保护作用及机制

目的研究五味子乙素(Sch B)对缺氧缺血新生大鼠的脑保护作用。方法SD新生大鼠48只随机均分为假手术组、模型组、Sch B组(Sch B,55.4 mg/kg)及3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(自噬抑制剂3-MA,10 mg/kg),后3组大鼠采用结扎左侧颈总动脉建立缺氧缺血新生大鼠模型,后两组大鼠在造模同时灌胃或注射相应药物、假手术组和模型组灌胃生理盐水,共7 d;采用Longa分级法对各组大鼠进行神经功能缺失评分,HE染色检测各组大鼠海马神经元组织学变化,免疫荧光染色检测脑组织线粒体形态,免疫印迹实验检测脑组织自噬蛋白(Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)及PINK1、Parkin蛋白表达,试剂盒测定各组大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠海马神经元萎缩、变性,数量减少,出现严重病理损伤,脑神经细胞线粒体长度、脑组织SOD水平明显降低(P<0.05),MDA水平、神经功能缺失评分及脑组织Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、Parkin蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,Sch B组大鼠脑海马神经元损伤减轻,脑神经细胞线粒体长度、脑组织SOD水平、脑组织自噬蛋白(Beclin-1、LC3II/LC3I)及PINK1、Parkin蛋白表达水平升高(P<0.05),MDA水平、神经功能缺失评分降低(P<0.05);3-MA组大鼠海马神经元损伤加重,脑神经细胞线粒体长度、脑组织SOD水平、脑组织Beclin-1、LC3II/LC3I及PINK1、Parkin蛋白表达水平降低(P<0.05),MDA水平、神经功能缺失评分升高(P<0.05)。结论Sch B降低缺氧缺血大鼠神经功能缺损症状,其机制可能与抑制大鼠脑组织氧化应激、促进线粒体自噬作用有关。

藁本内酯抑制缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织凋亡相关蛋白的表达

目的:通过检测体内外缺氧缺血条件下NOD样受体蛋白3(NLRP3)、天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase1)、白细胞介素-1β(IL-1β)、GSDMD-N蛋白水平评价藁本内酯(LGSL)对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠的神经保护作用。方法:选取7日龄SD雄性大鼠随机分为假手术组(Sham组)、HIBD组和LGSL组各10只,采用左颈总动脉双重结扎构建HIBD模型,体外建立小胶质细胞氧糖剥夺(OGD)模型(OGD/R)。采用CCK-8评估不同浓度LGSL干预24 h对OGD/R小胶质细胞活力的影响;通过免疫印迹评估20μM LGSL对体内外缺氧缺血条件下NLRP3、Caspase1、IL-1β、GSDMD-N表达的影响。结果:在体内外模型中,NLRP3、IL-1β、Caspase1及GSDMD-N表达均上调(P<0.05);20μM LGSL干预24 h后,NLRP3、IL-1β、Caspase1及GSDMD-N表达均下调(P<0.05)。结论:LGSL可以显著抑制新生大鼠体内外因缺氧缺血引起的神经炎症反应。

大黄素对脂多糖诱导的新生大鼠急性肺损伤的保护作用

目的 探索大黄素对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的新生大鼠急性肺损伤的保护作用。方法 新生大鼠腹腔注射LPS制作建立急性肺损伤模型,每天腹腔注射不同剂量大黄素(emodin, EMD),连续治疗7 d,对照组腹腔注射等体积生理盐水。通过HE、Masson染色进行组织病理学检测,免疫组织化学检测肺组织平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平,原位末端标记法(TUNEL)检测肺组织细胞凋亡水平,Western Blot检测肺组织Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(Collagen Ⅲ)、裂解的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(cleaved Caspase 3)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达水平。结果 脂多糖使大鼠肺损伤评分、肺纤维化程度、α-SMA平均光密度、TUNEL阳性率、Collagen I、Collagen Ⅲ、cleaved Caspase3、IL-1β、TNF-α蛋白表达水平较对照组显著增加,大黄素处理能剂量依赖性抑制脂多糖引起的上述变化。结论 大黄素对LPS诱导的新生大鼠急性肺损伤具有保护作用。

基于Nrf2/Gpx4通路研究右美托咪定对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠铁死亡及神经功能的影响

