基于PINK1/Parkin途径探究绿原酸对泡沫细胞线粒体自噬-炎症反应的作用机制

目的探讨绿原酸(chlorogenic acid,CGA)通过同源性磷酸酶张力蛋白诱导激酶1(PINK1)/帕金森蛋白(Parkin)信号通路对ox-LDL诱导的泡沫细胞线粒体自噬及炎症反应的调控作用。方法将RAW264.7巨噬细胞分为正常(Control)组、模型(Model)组、CGA低剂量(CGA-L)组、中剂量(CGA-M)组、高剂量(CGA-H)组、CGA-H+Mdivi-1(CGA-H+Mdi)组。油红O法鉴定细胞泡沫化;CCK-8法确定CGA干预浓度;透射电镜观察细胞线粒体结构改变;ELISA检测IL-1β、IL-18、IFN-γ表达;qRT-PCR及免疫荧光标记法检测PINK1/Parkin线粒体自噬通路相关基因及蛋白表达。结果油红O染色显示泡沫细胞模型制备成功。与Model组相比,不同浓度CGA干预后细胞线粒体损伤明显减轻,诱导了PINK1、Parkin、p-Parkin、PHB2、LC3Ⅱ表达,抑制了TOMM20表达,以及降低了IL-1β、IL-18、IFN-γ的表达(P<0.05或P<0.01);与CGA-H组相比,CGA-H+Mdi组细胞线粒体损伤明显加重,抑制了PINK1、Parkin、p-Parkin、PHB2、LC3Ⅱ表达,诱导了TOMM20表达,以及增强了IL-1β、IL-18、IFN-γ表达(P<0.01)。结论CGA可通过调控PINK1/Parkin通路诱导泡沫细胞线粒体自噬以及抑制了促炎因子IL-1β、IL-18、IFN-γ过表达,这可能是CGA抗动脉粥样硬化机制之一。

铁超载调控氧化性低密度脂蛋白诱导泡沫细胞促动脉粥样硬化活化的作用

目的探讨铁超载对泡沫细胞促动脉粥样硬化(AS)活化的影响。方法RAW264.7和MOVAS细胞株扩增培养,分为正常对照(media)组、oxLDL组、oxLDL+柠檬酸铁铵(oxLDL+FC)组、oxLDL+柠檬酸铁铵+去铁胺(oxLDL+FC+DFO)组,分别以氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)、柠檬酸铁胺(FC)、去铁胺(DFO)刺激。普鲁士蓝和油红O染色检测铁沉积和泡沫细胞生成。CCK-8测定细胞存活率,DHE探针观察活性氧自由基(ROS)生成,ELISA测定还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4),丙二醛(MDA)含量。RT-qPCR检测ATP结合盒转运体A1(ABCA1)和ATP结合盒转运体G1(ABCG1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg-1)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA),平滑肌22a(smooth muscle 22 alpha,SM22a)、骨桥蛋白(OPN),白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达。结果与oxLDL组相比,oxLDL+FC组细胞胆固醇逆向转运分子ABCA1和ABCG1表达降低,细胞泡沫化加重,死亡率上升,且ROS和MDA的表达增加,GPX4表达降低,巨噬细胞M1型标志物及平滑肌细胞合成型标志物升高,炎症因子IL-1β、TNF-α的表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论铁超载能促进泡沫细胞生成,使其向促动脉粥样硬化表型转化,加重脂质过氧化及炎症反应。

动脉粥样硬化发展进程中,单核细胞及单核源性泡沫细胞的力学特性研究

目的在动脉粥样硬化发展进程中,单核细胞迁入血管内膜活化为巨噬细胞,后者不断吞噬ox-LDL,最终演变为泡沫细胞后,难以迁出,致使斑块生长。在此,从生物力学的角度出发,探究整个演变过程中,细胞迁移能力、力学性能的改变及细胞骨架重塑情况,有望为寻求斑块消退策略提供新思路。方法运用Apo E-/-小鼠构建动脉粥样硬化模型。通过免疫磁珠分选提取骨髓处单核细胞,并将单核细胞经佛波酯及ox-LDL各孵育48h,诱导为泡沫细胞,采用油红O染色鉴定。使用Membrane fluidity试剂盒检测两种细胞膜的流动性;通过Transwell检测细胞的迁移能力;利用原子力显微镜测定细胞的弹性模量,并对细胞骨架进行染色与分析。结果油红O染色可见,诱导后的泡沫细胞胞质内有脂滴分布,表明体外诱导成功。研究结果显示,与单核细胞相比,诱导的泡沫细胞其迁移率显著下降,膜流动性逐渐升高,弹性模量显著降低(单核细胞:1.00±0.18k Pa;诱导的泡沫细胞:0.50±0.03 k Pa),也即变形能力反而增强。此外,在CCL2刺激下,细胞均伸出伪足,F-actin/G-actin的值动态改变,表明细胞骨架发生重塑。结论在单核演变为泡沫细胞的过程中,迁移能力不断下降,而这并不是因为细胞的变形能力减弱引起的,也非细胞无法伸出伪足导致,可能与骨架重塑所涉及的分子机制有关。

