水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的实时荧光PCR快速检测鉴定

成功建立了水稻白叶枯菌与水稻细菌性条斑病菌快速检测鉴定的实时荧光PCR方法。根据含铁细胞接受子基因设计两菌的通用引物PSRGF PSRGR(扩增一个 1 5 2bpDNA片段 )和特异性探针 (Baiprobe和Tiaoprobe) ,并对 1 3种细菌和 1种植原体进行实时荧光PCR。结果表明 ,两个特异性探针能分别特异性检测到目标病原菌产生荧光信号而其它参考菌不产生荧光信号。检测的绝对灵敏度是 3 0 .6fg μL质粒DNA和 1 0 3CFU mL的菌悬浮液 ,相当于 1个细菌细胞的基因 ,比常规PCR电泳检测高约 1 0 0倍 ,相对灵敏度为 1 0 5CFU mL。整个检测过程只需 2h ,完全闭管 ,降低了污染的机会 ,无需PCR后处理。用这两个特异性探针分别对自然感染白叶枯菌和条斑菌的叶片DNA提取液和种子浸泡液进行实时荧光PCR ,结果均可特异性检测到目标菌的存在并完全可将两种病原细菌区分开来 ,且只需 0 3g叶片和 1

广东水稻白叶枯病菌新致病型的发现及致病性测定

在对广东省水稻白叶枯病菌的致病型变异动态监测中 ,发现了在中国鉴别寄主金刚 3 0、Tetep、南粳 15、Ja va14、IR2 6上的反应为SSSSS模式的菌株。该菌株有别于SRRRR(Ⅰ型 )、SSRRR(Ⅱ型 )、SSSRR (Ⅲ型 )、SSSSR(Ⅳ型 )、SSRRS(Ⅴ型 )、SRSRR(Ⅵ型 )、SRSSR(Ⅶ型 )、RRRSR(云南菌型 ) 8个类型 ,是一个新致病型菌系。对该菌系致病性测定的结果显示 ,其致病谱广、毒性强 。

广西水稻白叶枯病菌致病型的初步鉴定

【目的】明确广西水稻白叶枯病菌致病型的分布和分化,为生产上该病害的综合防控提供理论依据。【方法】采用水稻白叶枯病菌中国鉴别寄主(金刚30、特特普、南粳15、爪哇14、IR26)对2013年从广西南宁、东兴、防城港、钦州、岑溪等地水稻病区分离得到的29株水稻白叶枯病菌进行致病型初步鉴定,同时采用部分近等基因系对5株南宁分离菌株致病性进行进一步分析。【结果】29株菌株在5个鉴别寄主上均出现感病反应,均为SSSSS模式,为强致病菌;5株南宁分离菌株能使目前抗谱最广的水稻材料CBB23感病。【结论】广西水稻白叶枯病菌致病力出现极大分化,需加强对该病害的防控及水稻抗病材料的筛选利用工作。

水稻白叶枯病菌对拌种灵抗药性分子机制研究

通过紫外诱变获得了抗拌种灵水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的突变体,这些突变体可以在含100ìg·ml-1拌种灵平板上生长,而敏感菌株在10μg·ml-1浓度下则不能生长。敏感菌株琥珀酸脱氢酶活性受拌种灵强烈抑制,而抗药突变体的酶活性较低,且不受药剂抑制。应用6对引物,从水稻白叶枯病菌野生敏感菌株和室内诱导抗药性菌株中扩增到琥珀酸脱氢酶基因全序列。该基因全长3616bp,编码1115个氨基酸,含有2个内含子。与柑橘溃疡病菌(Xanthomonasaxonopodispv.citri)琥珀酸脱氢酶核苷酸同源性93%,氨基酸同源性97%;与其它6种病原细菌琥珀酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列同源性为43%～95%。敏感菌株和抗药菌株的琥珀酸脱氢酶序列分析表明,琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白亚基中229位氨基酸由组氨酸(CAC)突变为酪氨酸(TAC)是导致X.oryzae对拌种灵产生抗药性的主要原因。

水稻白叶枯病菌拮抗细菌B56菌株的拮抗活性研究

B56 菌株经30 ℃振荡培养去菌体,其上清液经2 m ol/L 硫酸铵沉淀获得对水稻白叶枯病菌有拮抗活性的初提液。该初提液具有耐热性,经一定强度热处理后仍保持强的抑菌能力;抑菌效果在pH3～9 之间无明显差异;用胰蛋白酶、蛋白酶K 等处理后拮抗活性无明显变化。利用PhenylSepharose CL-4B疏水色谱柱和DEAE-Sephacel阴离子交换柱分离B56 菌株初提液, 得到一个具有拮抗活性的洗脱峰。该洗脱峰经SDS-PAGE检测发现具有一条分子量约为36 kD 的蛋白带。质粒提取和检测发现B56菌株存在一个稳定的内源质粒。

