圈养非洲白犀牛初乳蛋白组分及5种酶活性测定

为了积累圈养非洲白犀牛初乳蛋白组分和酶活性的基础数据,本研究对非洲圈养白犀牛分娩后1-5天的初乳成分进行分析。用考马斯亮蓝法对白犀牛初乳蛋白质含量进行测定,以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续垂直板状电泳分离乳蛋白各组分,并用分光光度法测定淀粉酶(AMS)、乳过氧化物酶(LP)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)、碱性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰胺转移酶(γ-GT)等5种酶活性。结果显示:白犀牛初乳中蛋白质浓度第1天最高为150.33±4.2 mg/mL,后呈下降趋势,约为荷斯坦牛乳蛋白质浓度的5倍。白犀牛初乳中Igs含量最为丰富,第1天最高为38.59%,后呈下降趋势;荷斯坦牛乳以CN为含量最丰富的蛋白质,为49.41%。AMS、LP和ALP的活性第2天最高为46.27±0.42 U/100 mL、299.33±15.5 U/mL和193.22±1.63 U/100 mL,后逐渐下降,其中各天LP活性均高于荷斯坦牛乳;NAGase活性第1天最高为48.22±1.15 U/L后逐渐下降,各天活性均高于荷斯坦牛乳;γ-GT活性呈上升趋势,第5天最高为1053.85±6.78 U/100 mL,高于荷斯坦牛乳。

红花注射液生物活性测定法的建立与评价研究

目的基于红花注射液具有抗血小板聚集作用,建立红花注射液生物活性测定方法,优化红花注射液质量控制模式。方法通过红花注射液体外抗血小板聚集活性建立试验系,对诱导剂的种类、血小板的数量及不同的剂间比都做了对比,进行量效学关系考察并定义效价,采用量反应平行线(3.3)法进行实验设计及计算效价,建立红花注射液生物活性测定法并验证其可行性。结果选择二磷酸腺苷作为血小板聚集诱导剂,血小板的数量选用500×10^(9)个·L^(-1)。通过量效关系考察,发现红花注射液在剂间比为1∶0.5,在25%~100%与测定值线性良好,并测定了4个厂家8个批次红花注射液的效价,验证了方法的适用性。结论本方法结果可靠且重复性和中间精密度良好,通过效价测定量化了红花注射液抑制血小板聚集活性以评价不同批次红花注射液质量,在现行的红花注射液质量控制的模式上进行补充,对全面控制红花注射液的质量具有重大意义。

生物活性测定法在中药质量控制应用中的研究进展

生物活性测定法可以有效保障中药的有效性和安全性,在中药质量检测中有良好的应用前景,同时可以和其他质量检测方法联合应用,建立多元化的中药质量控制模式。但生物活性测定法也存在一定的不足,面临许多的挑战,需要进一步的探索和发展。本文在介绍生物活性测定法基本内容的基础上,通过查找和阅读国内外相关文献,讨论生物活性测定法相较于化学分析方法和传统感官评价方法在中药质量检测中的优势及应用,以探讨生物活性测定法在中药质量控制中的应用及研究进展。

植物提取物0.3%SN-016水剂防治根结线虫生物活性测定

为了筛选高效、低毒、安全、无残留、环境友好型的新型植物源杀线虫剂,潍坊植物病原线虫联合研究团队项目组进行了植物提取物0.3%SN-016水剂(AS)防治根结线虫生物活性测定。项目组采用“Z”字形五点采样法,在试验地采集黄瓜根结线虫、番茄根结线虫、西瓜根结线虫土样。在实验室,项目组采用离心悬浮法,结合卡勃(Cobb)过筛分离法,分离出南方根结线虫(Meloidogyne incognita Chitwood)侵染性二龄幼虫。测定结果表明:在处理1(浓度8 g/L))、处理2(浓度4 g/L)、处理3(浓度2 g/L)、处理4(浓度1 g/L)、处理5(浓度0.5 g/L)中,侵染性二龄幼虫死亡率平准值分别为97.18%、81.74%、44.39%、14.62%、8.81%。指出了在处理1(浓度8 g/L))和处理2(浓度4 g/L)中,侵染性二龄幼虫的死亡率平准值分别为97.18%、81.74%,这表明植物提取0.3%SN-016水剂(AS)对黄瓜根结线虫、番茄根结线虫、西瓜根结线虫侵染性二龄幼虫有良好的生物活性。