益脉降脂汤含药血清对THP-1源性泡沫细胞模型miRNA差异表达分析

目的:探讨益脉降脂汤含药血清干预THP-1源性泡沫细胞模型后差异表达miRNA及相关生物功能、信号通路。方法:实验分为巨噬细胞组、泡沫细胞模型组、益脉降脂含药血清组,以佛波酯对THP-1细胞诱导为巨噬细胞,经诱导分化的巨噬细胞给予ox-LDL建立泡沫细胞模型,以益脉降脂汤大鼠血清干预泡沫细胞。提取各组细胞Total RNA进行miRNA测序,筛选差异表达miRNA,预测相关靶基因后进行GO分析、KEGG分析,建立蛋白互作网络、miRNA-靶基因互作网络,RT-qPCR验证改善动脉粥样硬化可能信号通路。结果:空白组与模型组差异miRNA为hsa-miR-302c-3p、hsa-miR-302d-3p、hsa-miR-30d-3p、hsa-miR-3189-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-4781-3p、hsa-miR-663a;模型组和益脉降脂含药血清组差异miRNA为hsa-miR-3150a-3p、hsa-miR-7704、hsa-miR-877-3p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-374b-5p;模型组与益脉降脂含药血清组差异miRNA预测靶基因显示主要富集于MAPK信号通路、ErbB信号通路、Hippo信号通路、Wnt信号通路等信号通路;SCN1A、PRKACA、MECP2、EIF4E、SRSF1、MBNL1、PRKCA、PPARGC1A可能是益脉降脂汤含药血清向THP-1源性泡沫细胞发挥作用潜在关键靶标。结论:hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-374b-5p是益脉降脂汤含药血清作用于泡沫细胞重要的miRNAs,差异表达显著的miRNA以及显著富集的相关信号通路可为诊断和治疗动脉粥样硬化提供新的思路。

水晶兰苷调控巨噬细胞极化减少THP-1源性泡沫细胞形成

目的:探讨水晶兰苷(MON)对巨噬细胞极化和THP-1源性泡沫细胞形成的影响。方法:THP-1细胞与100 ng/mL佛波酯(PMA)共孵育48 h诱导M0巨噬细胞,采用流式细胞术进行鉴定;采用不同浓度的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)(0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL)、不同的ox-LDL干预时间(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h)处理巨噬细胞以诱导泡沫细胞;采用ox-LDL或MON干预巨噬细胞,CCK-8检测细胞活力;设置分组:control组、ox-LDL组和ox-LDL+MON组,采用油红O染色观察各组细胞脂质吞噬情况,采用western blotting、荧光定量PCR(RT-qPCR)评估巨噬细胞极化表现及其与铁死亡相关信号通路的结果。结果:ox-LDL呈浓度和时间依赖性增加iNOS、TNF-α蛋白表达;ox-LDL能显著降低细胞活力,200μmol/L MON可显著恢复细胞活力,单纯MON浓度高达1000μmol/L时,细胞活力下降;经ox-LDL诱导可观察到细胞内大量明显红色脂滴,加入MON处理,细胞内的脂滴可见明显减少;与对照组比较,ox-LDL诱导的巨噬细胞CD86 mRNA、iNOS蛋白表达水平升高,CD206 mRNA、Arg-1、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平降低,而经过MON干预后,CD86 mRNA、iNOS蛋白表达水平降低,Arg-1、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:MON通过减少巨噬细胞M1极化,促进M2极化,从而抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞形成、增强细胞活力,这可能与抑制铁死亡相关。