水稻白叶枯病菌harpin基因的克隆与表达

利用 PCR方法从水稻黄单胞菌白叶枯致病变种 (Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo) Jxo III菌株中克隆到编码诱导植物过敏性反应激发子的基因 hrf A。同源性比较发现其推测产物与水稻白叶枯病菌菲律宾小种 Pxo86的 Hpa1有 97.2 %的序列一致性 ,比 Hpa1少了一个 - GGG- GG-氨基酸残基序列重复。基因经 Nde I和 Bam HI双酶切后连到含 T7启动子的高表达载体 p ET30 a(+ )上构建重组质粒 p HRF4 ,并转化宿主菌 BL2 1(DE3)产生表达菌株 BL HR4。经过 IPTG诱导之后 ,BL HR4产生一分子量为 15 .6k D的蛋白质。研究表明 ,该蛋白在性质与功能上类似于其它已发现的 harpins,即能够在烟草上引起典型的过敏性反应 ,富含甘氨酸、热稳定以及对蛋白酶敏感。因此 ,我们把该蛋白定名为 harpin Xoo。harpin Xoo还具有诱导植物抗病性的功能。

水稻白叶枯病菌在离体培养条件下生物膜形成的检测

分析了不同培养和测试条件(塑料和玻璃表面、培养时间、培养温度和培养基)对水稻白叶枯病菌(Xan-thomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)生物膜形成的影响,并测定了不同地区来源的Xoo野生型菌株、基因缺失突变体的生物膜形成。结果表明,在聚苯乙烯表面生长、用M210培养基在23℃下静止培养24 h是Xoo生物膜形成比较适宜的条件;不同地区来源的菌株生物膜形成能力不同;鞭毛相关基因fleQxoo、fliExoo和rbfCxoo以及H2O2降解调控基因oxyRxoo的缺失突变均影响生物膜形成。

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)化学诱变hrp基因突变体及相关性状的研究

硫酸二乙酯 (diethyl sulfate,DES)化学诱变水稻白叶枯病菌 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)日本系统 号小种 (JXO ) ,获得 16株 hrp-突变体 ,其在感病寄主水稻 IR2 6、汕优 6 3上失去致病性和在非寄主烟草上失去过敏反应。所得的 hrp-突变体并无黄色素缺失现象。16株 hrp-突变体的淀粉酶、果胶酶、蛋白酶、纤维素酶和脂酶等胞外酶活性基本与野生型一致。 JCM2 0 92、JCM2 2 11、JCM2 2 5 2和 JCM2 4 5 7这 4株 hrp-突变体为 型泌出通道突变体 ,JCM0 0 6 6等另 12株 hrp-突变体的超声波破碎液、离心上清液中无激发 HR的信号物质存在。细胞组分分析表明 ,激发烟草 HR的信号物质不是 L PS而是蛋白类物质。来自 JXO 基因文库 hrp基因克隆 p UHRX2 4 5中的 1.1kb Sac I-Kpn I片段 ,能够互补 hrp-突变体 JCM0 0 6 6和 JCM2 4 82 ,使其恢复在烟草上激发 HR的能力 ,但不能恢复其致病性。

水稻白叶枯病菌核苷酸信号受体蛋白Clpxoo的分子鉴定及其功能

【目的】本文的目的为阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)核苷酸信号途径及其作用机理。【方法】本研究对推导的信号受体蛋白Clpxoo进行了基因克隆、序列分析、缺失突变和互补及其相关表型的鉴定。【结果】克隆的clpxoo基因序列与大肠杆菌crp和铜绿假单胞菌vfr的同源性较高,与其它几种病原黄单胞菌clp高度保守。Clpxoo序列N端具有环化核苷酸cNMP结合结构域(CAP-ED),C端具有保守的DNA结合结构域(HTH-CRP)。用双交换法构建了基因缺失突变体(△clpxoo)。与野生型菌株PXO99A相比,△clpxoo的运动性、胞外多糖产生能力和对H2O2的抗性均显著降低,基因互补可使之部分恢复;△clpxoo胞外酶产生和对烟草致敏性无显著改变。【结论】Clpxoo可能作为全局性的保守调控因子之一,调控了Xoo的鞭毛运动性、胞外多糖产生和对H2O2的抗性。

