响应面法优化杀鱼假交替单胞菌2515发酵培养基

杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)2515是一株具有广谱抗弧菌性能的菌株,为提升菌株2515的培养生物量,通过单因素优化方法,研究碳源、氮源、无机盐等营养成分对菌株2515的发酵产量的影响,确定关键营养因子,利用响应面分析法对影响菌株2515生物量的关键营养因子进行优化。结果显示,菌株2515的最佳发酵培养基配方为麦芽糖2.85 g/L、CaCl20.65 g/L、MnCl20.10 g/L、酵母膏3.85 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L。优化后的培养基使菌株2515在锥形瓶和发酵罐中发酵的OD_(600)值分别为1.416和1.866,生物量分别提高了36.4%和40.4%,其发酵上清液和细胞内容物的抑菌活性分别提高了28.2%和27.2%。表明响应面法优化后的培养基有利于提高菌株2515的发酵生物量及抗菌效果,研究结果为菌株2515的后续开发应用提供了参考。

抗弧菌杀鱼假交替单胞菌2515的潜在毒性及热处理脱毒后抗菌效果

为评估一株具有弧菌拮抗功能的杀鱼假交替单胞菌2515 Pseudoalteromonas piscicida 2515(以下简称“菌株2515”)对海水养殖动物的毒性,并确定一种有效的热处理脱毒方法,在中国明对虾Fenneropenaeus chinensis育苗水体中分别添加浓度为105、106、107、108 CFU/mL的菌株2515,测试其对中国明对虾受精卵孵化及幼体发育的影响。结果表明:水体中添加浓度高于105 CFU/mL的菌株2515后,显著降低了无节幼体变态发育至蚤状幼体的成活率(P<0.05);分别应用血平板及显微观察法测试菌株2515对羊、鱼及对虾血细胞的溶血活性,结果显示,该菌对羊及鱼红细胞均具溶血活性,而对凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei血细胞无溶血活性;设置不同温度(40、45、50、55、60、65、75℃)热处理菌株2515及其破碎液,结果显示,55℃1 h能够灭活该菌,且失去对鱼类红细胞的溶血活性,而抑菌物质活性可提高55.8%。研究表明,菌株2515对鱼虾具有潜在毒性,选择适当热处理,既能灭活溶血活性还可提高抗菌活性。

杀鱼假交替单胞菌C923几丁质酶基因PpchiC的克隆表达与酶学性质

【背景】某些假交替单胞菌可分泌几丁质酶,在降解利用几丁质为水产动物提供营养、免疫、抗病等方面有着重要潜力。【目的】克隆杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)C923的一个几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,并对重组几丁质酶的酶学性质进行研究。【方法】从菌株C923测序的基因组中注释到一个几丁质酶家族基因PpchiC,设计引物克隆该基因后进行生物信息学分析;构建载体进行异源表达并从温度、时间与诱导剂浓度进行表达优化;对表达蛋白进行最适温度与pH等酶学性质研究,同时比较了重组菌破碎后上清与沉淀及纯化的酶蛋白对几丁质的降解效应。【结果】基因PpchiC长1350bp,编码450个氨基酸,PpchiC蛋白理论分子量为48.76kDa,等电点为4.78,不稳定系数为29.08。结构域分析发现该蛋白含有一个类型Ⅲ几丁质结合域和一个糖苷水解酶18家族(glycosyl hydrolase 18,GH18)的催化域;PpchiC蛋白含有GH18家族几丁质酶的保守催化基序DxxDxDxE、YxR和[E/D]xx[V/I]。16℃、0.25 mmol/L IPTG、诱导12 h为其最优化表达条件,PpchiC在50℃、pH 8.0时表现出最大酶活性;以胶体几丁质为底物时,PpchiC的Km值为2.58 mg/mL、Vmax值为5.04 mg/(mL·min)。降解结果表明,菌体的沉淀与上清及从上清中纯化的酶蛋白均有着较好的几丁质降解效应。【结论】杀鱼假交替单胞菌C923基因PpchiC编码GH18家族的几丁质酶,能被大肠杆菌高效表达且降解几丁质效应明显,这为PpchiC及菌株C923的应用提供了参考依据。

杀鱼假交替单胞菌对模拟海水流动环境下Q235碳钢腐蚀的抑制行为

从位于中国东海的钢铁研究总院舟山海洋腐蚀研究所近海海域的海底沉积物中分离提取得到杀鱼假交替单胞菌,分别将其接种到细菌培养广口瓶和模拟海水流动环境培养器中,利用电化学工作站、扫描电镜及红外光谱仪对浸泡于两种培养体系中Q235碳钢样品的腐蚀行为进行研究。结果表明,杀鱼假交替单胞菌能抑制碳钢在海水中的腐蚀进程。样品的阻抗在广口瓶培养体系中得到了更为明显的提高,广口瓶培养体系中的碳钢样品表面覆盖着一层质地均匀且完整的生物膜;而模拟海水流动环境中碳钢样品表面的生物膜厚度不均匀,海水通过膜层上的孔洞和裂隙与未成膜基体直接接触,在生物膜与样品表面之间形成氧浓差微电池使得局部腐蚀得以发展。红外光谱分析结果显示,培养7 d后两个体系中碳钢样品表面的生物膜内细菌的分泌物大分子不同。

一株兼具氨氮去除能力和对副溶血弧菌拮抗作用的有益菌的筛选及其初步应用

采用无机氮筛选培养基,从对虾养殖水体和对虾肠道中分离到3株具有脱氮效果的异养硝化菌株(编号分别为20131023A00、20131023A01和20131023A05),它们在氨氮含量为0.12%的液体筛选培养基上(pH=7.2),28℃经24h对氨氮的转化能力分别为(38.9±0.1)%、(43.1±0.4)%和(49.9±0.5)%;采用纸片法拮抗实验选出菌株20131023A05对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)具有拮抗作用,在1.57×10~5 CFU/cm^2、1.57×10~4 CFU/cm^2和1.57×10~3 CFU/cm^2的副溶血弧菌平板上产生的抑菌圈直径分别为(9.14±0.05)mm、(11.57±0.03)mm和(13.59±0.02)mm。经16S rDNA序列测定,表明该菌株与杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)有最近的亲缘关系。在日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)养殖水体中加入该株菌至2.5×10~5 CFU/ml时,该菌株表现出对副溶血弧菌注射感染的保护作用,该菌株浸浴组的日本囊对虾相对存活率(RPS)为35%。在凡纳滨对虾养殖水体中每3 d加入该株细菌(3.13×10~4 CFU/ml),每天加入70%饲料量的赤砂糖,经60d养殖,水体中氨氮含量比对照组及其他组显著降低。菌株20131023A05兼具去除氨氮和对副溶血弧菌拮抗作用,在对虾养殖生产中有广阔的应用前景。