辣椒来源外泌体样纳米囊泡通过ERK1/2通路拮抗巨噬细胞向泡沫细胞转化

[目的]研究辣椒来源外泌体样纳米囊泡(CDELN)抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导THP-1源性巨噬细胞泡沫化的作用机制。[方法]通过组织破碎、差速/超速离心及蔗糖密度梯度离心等步骤,分离提纯CDELN。利用ox-LDL刺激THP-1源性巨噬细胞24 h建立泡沫细胞模型,并进一步研究CDELN对巨噬细胞泡沫化的作用及其机制。采用激光共聚焦显微镜检测THP-1源性巨噬细胞对CDELN和人DiL标记乙酰化低密度脂蛋白(DiL-ac-LDL)的摄取;采用油红O染色检测细胞内胆固醇含量,通过分析细胞油红O染色阳性面积评估细胞内脂质累积影响;RT-qPCR和Western blot检测清道夫受体A(SRA)、脂肪酸转运蛋白(CD36)、凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)、ATP结合盒转运体A1/G1(ABCA1/G1)以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路p-ERK、p-p38 MAPK和p-c-Jun的mRNA和蛋白表达水平。[结果]CDELN是大小均一、具有双层膜结构、富含蛋白质和核酸的外泌体样纳米囊泡,能被巨噬细胞摄取。DiL-ac-LDL摄取实验提示CDELN可抑制巨噬细胞的胆固醇摄取。油红O染色实验提示CDELN可减轻ox-LDL诱导下的胞内胆固醇蓄积。RT-qPCR及Western blot显示,CDELN能够显著降低ox-LDL诱导的THP-1源性巨噬细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)、SRA、CD36、LOX-1的mRNA水平,以及降低p-ERK、SRA、CD36、LOX-1蛋白水平。加入p-ERK激动剂Yoda1后,CDELN的保护作用被明显逆转。[结论]CDELN可显著抑制巨噬细胞泡沫化,该作用可能与抑制MAPK通路ERK1/2的磷酸化水平有关。

MEST在血管内皮细胞向泡沫细胞转化中的作用

目的前期研究发现,血管内皮细胞是动脉粥样硬化(AS)中泡沫细胞的重要来源。本研究探究中胚层特异性转录本(MEST)在AS动物模型血管中的表达情况,及其在血管内皮细胞向泡沫细胞转化过程中的作用。方法利用Apo E-/-小鼠,通过高脂饮食建立AS模型,同时设置正常饮食对照组。采用免疫荧光技术检测血管内MEST的表达,并分析其与流体剪切力异常之间的关系。通过sh RNA或si RNA技术稳定敲除或降低人主动脉内皮细胞(HAECs)中MEST的表达。使用BODIPY荧光探针评估细胞内脂滴的形成,并通过高效液相色谱(HPLC)测定细胞泡沫化的程度。利用免疫荧光技术分析泡沫细胞中血管内皮细胞标志物(CD31、v WF)、巨噬细胞标志物(CD68)和血管平滑肌细胞标志物(α-SMA)的表达变化。结果模型组主动脉弓区域有流体剪切力异常和AS斑块形成,且MEST表达显著下降。MEST敲降导致BODIPY标记的脂滴增加,胆固醇酯与总胆固醇比值上升(由正常的32.58±1.530%增至53.27±2.025%,P<0.001),表明血管内皮细胞已转化为泡沫细胞。与正常HAECs相比,泡沫细胞中CD31和v WF的表达降低,而CD68和α-SMA的表达增加。结论MEST的低表达与AS斑块的形成密切相关。MEST敲低促使人主动脉内皮细胞向泡沫细胞转化,伴随着血管内皮细胞表型的丧失及巨噬细胞和血管平滑肌细胞表型的增强。