建立以lipA和purH为靶基因的RTQ-PCR方法对水稻白叶枯病菌侵染过程进行定量分析

【目的】建立水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的分子定量法,测定Xoo侵染水稻植株后不同时间的种群量及其变化【。方法】选用以lipA和purH为靶基因序列的引物P4和P5,用SYBR Green I实时定量PCR(RTQ-PCR)分析在水稻接种植株内的病菌种群量。【结果】与细菌平板计数法相比,RTQ-PCR法定量结果基本相近或略高(≤10倍),变化趋势基本相似,用2对引物P4和P5进行RTQ-PCR定量无显著差异。接种3d的植株内己有菌量积累,但不显症;从接种5d开始,细菌明显增加,植株显症并逐渐加重;接种9～14d菌量增加到峰值,并进入稳定平台期,植株显症严重。病菌种群量与植株显症间的关系可能与细菌群体感应机制有关。【结论】用RTQ-PCR分子定量法可以直接对水稻植株内的Xoo进行动态定量研究;提出了水稻病害分子定量"病菌靶基因拷贝数-DNA总量-种群量-植物病症"的研究模式。

江苏水稻白叶枯病菌致病型的检测

由稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzea pv. oryzea）引起的白叶枯病是水稻生产中危害非常严重的细菌性病害之一[1-2],而种植抗病品种是目前防治水稻白叶枯病最经济、有效、无污染的措施。

水稻白叶枯病菌内源过氧化氢在细胞分裂周期中的时空定位变化

【目的】分析细菌内源过氧化氢在细胞分裂周期中的时空变化,探讨细菌增殖中过氧化氢的生理功能。【方法】采用组织化学法通过透射电子显微镜技术观察水稻白叶枯病菌内源过氧化氢的积累位置。【结果】不同菌株内源过氧化氢水平不同,在细菌的整个细胞分裂周期中观察到过氧化氢在细胞壁上的积累水平维持稳定,在多个菌株的细胞分裂过程中,除细胞壁之外,还在2个新的位点(类间体结构和核区)出现过氧化氢的大量积累,表现出数量和空间定位的显著变化。【结论】在多个水稻白叶枯病菌菌株中发现胞内额外的大量过氧化氢积累和定位与细胞分裂的进程密切相关,这种过氧化氢的时空变化很可能是细菌分裂时的普遍现象。推测过氧化氢应在细菌增殖中具有重要作用。

水稻白叶枯病菌致病相关基因筛选系统的建立

水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae是水稻生产中最严重的细菌性病害之一。本研究采用Tn5转座子随机插入突变的方法构建水稻白叶枯病菌广西菌株K74的突变体库,Southern杂交显示Tn5随机单拷贝插入基因组。通过水稻致病性检测试验,目前获得15个致病力降低50%以上的突变体,为定位Tn5插入突变基因,经质粒拯救、测序、序列分析后发现:4个突变基因为gum基因簇基因,5个为LPS基因簇基因,2个为metB基因,1个为hrpB1基因,2个是与糖合成转移酶相关基因,1个为编码假定蛋白的基因。其中14个突变基因是已知的与致病相关的基因。实验结果表明本研究成功建立了一个筛选水稻白叶枯病菌致病相关基因的系统,为进一步研究水稻白叶枯病致病相关基因,阐明该病的致病机理奠定基础。

抗水稻白叶枯病菌植物内生真菌的筛选、鉴定

从多种植物叶片内分离、纯化出31株植物内生真菌,活性筛选表明分离自健康水稻叶片内生真菌Bo-1菌的乙酸乙酯粗提物对水稻白叶枯病菌具有较强的抑菌活性。当供试浓度为100μg/mL时,Bo-1菌乙酸乙酯粗提物对水稻白叶枯病菌抑菌圈为22.4 mm,与同浓度的氯霉素对水稻白叶枯病菌的抑菌效果相当。通过形态学特征观察和ITS rDNA测序分析,Bo-1菌被鉴定为淡色生赤壳菌(Bionectria ochroleuca)。抗菌谱实验表明,Bo-1菌对多种细菌类病原体具有较强的拮抗能力。