基于保肝降酶作用的舒肝宁注射液相对生物活性测定法的建立与生物均一性评价

目的考察舒肝宁注射液(SGN)的保肝降酶退黄作用,并基于保肝降酶作用,以谷丙转氨酶(ALT)活性抑制率为指标建立SGN相对生物活性测定法,评价其批内及批间的生物均一性。方法采用120μg·mL^(-1)脂多糖(LPS)刺激人正常肝细胞(L-O2)12 h建立体外急性肝损伤模型,利用微板法考察SGN对谷草转氨酶(AST)、ALT、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、丙二醛(MDA)含量的影响,评价其保肝降酶退黄作用,再通过考察SGN中12个主要成分(黄芩苷、黄芩素、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、次黄嘌呤、L-亮氨酸、栀子苷、鸟苷、尿苷、腺苷、京尼平龙胆双糖苷)对上述指标的影响,筛选具有明显量效关系的成分与指标。通过可靠性检验筛选标准品和检测指标,并标定效价,按照“量反应平行线(3,3)法”计算SGN保肝降酶生物活性相对效价,并评价SGN批内和批间生物均一性。结果与Control组比较,LPS组AST、ALT活性明显增强,TBIL、DBIL、MDA含量明显升高,GSH-Px活性明显减弱;与LPS组比较,SGN-M、SGN-H组AST、ALT活性明显减弱,TBIL、DBIL、MDA含量明显降低,GSH-Px活性明显增强;SGN-L组TBIL、DBIL、MDA含量明显降低。SGN的12个成分中同时具有保肝降酶退黄作用的为黄芩苷和绿原酸,并筛选出呈剂量依赖性的指标和成分。通过可靠性检验结果选择以SGN批次(20210112)为标准品,ALT活性抑制率为检测指标,建立基于保肝降酶作用的SGN生物活性测定法。利用“量反应平行线(3,3)法”计算SGN保肝降酶生物活性相对效价,同一批次10个不同SGN(批次:20210324)保肝降酶生物效价在95.6%~111.9%;不同批次的9个不同SGN保肝降酶生物效价在95.6%~103.8%。结论SGN能减轻LPS诱导的L-O2细胞急性肝损伤,改善肝功能,降低胆红素及氧化应激水平,从而发挥保肝降酶退黄作用。SGN的12个主要成分中黄芩苷和绿原酸可以同时抑制AST、ALT活性,降低TBIL、DBIL、MDA含量,增强GSH-Px活性,是其保肝降酶退黄的主要有效成分。建立的SGN生物活性测定方法精密度高、结果可靠,可用于SGN生物学质量控制。

基于镇痛作用的金骨莲胶囊生物活性测定方法研究

目的建立金骨莲胶囊的生物活性测定方法。方法将50只昆明小鼠随机分为空白对照组[等量0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)],阳性药对照组(阿司匹林36.40 mg/kg),金骨莲胶囊低、中、高剂量组(113.75,227.50,455.00 mg/kg),各10只。各组小鼠分别按每1 kg体质量灌胃10 mL相应药物,连续7 d,再腹腔注射1%醋酸溶液,测定小鼠20 min内的扭体次数,并测定10批金骨莲胶囊的生物活性。结果与空白对照组比较,金骨莲胶囊低、中、高剂量组小鼠20 min内的扭体次数均显著减少(P<0.01);重复性、中间精密度、方法适用性试验结果的RSD均小于8.0%。结论10批金骨莲胶囊样品均显示出了较好的生物活性。建立的金骨莲胶囊生物活性测定方法准确、可靠,可为建立该制剂更系统、全面的质量控制标准提供参考。

结核分枝杆菌和卡介苗菌株中喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPRT)的原核表达及酶活性测定

为了在原核表达系统E.coli中表达并纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis)H37Ra和卡介苗菌株(Mycobacterium bovis bacilli-Calmette-Guerin,BCG)str.Pasteur 1173P2的喹啉酸磷酸核糖转移酶(quinolinic acid phosphoribosyl transferase,QPRT),探索不同来源QPRT蛋白结构,并测定其酶活性,试验采用PCR方法分别对M.tuberculosis和BCG中QPRT的编码基因nadC进行扩增,与pET-28a载体连接构建重组载体并在E.coli中完成原核蛋白的表达,在体外进行目的蛋白的纯化,利用高效液相色谱法检测不同来源的QPRT蛋白酶活性,使用PyMOL v2.3.2软件分析其氨基酸残基结构。结果表明:在体外成功克隆了M.tuberculosis和BCG中的大小为858 bp的编码基因nadC,并成功构建出重组载体pET-28a-nadC-MTB和pET-28a-nadC-BCG,在E.coli中进行QPRT蛋白的表达与体外纯化后获得分子量为34 ku的QPRT蛋白;两种不同菌株来源的QPRT蛋白以喹啉酸(quinolinic acid,QA)为底物时酶活性无差异;不同来源的QPRT蛋白中存在1个差异氨基酸残基位点,但酶活性并无明显差异。说明QA的结构类似物吡嗪酸(pyrazinoic acid,POA)不是QPRT的底物,为抗结核药物靶点的探索提供了潜在价值。