Krüppel样因子4通过支持PPARγ信号通路维持细胞稳态以保护血管平滑肌细胞免受泡沫细胞样表型转化的损害

动脉粥样硬化(AS)被普遍认为是一种血管壁细胞(包括内皮细胞和血管平滑肌细胞)、循环细胞以及固有免疫原性细胞(例如单核细胞/巨噬细胞)等多种细胞综合作用引起的炎症性疾病。其中血管平滑肌细胞(VSMCs)胆固醇超负荷形成的泡沫细胞可能在动脉粥样硬化的进展中发挥重要作用。Krüppel样因子4(KLF4)是一种关键的抗炎转录因子,尤其在心血管疾病方面,已被证实发挥了重要的血管功能保护作用。然而,目前尚不清楚KLF4是否在AS过程胆固醇对VSMCs的损伤中发挥保护作用。该研究旨在探讨KLF4在AS进展过程中VSMCs泡沫细胞样表型转化的作用及其分子机制。小鼠AS造模结果显示,KLF4缺失增加动脉粥样硬化斑块面积(P<0.05),并增加动脉壁脂质蓄积(P<0.05)及血清胆固醇含量(P<0.05),加速AS进展。细胞内油红O染色及胆固醇含量测定研究证实,KLF4缺失促进VSMCs内胆固醇蓄积(P<0.05)。QRT-PCR和Western印迹结果证实,KLF4缺失促进VSMCs胆固醇摄取、合成、促炎因子分泌及巨噬细胞黏附和胆固醇损伤诱导的巨噬细胞标志物的表达(P<0.05),抑制胆固醇流出和氧化相关基因及收缩表型标志物的表达(P<0.05),加速VSMCs源性泡沫细胞形成。KLF4敲除VSMCs中利用腺病毒Ad-GFP-KLF4补救表达KLF4,显著逆转上述改变,并阻断由胆固醇蓄积诱导的TLR4-MyD88-p65通路的激活。随后,siRNA诱导的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的选择性基因消融消除了KLF4的这些作用。总之,我们的研究结果提示,KLF4通过激活PPARγ途径,抑制胆固醇摄取和合成,加速胆固醇流出,同时抑制促炎因子分泌、巨噬细胞黏附和胆固醇损伤诱导的巨噬细胞标志物表达,从而在VSMCs中实现对胆固醇刺激的保护作用。

葛花提取物通过激活PPARγ上调ABCA1的表达而抑制THP-1源性泡沫细胞形成

[目的]探寻葛花提取物(PFE)对巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积的影响。[方法]通过MTT法筛选PFE对THP-1源性泡沫细胞的作用浓度,采用油红O染色和胆固醇检测试剂盒检测细胞内脂质蓄积情况,采用胆固醇流出试剂盒检测细胞的胆固醇流出水平,使用RT-qPCR和Western blot检测mRNA和蛋白表达。[结果]PFE显著降低THP-1源性泡沫细胞内的脂质蓄积。PFE不影响CD36、清道夫受体AⅠ(SR-AⅠ)、固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)及3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)的mRNA表达,但能上调ATP结合盒转运体A1(ABCA1)的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),促进巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出(P<0.01)。PFE可以激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的活性(P<0.01)及上调其mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)。与PFE对照组相比,加入GW9662处理后PPARγ和ABCA1的蛋白表达水平均下降(P<0.01),胆固醇流出水平降低(P<0.01)。[结论]PFE可显著改善THP-1源性泡沫细胞内的脂质蓄积,通过PPARγ上调ABCA1表达及其介导的胆固醇流出抑制泡沫细胞形成。

微小RNA-145-5p靶向Toll样受体4参与动脉粥样硬化泡沫细胞炎症和氧化应激反应

目的 探讨微小RNA-145-5p(miR-145-5p)对动脉粥样硬化细胞模型中炎性反应和氧化应激过程的调控作用。方法 体外构建人单核细胞白血病细胞源性泡沫细胞,分为模型组和对照组,采用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞内miR-145-5p相对表达。采用TargetScan数据库预测miR-145-5p与Toll样受体4(TLR4)的靶向关系。将293T细胞分为野生型+模拟物(mimic)组(转染TLR4野生型质粒+miR-145-5p模拟物)、野生型+mimic NC组(转染TLR4野生型质粒+miR-145-5p模拟物阴性对照)、突变型+mimic组(转染TLR4突变型质粒+miR-145-5p模拟物)、突变型+mimic NC组(转染TLR4突变型质粒+miR-145-5p模拟物阴性对照),采用双荧光素酶实验验证miR-145-5p与TLR4的靶向关系。体外诱导泡沫细胞,分为mimic组(转染miR-145-5p模拟物)、mimic NC组(转染模拟物阴性对照)、抑制物(inhibitor)组(转染miR-145-5p抑制物)、inhibitor NC组(转染抑制物阴性对照),采用qRT-PCR、Western blot检测TLR4 mRNA及蛋白表达,酶联免疫吸附检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)1β和IL-6表达,生化相关试剂盒测定活性氧、丙二醛和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果 与对照组比较,模型组miR-145-5p表达明显降低(0.29±0.01 vs 1.00±0.08,t=11.180,P<0.01)。双荧光素酶实验显示,miR-145-5p mimic组荧光素酶活性较mimic NC组显著降低,差异有统计学意义(t=8.612,P<0.01)。与mimic NC组比较,mimic组TLR4 mRNA及蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6、活性氧、丙二醛含量明显降低,miR-145-5p表达、SOD活性明显升高(P<0.05,P<0.01)。与inhibitor NC组比较,inhibitor组TLR4 mRNA及蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6、活性氧、丙二醛含量明显升高,miR-145-5p表达、SOD活性明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论 miR-145-5p通过靶向TLR4抑制动脉粥样硬化细胞模型中的炎症和氧化应激反应。