目的基于核因子E2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)信号通路,研究右美托咪定(DEX)对缺血缺氧性脑损伤(HIBD)新生大鼠铁死亡及神经功能的影响。方法构建HIBD新生大鼠模型,随机分为模型组、DEX(100μg/kg)组、DEX(100μg/kg)+抑制剂(Nrf2抑制剂鸦胆子苦醇2 mg/kg)组,每组12只,另取12只新生大鼠作为对照组。对照组和模型组腹腔注射相同体积的0.9%氯化钠溶液。大鼠神经功能缺损程度评分(NDS)评价大鼠神经功能;氨基酸自动分析仪检测海马组织中谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)水平;尼氏(Nissl)染色检测海马区神经元形态;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测海马组织中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)含量;试剂盒检测海马组织丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、铁含量;蛋白免疫印迹检测海马组织中Nrf2、HO-1、Gpx4、胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白(xCT)表达情况。结果与对照组比较,模型组海马区神经元形态异常,腹侧神经元轴突长短不一且排布不整齐,部分神经元呈背侧脱离趋势,NDS评分、海马组织中Glu、IL-6、TNF-α、NSE、MDA、铁含量升高(P<0.05),GABA、GSH含量及Nrf2、HO-1、Gpx4、xCT蛋白水平降低(P<0.05);与模型组比较,DEX组海马区神经元形态相对饱满,腹侧神经元轴突较整齐,NDS评分、海马组织中Glu、IL-6、TNF-α、NSE、MDA、铁含量降低(P<0.05),GABA、GSH含量及Nrf2、HO-1、Gpx4、xCT蛋白水平升高(P<0.05);Nrf2抑制剂可减轻DEX对HIBD新生大鼠神经损伤的改善作用(P<0.05)。结论DEX能够激活Nrf2/Gpx4通路,抑制铁死亡,改善HIBD新生大鼠神经损伤。

血管紧张素Ⅳ类似物益智二肽保护丙泊酚重复麻醉新生大鼠的学习记忆能力

目的探讨血管紧张素Ⅳ类似物益智二肽(Dihexa)预给药对丙泊酚重复麻醉的新生大鼠学习记忆能力的影响及其机制。方法7日龄SD大鼠78只(体质量12~20 g),随机均分为对照组、丙泊酚重复暴露组及Dihexa+丙泊酚重复暴露组;对照组腹腔注射生理盐水(7.5 mL/kg),丙泊酚重复暴露组腹腔注射丙泊酚(75 mg/kg),Dihexa+丙泊酚重复暴露组腹腔注射Dihexa(0.5 mg/kg),25 min后给予丙泊酚(75 mg/kg)腹腔注射,造模持续5 d;末次给药后24 h,部分大鼠断颈处死取脑组织,采用ELISA法检测大鼠海马组织血管紧张素Ⅳ(AngⅣ)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,Western Blot法检测海马突触素(SYP)和突触后致密蛋白95(PSD95)的表达,高尔基染色法观察树突棘密度;每组取8只大鼠30日龄行莫里斯(Morris)水迷宫实验评价空间学习记忆能力。结果与对照组比较,丙泊酚重复暴露组2~5 d逃避潜伏期增加,穿越平台次数减少,目标象限停留时间缩短,海马组织AngⅣ含量减少,IL-1β、TNF-α的含量增加,PSD95、SYP蛋白表达降低,海马CA1区树突棘密度减少,差异有统计学意义(P<0.05);与丙泊酚重复暴露组比较,Dihexa+丙泊酚重复暴露组2~5 d逃避潜伏期减短,穿越平台次数增多,目标象限停留时间更长,海马组织AngⅣ含量增加,IL-1β、TNF-α的含量减少,PSD95、SYP蛋白表达升高,海马CA1区树突棘密度增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论Dihexa预处理可抑制丙泊酚重复麻醉新生大鼠诱导的海马炎症反应和突触可塑性损害,保护大鼠学习记忆能力。