生物膜活性测定中TTC-脱氢酶活性测定法的改进

对生物膜活性测定中氯化三苯基四氮唑(TTC)-脱氢酶活性测定法进行了改进,解决了标准曲线制作稳定性差的问题,对测定中的诸多影响因素进行比较分析,确定了改进后的脱氢酶活性测定的最佳条件.结果表明,以甲苯作为萃取剂的液-液分层明显,提取效果好,操作简便.以硫化钠代替连二亚硫酸钠作还原剂,效果较好,显色稳定不褪色.反应的适宜pH值为8.6,适宜温度为38℃.同时确定了生物膜的最佳培养反应时间为6h.

日本对虾溶血素的活性测定及性能研究

于1997年10－11月，以青岛市红岛养殖场养殖的日本对虾为材料，采用分光光度法对其血淋巴中的溶血素进行活性检测，研究多种理化因子对其溶血性能的影响，以及日本对虾溶血素经细菌和虫草多糖肌肉注射刺激后的活性变化。结果表明，日本对虾溶血素的活性同对虾的健康状况密切相关。该溶血累经60℃以下处理溶血作用有所增强，在pH=5－9时溶血活性最高，Ca2＋、Fe2＋可增强溶血作用。注射大肠杆菌（2×107cells／尾）和虫草多糖能够诱导日本对虾溶血素的产生，使溶血活性有所提高；而注射哈维氏弧菌（7×107cells／尾）会导致对虾发病，降低溶血素的活性。

西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因启动子的克隆及活性测定

【目的】克隆测定西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因(fatty acid synthase,FAS)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为奶山羊FAS基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】根据牛和人脂肪酸合酶基因启动子的同源序列以及西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因5′UTR区域,分别设计上、下游引物,以西农萨能奶山羊全血DNA为模板克隆启动子序列。依据生物信息学分析结果重设引物,将FAS启动子基因分段克隆并连接到荧光素酶表达载体PGL-3,与Psv-β-半乳糖苷酶对照载体共转染293、MCF-7细胞,进行荧光素酶活性检测和β-半乳糖苷酶的活性检测。【结果】FAS基因启动子序列全长2640bp,与牛、人FAS启动子序列同源性90%以上,包括数个潜在SP1、Ets、LSF等转录因子结合位点和CCAAT框、GC框。-1040—-340bp处可能包含启动子活性中心,通过启动子缺失片段试验将活性中心范围缩小至-721—-540bp之间。【结论】通过克隆FAS基因启动子区域,分析表明启动子前端存在负调控元件,找出了启动子最小活性中心。

棉蚜吡虫啉、啶虫脒不同品系解毒酶活性测定和增效剂作用的研究

通过棉蚜Aphis gossypii吡虫啉和啶虫脒抗性、敏感品系解毒酶活性测定和增效剂试验,明确与抗药性产生密切相关的解毒酶。采用室内生物测定和生化分析方法,研究棉蚜吡虫啉和啶虫脒品系解毒酶活性变化和增效剂的增效作用。解毒酶活性测定表明,棉蚜吡虫啉和啶虫脒抗性品系羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、细胞色素P450s O-脱乙基比活力都高于敏感品系,其中抗感品系中羧酸酯酶、细胞色素P450-O-脱乙基比活力差异都达到了显著水平(P<0.05)。吡虫啉抗性品系三种解毒酶活性分别为敏感品系的3.26倍、1.08倍、1.60倍和1.58倍;啶虫脒抗性品系三种解毒酶活性分别为敏感品系的2.91倍、1.04倍、1.69倍和1.46倍。增效剂磷酸三苯酯(TPP)、增效醚(PBO)、顺丁烯二酸二乙酯(DEM),在吡虫啉敏感品系中的增效比分别为1.12、1.09、0.97,在吡虫啉抗性品系中的增效比分别为2.02、1.75、1.05;在啶虫脒敏感棉蚜品系中的增效比为1.02、1.03、1.02,在啶虫脒抗性棉蚜品系中的增效比为1.77、1.61、1.04。增效剂试验和解毒酶试验表明,酯酶和多功能氧化酶在棉蚜对吡虫啉、啶虫脒的抗性产生中起到了重要的作用。