补骨脂酚通过抑制ERK1/2磷酸化并上调ABCA1表达减少巨噬细胞源性泡沫细胞形成

[目的]探讨补骨脂酚(BAK)对巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积的影响及机制。[方法]MTT筛选BAK对泡沫细胞药物毒性浓度;油红O染色、NBD胆固醇、Dil-ox-LDL检测泡沫细胞内脂质蓄积情况;使用RT-qPCR和Western blot检测mRNA和蛋白表达。[结果]BAK可以促进胆固醇流出并减少泡沫细胞内脂质蓄积。BAK可以上调三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的mRNA和蛋白表达水平,同时可下调细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)磷酸化水平。使用ERK1/2激动剂Ro 67-7476处理发现,与BAK处理组相比,加入Ro 67-7476处理后ABCA1蛋白表达下降。[结论]BAK通过抑制ERK1/2的磷酸化,上调ABCA1的表达并促进胆固醇的流出,减少泡沫细胞中的脂质蓄积,从而抑制泡沫细胞的形成。

极光激酶A通过促进巨噬细胞源性泡沫细胞形成参与动脉粥样硬化发生发展

目的:明确极光激酶A(Aurora kinase A,AurkA)是否通过调控巨噬细胞源性泡沫细胞形成参与动脉粥样硬化发生发展。方法:从GEO数据库提取动脉粥样硬化小鼠主动脉基因表达谱数据(GSE 19286),选择特异性探针分析AurkA表达。选用8周龄普通饲料喂养的C57BL/6J健康雄性小鼠作为CC组(喂养普通饲料),将8周龄C57BL/6J背景的ApoE^(-/-)(Apolipoprotein E KO)健康雄性小鼠随机分为AN组(喂养普通饲料)和AH组(喂养21%脂肪,0.5%胆固醇的高脂饲料),喂养16周。收集外周血及主动脉、肝脏、脾脏等组织样本,检测血清总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平和主动脉大体油红染色确认动脉粥样硬化小鼠模型建模成功后,利用qPCR方法检测各组织AurkA mRNA表达。选用8周龄C57BL/6J背景的ApoE^(-/-)健康雄性小鼠,随机分为MC组(溶剂处理的高脂喂养的ApoE^(-/-)小鼠)和M组(AurkA抑制剂MLN8237处理的高脂喂养的ApoE^(-/-)小鼠),以同样方法高脂喂食16周构建动脉粥样硬化小鼠模型。在建模第12周开始M组给予小鼠20 mg·kg^(-1)MLN8237灌胃,每周2次,持续4周,MC组给予小鼠同等体积溶剂(10%2-羟丙基-β-环糊精和1%碳酸氢钠)处理。在建模16周后取外周血,检测血脂水平的同时,经流式细胞术检测外周血中髓性细胞占比;取主动脉经大体油红染色检测斑块总面积;取心脏制备主动脉根部切片经HE和油红染色后分析斑块面积以及斑块内脂质累积情况。基于Bloodspot数据库分析AurkA mRNA在各类血液细胞中的表达模式并构建细胞模型,使用8周龄C57BL/6J小鼠获取骨髓细胞悬液,加入10 ng·mL^(-1)M-CSF诱导成为骨髓源性巨噬细胞,重新铺板分为对照组(Con)、建模组(ox-LDL)以及AurkA抑制剂处理组(ox-LDL+TCS)。在建模组(ox-LDL)和AurkA抑制剂处理组(ox-LDL+TCS)细胞中加入100μg·mL^(-1)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)构建泡沫细胞模型,同时给予ox-LDL+TCS组10 nM AurkA抑制剂TCS7010处理,给予ox-LDL组等量溶剂处理,48 h后利用油红染色检测泡沫细胞的脂质累积情况。结果:动脉粥样硬化小鼠主动脉基因表达谱数据显示,AurkA mRNA在病灶区的表达呈上升趋势。与CC组和AN组相比,AH组血清中的TC、TG以及LCL-C水平均升高(P<0.05),同时主动脉中存在大量粥样斑块沉积,提示造模成功。相较AN组,AH组小鼠肝脏、脾脏以及主动脉中的AurkA mRNA水平均有上调(P<0.05)。在给予MLN8237处理后,与MC组相比,M组的体重、血脂水平以及主动脉斑块总面积均无显著改变(P>0.05),但其主动脉根部的斑块面积以及斑块内的脂质累积均减少(P<0.05)。流式细胞术分析结果显示,M组小鼠外周血中的髓性细胞占比与MC组相当(P>0.05),但单核细胞占比降低(P<0.05)。AurkA在血液细胞中的表达谱分析显示,其在髓性细胞尤其是巨噬细胞中特异性高表达。在细胞实验中,与ox-LDL组相比,ox-LDL+TCS组的油红阳性面积占比下降(P<0.05),提示AurkA抑制剂能够下调巨噬细胞的脂质累积从而抑制泡沫细胞生成。结论:AurkA通过调控外周血中的单核细胞数量以及斑块中巨噬细胞源性泡沫细胞生成促进动脉粥样硬化发生发展,抑制AurkA活性可有效改善动脉粥样硬化进程。