NADPH氧化酶2在七氟烷所致新生大鼠海马氧化应激及神经元凋亡中的作用机制

目的探究吸入性麻醉药七氟烷是否通过激活新生大鼠海马NADPH氧化酶2介导氧化应激损伤引起神经元凋亡及远期认知功能损害。方法新生7d的清洁级SD雄性大鼠116只,采用随机数字表法分为空气对照组(Con组,n=29)、夹竹桃麻素对照组(Apo组,n=29)、七氟烷实验组(Sevo组,n=29)、七氟烷+夹竹桃麻素实验组(Sevo+Apo组,n=29)。Con组和Sevo组新生大鼠分别暴露于空气或2.3%七氟烷中6h,Apo组和Sevo+Apo组于空气或七氟烷暴露前腹腔注射给予新生大鼠夹竹桃麻素50mg/kg。于七氟烷暴露结束后6h检测4组新生大鼠海马组织NADPH氧化酶2活性和蛋白表达水平,评估氧化应激产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达水平,运用尼氏染色法观察海马CA1、CA3区神经元的形态学变化并计数,并于七氟烷暴露结束后21d采用八臂迷宫实验检测大鼠空间工作记忆和参考记忆用于评估学习记忆能力变化。结果与Con组比较,Sevo组NADPH氧化酶2活性及蛋白表达水平均升高(P<0.05),氧化应激产物MDA含量及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达水平同样升高(P<0.05);而与Sevo组相比,Sevo+Apo组NADPH氧化酶2活性及蛋白表达量、MDA含量及cleaved caspase-3表达水平均降低(P<0.05)。与Con组比较,Sevo组海马锥体神经元排列明显稀疏紊乱,部分胞质溶解,细胞核固缩、碎裂伴有CA1区和CA3区锥体神经元数目减少(P<0.05),Sevo+Apo组也可见细胞水肿、核固缩等病理形态,但其程度较Sevo组明显减轻,且椎体神经计数仍多于Sevo组(P<0.05)。八臂迷宫实验提示第1~5天Sevo组工作记忆错误次数高于Con组(P<0.05),但Sevo+Apo组出现空间工作记忆错误次数少于Sevo组,差异有统计学意义(P<0.05);而在参考记忆错误方面,4组大鼠表现差异无统计学意义(P>0.05)。结论七氟烷所致发育脑海马神经元凋亡及认知功能损害与其激活NADPH氧化酶2介导氧化应激损伤密切相关。

白肉灵芝水提物对新生大鼠胆红素脑病的影响

为了研究白肉灵芝水提物(ganoderma leucocontextum aqueous extracts,GLAE)对新生大鼠胆红素脑病的改善作用。腹腔注射胆红素建立高胆红素血症大鼠模型,将新生大鼠分成对照组、模型组、GLAE低剂量组、GLAE中剂量组和GLAE高剂量组,分别给予不同剂量的(0、50、100、200 mg/kg)GLAE处理。利用试剂盒检测血液样本和大脑组织中总胆红素水平,比色法检测大脑组织ATP酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、神经特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和中枢神经特异性蛋白(central nerve specific protein,S100β)的含量,实时荧光定量PCR和western blot检测大脑组织B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine aspartate protease 3,Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2相关X(Bcl-2 assaciated X,Bax)、脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)mRNA水平和蛋白含量。结果显示,与模型组相比,经GLAE干预后,大鼠血清及大脑组织胆红素浓度明显降低(P<0.05,P<0.01);大脑组织SOD、CAT、GSH-Px、Na+-K+-ATP和Ca2+-ATP酶活性显著升高(P<0.05,P<0.01),MDA含量明显降低(P<0.05,P<0.01);血清TNF-α、IL-1β、NSE、S100β含量显著降低(P<0.05,P<0.01);大脑组织Caspase-3、Bax mRNA水平和蛋白含量明显降低(P<0.05,P<0.01),Bcl-2、BDNF、NGF mRNA水平和蛋白含量明显升高(P<0.05,P<0.01)。以上结果表明GLAE能减轻过量胆红素对新生大鼠的大脑损伤,其作用机制可能通过改善新生大鼠大脑能量代谢,提高大脑抗氧化能力,增加神经营养因子含量,抑制炎症反应及凋亡基因的表达来发挥作用。