水稻白叶枯病菌基因组简单重复序列分析

［目的］分析水稻白叶枯病菌基因组中的串联简单重复序列（simple sequence repeats，SSRs），为其在白叶枯病菌基因组分析和遗传多样性研究提供标记信息。［方法］利用开放的基因组数据库资源，对已完成测序的3个白叶枯病菌菌株KACC10331、MAFF311018和PXO99^A进行系统的比较分析，包括基因组中SSR的结构类型、分布、丰度等;并以实例解读了在应用中可能遇到的问题。［结果］在这3个白叶枯病菌菌株的基因组中，由1～6个核苷酸为基序的SSR序列分别有940、926和1 035个;平均每隔5.26、5.34和5.06 kb的距离就有1个大于15 bp的SSR序列。在1～6个核苷酸为基序的SSR序列中，数量最多的是6碱基重复，其次分别是3、5、4、2碱基重复序列，而单碱基重复数目极少。在这3个菌株的基因组中，种类丰富、变异性高的是4、5、6个核苷酸的重复基序，但等位序列上3种菌株间的基序可能不同。［结论］3种白叶枯病菌菌株的SSR在结构类型和分布规律上均具有一定的相似性。

水稻白叶枯病菌解毒素蛋白提纯和作用机制研究

采用 (NH4) 2 SO4分步沉淀法 ,从水稻白叶枯病菌培养滤液中提取对水稻白叶枯病菌有机酸毒素具解毒作用的解毒蛋白粗提物 (crudedetoxificationprotein ,CDP) ,经滚动式等电聚焦电泳 (RPIE)和离子交换层析 (FPLC)分离 ,生物测定结果表明 ,第Ⅱ吸收峰具有生物活性 ;再经SDS PAGE电泳和考马斯亮蓝染色 ,第Ⅱ吸收峰收集物有明显的一条带 ,相对分子质量为 4 7 9× 10 3 。野生菌产生的CDP解毒活性明显低于其毒性基因突变体。CDP对热和蛋白酶K均不稳定 ,对毒素的解毒主要是通过脱羧起作用。用CDP处理水稻后 ,水稻体内与抗病性相关的酶活性显著提高 ;接种水稻白叶枯病菌 。

双重PCR技术检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌

本研究分别设计并合成了白叶枯病菌的专化性引物OSF1-OSR1和条斑病菌的专化性引物XoocF-XoocR。用这两对专化性引物分别对118个参试菌株进行PCR扩增,并且通过将这两对专化性引物配对以及不断优化PCR反应条件,成功建立了双重PCR技术,同时对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌实施快速精确的检测。

水稻白叶枯病菌北方菌株遗传多样性rep-PCR分析

为了揭示水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)北方菌株的遗传结构组成,利用rep-PCR技术对103个从辽宁、吉林、河北、山东稻区采集的Xoo菌株、9个标准小种(R1-R9)代表菌株和13个水稻细菌性条斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola,Xoc)菌株进行了遗传多样性分析。结果表明,ERIC-PCR和BOX-PCR分析均能较好地揭示出测试菌株的遗传多态性,分别获得了84种和90种分子谱型;在相似系数为70%时,ERIC-PCR将所有测试菌株聚类为17个簇群,其中1个为优势簇群;BOX-PCR将测试菌株聚类为10个簇群,其中2个为优势簇群。在相似系数为50%时,Xoo与Xoc测试菌株分别聚类为2个不同的簇群。

乙醛酸缩氨基硫脲及其铜(Ⅱ)、锌(Ⅱ)配合物对水稻白叶枯病菌的杀菌活性研究

合成了乙醛酸缩氨基硫脲及其铜（Ⅱ）、锌（Ⅱ）的配合物，用浓度稀释法测定了它们对水稻白叶枯病菌的杀菌活性，并与防治水稻白叶枯病的常用药物叶青双的杀菌活性进行了对照．实验证明，乙醛酸缩氨基硫脲铜（Ⅱ）、锌（Ⅱ）的配合物均具有杀菌活性，其中铜的配合物的杀菌活性优于叶青双的杀菌活性．

水稻白叶枯病菌hrpF启动子序列调控的绿色荧光蛋白基因表达体系的构建

为了阐明启动子序列对水稻白叶枯病菌效应子基因表达的调控作用及特征,通过融合PCR将报告基因GFP基因置于水稻白叶枯病菌hrpF基因启动子序列的下游,经酶切、PCR鉴定及序列测定,成功构建了受hrpF启动子序列调控的GFP基因转录单元pMF-GFP,并转入JXO I菌株中。结果发现构建的hrpF::GFP转录单元,在hrp诱导培养基XOM2上可有效诱导表达,而在NA培养基上不能诱导表达。结果还显示,在大肠杆菌中,中间表达载体phrpF::GFP具有GFP表达活性。