调控动脉粥样硬化泡沫细胞形成的信号通路研究进展

动脉粥样硬化作为心脑血管系统中常见的慢性炎症疾病,是冠心病和脑卒中等心血管疾病的主要诱因,多发于血脂异常、高血压和吸烟等群体,早期症状不明显且预后较差。在动脉粥样硬化发病过程中,源于单核巨噬细胞和血管壁平滑肌细胞的泡沫细胞形成和积累是病变发展的标志性事件,研究调控泡沫细胞形成的分子机制对于阐明动脉粥样硬化发病机制以及发现治疗可用的新靶点意义重大。脂质代谢紊乱、脂噬功能障碍、炎症反应以及细胞凋亡异常是影响细胞泡沫化的常见机制,但这些细胞应答上游的信号通路调控网络仍不明晰。本文基于信号通路调控回顾了泡沫细胞的生成过程及其调控机制,总结了PI3K/AKT、MAPK、AMPK、NF-κB、PPARγ/LXRα等信号通路在泡沫化过程中对于脂质代谢、脂噬、炎症以及细胞凋亡等过程的促进或抑制作用,明确了上游信号通路和下游细胞应答间的作用关系,同时概括了可通过调控以上信号通路影响泡沫细胞形成从而抗动脉粥样硬化的潜在药用成分,在构建泡沫细胞形成过程中分子调控网络的同时,也为动脉粥样硬化的临床治疗研究提供了理论依据。

人参炔三醇抑制氧化低密度脂蛋白诱导泡沫细胞形成的作用机制研究

目的探讨人参炔三醇(panaxytriol,PXT)抑制氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)诱导单核巨噬细胞脂质沉积的作用机制。方法单核细胞THP-1经佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导成巨噬细胞后,采用不同浓度(0、1、5、10、20μmol/L)PXT处理单核巨噬细胞24小时,通过MTT法检测其对细胞存活率的影响。THP-1单核巨噬细胞经PMA刺激后,利用oxLDL诱导脂质蓄积,PXT处理后利用流式细胞仪,荧光显微镜和油红O染色检测巨噬细胞对oxLDL的摄取。采用Western blot检测细胞内白细胞分化抗原36(cluster of differentiation,CD36)、三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、清道夫受体B1(scavenger receptor class B type 1,SRB1)的蛋白表达水平变化。结果MTT实验结果显示,与正常组比较,20μmol/L PXT处理THP-1单核巨噬细胞24小时后显著抑制了细胞活力(P<0.05),且其他浓度对细胞活力均无显著影响。流式细胞检测、细胞荧光成像和油红O染色结果显示,与模型组比较,PXT浓度依赖地降低巨噬细胞内DiI-oxLDL荧光强度与细胞内脂质蓄积(P<0.05)。Western blot结果显示,与模型组比较,PXT浓度依赖地降低了巨噬细胞中CD36蛋白的表达(P<0.05),而对其他蛋白无显著影响。结论PXT通过抑制清道夫受体CD36的表达,抑制巨噬细胞对oxLDL的吞噬及泡沫细胞的形成,具有潜在的抗动脉粥样硬化活性。