血小板源性生长因子-BB对缺氧性肺动脉高压新生大鼠肺血管重塑的影响及机制研究

目的探讨血小板源性生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)对缺氧性肺动脉高压(hypoxia pulmonary hypertension,HPH)新生大鼠肺血管重塑的影响。方法128只新生大鼠随机分为:PDGF-BB+HPH组、HPH组、PDGF-BB+常氧组、常氧组(各组n=32)。PDGF-BB+HPH组、PDGF-BB+常氧组经尾静脉注射13μL 6×1010 PFU/mL携带PDGF-BB基因的腺病毒载体。转染腺病毒载体24 h后,HPH组和PDGF-BB+HPH组建立HPH新生大鼠模型。缺氧3、7、14、21 d检测右心室收缩压(right ventricular systolic pressure,RVSP),苏木精-伊红染色后光学显微镜下观察肺血管形态学变化及血管重塑指标(MA%、MT%),免疫组化法检测肺组织中PDGF-BB、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达水平。结果PDGF-BB+HPH组和HPH组RVSP在各时间点均高于同日龄常氧组(P<0.05)。PDGF-BB+HPH组缺氧3 d出现血管重塑,HPH组缺氧7 d开始出现血管重塑;缺氧3 d时,PDGF-BB+HPH组MA%、MT%高于HPH组、PDGF-BB+常氧组、常氧组(P<0.05);缺氧7、14、21 d时,PDGF-BB+HPH组和HPH组MA%、MT%均高于PDGF-BB+常氧组、常氧组(P<0.05)。PDGF-BB+HPH组、HPH组在各时间点PDGF-BB、PCNA表达均高于常氧组(P<0.05),缺氧3、7、14 d时,PDGF-BB+HPH组PDGF-BB、PCNA表达高于HPH组(P<0.05),PDGF-BB+常氧组PDGF-BB、PCNA表达较常氧组高(P<0.05)。结论外源性给予HPH新生大鼠PDGF-BB,可上调PCNA表达,促进肺血管重塑,提高肺动脉压力。

肠道微生物稳态对坏死性小肠结肠炎新生大鼠模型造血系统的影响

目的探讨肠道菌群对坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)新生大鼠模型造血系统的影响。方法Sprague-Dawley新生大鼠随机分为对照组和模型组(NEC组),每组6只。采用配方奶结合缺氧和冷刺激构建NEC新生大鼠模型。苏木精-伊红染色观察肠组织及造血相关器官病理变化;检测各组血常规;免疫组化法检测造血相关器官中特定细胞的改变;流式细胞术检测骨髓中特定细胞的变化;采用16S rDNA测序技术检测分析各组肠道菌群的组成及丰度。结果与对照组比较,NEC组肠组织充血坏死,肠绒毛破损、萎缩脱落,NEC病理评分显著增加;NEC组外周血白细胞及淋巴细胞计数显著低于对照组(P<0.05);NEC组脾脏、胸腺、骨髓的有核细胞及肝脏的嗜碱性细胞核的小细胞聚集体数量均明显少于对照组;NEC组肝脏中CD71^(+)红系祖细胞显著减少,脾脏、骨髓中的CD45^(+)白细胞及胸腺中的CD3^(+)T淋巴细胞显著降低,骨髓中CD45^(+)CD3^(-)CD43^(+)SSChi的中性粒细胞比例明显下降(P<0.05);NEC组肠道菌群组成与对照组比较差异明显,NEC组利乳杆菌属的相对丰度降低,而埃希菌-志贺菌属的相对丰度显著升高(P<0.05),取代利乳杆菌属成为优势菌属。结论NEC新生大鼠模型存在多谱系造血异常,可能与肠道微生物稳态失衡及致病菌属埃希菌-志贺菌属的异常扩增有关。

岩藻多糖对氧糖剥夺诱导的新生大鼠海马脑神经元的影响

目的:探讨岩藻多糖对氧糖剥夺(OGD)诱导的新生大鼠海马神经元的影响。方法:分离新生大鼠原代海马神经元后,分4组处理。空白组不做任何处理;Fuc组用100μg/mL岩藻多糖培养7 d;OGD组按OGD方法培养;OGD+Fuc组首先进行OGD诱导,然后用100μg/mL岩藻多糖培养7 d。分组处理后,MTT法检测细胞活力,AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR法检测白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达;使用试剂盒测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin-1、P62,Cleaved Caspase-3和9,磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化Akt(p-Akt)的表达。结果:OGD可降低神经元活力,增加凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达水平(P<0.05);升高SOD活性,降低MDA含量(P<0.05);升高IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA表达水平(P<0.05);升高LC3和Beclin-1表达水平(P<0.05);降低p-PI3K、p-Akt和P62表达(P<0.05)。岩藻多糖可拮抗上述作用(P<0.05)。结论:岩藻多糖可能通过激活PI3K/Akt信号通路,减轻OGD诱导的神经元炎症反应、自噬和氧化应激水平,发挥神经元保护作用。

维生素D3对新生大鼠坏死性小肠结肠炎的肠道保护作用研究

目的建立坏死性小肠结肠炎(NEC)新生大鼠模型并研究维生素D3干预对肠道保护作用。方法采用人工代乳品、缺氧和冷应激的方法诱导新生大鼠NEC,干预组提前给予维生素D3干预。HE病理和TUNEL染色检测肠管组织病理变化和细胞凋亡,ELISA实验和免疫组化染色分别检测肠道组织中炎症因子和凋亡蛋白的表达水平。结果病理结果显示维生素D3干预可明显减少NEC新生大鼠肠道凋亡细胞数量,减轻组织损伤;ELISA和免疫组化染色结果显示维生素D3干预可降低肠道组织炎症因子TNF-α的表达水平,还降低Cleaved-Caspase3、iNOS和COX2表达水平。结论维生素D3干预可降低NEC大鼠肠道组织炎症因子的表达,抑制细胞凋亡,发挥肠道保护作用。