柿叶总黄酮抑制巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积的作用研究

目的探讨柿叶总黄酮对巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇脂质蓄积的影响及其潜在机制。方法体外培养THP-1细胞,160nmol/L佛波酯诱导分化为巨噬细胞,与50μg/mL ox-LDL孵育建立巨噬细胞源性泡沫细胞模型,分别用不同浓度的柿叶总黄酮(0、0.5、1、2、4μg/mL)处理。油红O染色检测细胞内脂质蓄积情况,高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量,qPCR和Western blot分别检测SR-A和ABCA1 mRNA和蛋白表达情况。结果柿叶总黄酮能显著性抑制巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积,减少细胞内游离胆固醇(FC)、总胆固醇(TC)和胆固醇酯(CE)含量,降低相关蛋白SR-A的摄取以及促进胆固醇外排关键蛋白ABCA1表达。结论柿叶总黄酮通过降低相关蛋白SR-A的摄取以及促进胆固醇外排关键蛋白ABCA1表达,减少细胞内胆固醇含量,抑制巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积。

基于miRNA测序研究阿托伐他汀干预THP-1源性泡沫细胞模型的机制

目的探讨阿托伐他汀含药血清干预THP-1源性泡沫细胞模型的机制。方法提取阿托伐他汀钙片大鼠含药血清;将人源THP-1细胞用佛波酯(PMA)刺激诱导分化成巨噬细胞,后将巨噬细胞通过氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)孵育建立泡沫细胞模型;将建模后的泡沫细胞分成模型组和西药组,分别加入正常血清与阿托伐他汀钙片含药血清进行干预;提取总RNA进行miRNA测序;将测序筛选出的差异miRNA结果通过生物信息学方法进行靶基因预测,并对相关靶基因进行基因本体论(GO)富集分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析。结果经测序筛选差异miRNA有56条,预测靶基因1713个,GO富集分析显示预测靶基因参与18种生物学过程,有15种分子功能,含7种细胞组分类型;KEGG通路富集分析得到20条信号通路。结论阿托伐他汀含药血清干预THP-1源性泡沫细胞模型差异miRNA中,差异倍数显著且表达量丰富的上、下调miRNA分别为hsa-miR-3184-3p与hsa-miR-423-5p,KEGG通路富集最显著的信号通路为MAPK信号通路、Hippo信号通路、Wnt信号通路。

达格列净在ox-LDL诱导形成的THP-1源性泡沫细胞焦亡中的作用

目的探讨达格列净(DAPA)在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导形成的人髓系白血病单核细胞(THP-1)源性泡沫细胞焦亡中的作用。方法通过ox-LDL诱导THP-1源性巨噬细胞构建THP-1源性泡沫细胞焦亡模型。设置实验分组为:空白对照(NC)组、ox-LDL组和药物干预(ox-LDL+DAPA)组;以油红O法检测巨噬细胞泡沫化水平;细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)检测DAPA对泡沫细胞活力的影响;Hoechst 33342/PI双染检测THP-1源性泡沫细胞焦亡;细胞免疫荧光双染检测DAPA对泡沫细胞焦亡中焦亡关键因子Caspase-1表达的影响;采用微量酶标法检测细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活性;采用qRT-PCR和Western blot分别检测核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、消皮素D(GSDMD)、白细胞介素(IL)-18、IL-1βmRNA和蛋白表达水平。结果CCK-8法检测结果提示DAPA的最佳干预浓度为10μmol/L;油红O染色结果示THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞焦亡模型构建成功;与NC组比较,ox-LDL组中NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD、IL-18、IL-1β mRNA和蛋白表达水平均升高(P<0.05),碘化丙啶(PI)阳性细胞数及LDH活性增加(P<0.05),Caspase-1的荧光强度增强,细胞胞质内的红色脂滴增多;予DAPA干预后,ox-LDL+DAPA组中前述焦亡相关因子的mRNA和蛋白表达水平均降低(均P<0.05),PI阳性细胞数及LDH活性降低(P<0.05),Caspase-1的荧光强度减弱,细胞胞质内的红色脂滴减少(P<0.05)。结论DAPA对ox-LDL诱导形成的THP-1源性泡沫细胞焦亡具有抑制作用。

miRNA-34a-5p靶向Fut8抑制巨噬源性泡沫细胞的运动能力

目的探讨miRNA-34a-5p/岩藻糖基转移酶8(fucosyltransferase,Fut8)轴对巨噬源性泡沫细胞运动能力的影响。方法首先利用生物信息学和RT-PCR寻找并检测Fut8基因上游的调控miRNA变化情况;其次利用Pearson相关性分析观察斑块组患者血清中Fut8和miRNA的相关性;最后构建泡沫细胞模型观察miRNA对泡沫细胞运动能力的影响并明确Fut8在其中的重要作用。结果miRNA-34a-5p和miRNA-449b-5p在斑块组患者血清中均显著上升,但miRNA-34a-5p与Fut8有更大的相关性。miRNA-34a-5p在泡沫细胞形成时含量显著升高,抑制miRNA-34a-5p表达会促进Fut8的表达。高表达的miRNA-34a-5p会导致穿透到下室的细胞数量减少。过表达Fut8预处理细胞,会增加穿透到下室的细胞数量。结论miRNA-34a-5p为Fut8的上游miRNA之一,通过下调Fut8表达而抑制巨噬源性泡沫细胞运动能力。

PLIN2在氧化型低密度脂蛋白诱导的泡沫细胞脂噬中的作用

目的 探讨围脂滴蛋白2(PLIN2)在泡沫细胞脂噬中的作用,为动脉粥样硬化相关疾病的防治提供更多思路。方法 构建氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的泡沫细胞模型,沉默细胞内PLIN2基因表达,将细胞分为5组:对照组、空质粒组、ox-LDL处理组、siPLIN2组、ox-LDL+siPLIN2组。应用油红O染色法观察细胞内脂质蓄积情况,采用Western blot观察细胞内PLIN2和脂噬相关蛋白LC3和p62表达情况。结果 在ox-LDL诱导的泡沫细胞形成过程中LC3蛋白表达量随着脂质的增加而增加,p62则先减少后增加;在PLIN2沉默的RAW264.7巨噬细胞中LC3表达下调;在PLIN2沉默的泡沫细胞中,p62蛋白表达量明显增加,脂噬减弱。结论 在ox-LDL诱导的泡沫细胞中,敲减PLIN2可下调p62的表达,减弱细胞内脂噬。

苦瓜蛋白对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的形成及三磷酸腺苷结合盒转运体A1的影响

为研究苦瓜蛋白对泡沫细胞形成的作用及其机制 ,用离心、超滤和色谱技术从苦瓜 (MomordicacharantiaL)果肉中提取苦瓜蛋白 (Momordicin) ,THP 1细胞经 16 0nmol/LPMA孵育 2 4h ,诱导其分化成巨噬细胞 ,然后用 2 5mg/L乙酰化低密度脂蛋白孵育 4 8h ,使其泡沫化 ,以观察苦瓜蛋白对泡沫细胞形成的影响。用高效液相色谱法分析细胞内胆固醇和胆固醇酯的变化 ,用逆转录—聚合酶链反应技术检测苦瓜蛋白对三磷酸腺苷结合盒转运体A1的影响。结果发现 ,经苦瓜蛋白作用后 ,细胞内总胆固醇及胆固醇酯均显著减少 (对照组总胆固醇为 6 34± 2 1,苦瓜蛋白处理组为 2 5 7± 2 6 ,P <0 .0 1;对照组胆固醇酯为 339± 2 1,苦瓜蛋白处理组为 93± 9,P <0 .0 1)。胆固醇酯与总胆固醇比值从对照组的 6 2 .9%下降到 36 .2 %。同时 ,细胞内三磷酸腺苷结合盒转运体A1表达显著上调 (P <0 .0 5 )。提示苦瓜蛋白抑制THP 1单核巨噬细胞源性泡沫细胞的形成可能与上调三磷酸腺苷结合盒转运体A1有关。