川芎嗪通过PINK1/Parkin通路调控自噬对新生大鼠缺氧缺血性脑病的影响

目的研究川芎嗪注射液对缺氧缺血性脑病新生大鼠自噬的影响及其分子机制。方法将7日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为假手术组(n=8)、模型组(n=12)、川芎嗪组(n=12)。模型组和川芎嗪组行左侧颈总动脉结扎后再缺氧处理,制备新生大鼠缺氧缺血性脑病模型。假手术组只暴露血管不做其他处理。川芎嗪组在缺氧缺血后每日腹腔注射川芎嗪注射液20 mg/kg,假手术组与模型组每日腹腔注射等体积的0.9%氯化钠溶液。在治疗7 d后取材,采用苏木精-伊红染色及尼氏染色观察脑组织神经元病理变化情况。采用免疫组织化学染色观察各组新生大鼠大脑海马及皮质区域PTEN诱导假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)、Parkin表达。采用TUNEL染色检测神经元凋亡情况。通过免疫印迹法检测PINK1、Parkin、自噬特异性基因Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和泛素结合蛋白(Protein 62,P62)的表达。结果与假手术组相比,模型组新生大鼠神经元数量减少,细胞间隙增大,排列疏松,胞质空泡化,尼氏小体减少;PINK1、Parkin阳性表达增加,神经元凋亡率升高(均P<0.05);PINK1、Parkin、Beclin1、LC3蛋白表达增加,P62蛋白表达减少(均P<0.05)。与模型组相比,川芎嗪组新生大鼠神经元数量增多,细胞排列整齐,尼氏小体增加;PINK1、Parkin阳性表达减少,神经元凋亡率降低(均P<0.05);PINK1、Parkin、Beclin1、LC3蛋白表达减少,P62蛋白表达增加(均P<0.05)。结论川芎嗪在一定程度上缓解了新生大鼠缺氧缺血性脑损伤,抑制神经元凋亡,其机制可能与抑制PINK1/Parkin介导的自噬相关。

新生大鼠窒息后缺氧脑损伤模型的磁共振影像与病理对照研究

目的探讨常规MRI联合磁敏感加权成像(susceptibility-weighted imaging,SWI)对单纯缺氧法建立新生大鼠窒息后缺氧脑损伤模型病理类型的研究,并从组织学探讨缺氧对皮层及海马的影响。材料与方法将新生7日龄SD(Sprague Dawley)大鼠随机分为窒息组与对照组,窒息组幼鼠置于封闭小室内进行氧浓度为1%的缺氧5 min-氧浓度为21%的复氧3 min循环,累计缺氧30 min;对照组置于相同小室内相同时间。缺氧过程、缺氧后、造模后(1、3、7 d)进行行为学观察,并在扫描后1、3、7 d进行T1WI、T2WI及SWI序列扫描。根据MRI异常信号部位进行苏木素-伊红染色,观察异常信号区病理损伤类型。采用Nissl染色观察幼鼠皮层、海马齿状核(dentate grrus,DG)区、CA1(corn ammonis 1)及CA3(corn ammonis 3)区神经元存活情况;采用免疫组化染色检测凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。结果幼鼠在缺氧后1、3、7 d均出现癫痫发作。MRI及SWI显示脑损伤类型包括脑室扩大、脑软化灶形成、脑室及脑实质内出血及微血管扩张。Nissl染色显示皮层、海马DG区神经元在缺氧后1、3、7 d均较对照组减少(P<0.05),CA3区神经元在缺氧后7 d减少(P<0.05)。免疫组织化学染色显示,海马DG区Caspase-3表达在缺氧后1、3、7 d均较对照组增高(P<0.05),皮层表达在缺氧后3、7 d均较对照组增高(P<0.05);海马CA1区、CA3区表达在缺氧后7 d较对照组增高(P<0.05)。结论MRI及SWI提示急性间歇性缺氧早期即可存在脑损伤,缺氧脑损伤可导致癫痫发作。提示临床将MRI及SWI作为有窒息病史且怀疑脑损伤患儿的常规检查,并应尽早进行临床干预。