植物源杀菌剂研究进展Ⅱ:活性测定、活性物质及其应用

文章对植物源杀真菌剂和杀细菌剂的抑菌生物活性测定方法、抑菌的植物源活性物质以及抑菌植物在防治植物病害上的应用进行了概述,指出在植物源杀菌剂研究开发中存在的问题,提出今后对植物源农药应加强几方面的研究:(1)加强对活性先导化合物分离技术及人工模拟合成的研究;(2)借鉴活性测定技术,开发出快速、准确追踪活性化合物的方法;(3)加强对抑菌植物的综合利用及深加工研究;(4)加快植物源杀菌剂作用机理的研究;(5)加强科研单位与企业的联合,加大研发力度,实现植物源农药产业化开发。

17种杀菌剂对贡柑炭疽病菌的生物活性测定研究

采用菌丝生长速率法测定了17种杀菌剂对发生于德庆的贡柑炭疽病菌的生物活性。结果表明,参测的12种新杀菌剂中,10种新杀菌剂[250 g/L施保克乳油、50%施保功可湿性粉剂、250 g/L势克乳油、250 g/L凯润乳油、250 g/L必扑尔乳油、300 g/L爱苗乳油、10%世高水分散粒剂、62%霜炭清(B)可湿性粉剂、75 g/L欧宝乳油和250 g/L富力库水乳剂]均对贡柑炭疽病菌表现出优异的抑制作用,EC50值介于0.0128～0.3637μg/mL之间,明显优于参测的250 g/L阿米西达悬浮剂(EC50=14.9902μg/mL)、50%翠贝水分散粒剂(EC50=114.7402μg/mL)和50%多菌灵可湿性粉剂(EC50=8.3998μg/mL)、40%达科宁悬浮剂(EC50=13.2340μg/mL)、62%双博可湿性粉剂(EC50=122.5649μg/mL)等5种常用杀菌剂、80%代森锰锌可湿性粉剂(EC50=400.9587μg/mL)、70%甲基托布津可湿性粉剂(EC50=131904.3068μg/mL)。

两种过氧化氢酶活性测定方法的比较

在实验室条件下,通过对金鱼肝脏的CAT活性测定结果进行误差分析来比较碘量滴定法和可见光分光光度法两种方法的优缺点。结果表明:碘量滴定法操作简单,但由于反应时间不易控制、滴定终点判断误差大、中间反应的干扰因素较多,使得用该方法测得的数据标准差较大,精确度较差;可见光分光光度法克服了碘量法的缺点,测得结果的标准差较小,灵敏度较好,精确度较高,但该方法操作较复杂,提取的酶液浓度、显色反应的产物等也可能干扰结果。

SUMO蛋白酶活性片段的表达、纯化及活性测定

利用PCR技术人工合成编码酿酒酵母泛素样特异性蛋白酶1(Ubiquitin-like specific protease 1,Ulp1)第403到621个氨基酸残基之间的DNA片段Ulp1p,并连接到大肠杆菌表达载体pET-3c中,构建出重组表达质粒pET-Ulp1p。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,氨苄青霉素抗性筛选转化子。经IPTG诱导4h后,SDS-PAGE结果显示,Ulp1p为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的50.8%。通过Ni-NTA凝胶亲和层析和G-25凝胶层析联用可以获得纯度大于95%的Ulp1p。Western blotting分析表明,Ulp1p能与6xHis抗体产生免疫反应。以重组蛋白SUMO-hEGF(人表皮生长因子)和GST-SUMO-MT(金属硫蛋白)为底物进行酶切分析,结果显示,Ulp1p能特异性水解这两种SUMO融合蛋白,其比活为1.386×104U/mg。

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)cDNA的克隆、表达和活性测定

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (TRAIL)能选择性诱导肿瘤细胞凋亡 .为利用基因工程技术获得重组TRAIL蛋白可溶性片段 (sTRAIL) ,设计 1对引物 .利用PCR技术特异性扩增出sTRAIL的cDNA ,克隆于质粒pGEM 3Zf( )的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .经测序证明序列正确后克隆于表达质粒pBV2 2 0的EcoRⅠ和PstⅠ位点 ,转化大肠杆菌DH5α .转化菌株经温度诱导 ,SDS PAGE检测和Western印迹鉴定 ,获得重组sTRAIL的高水平非融合表达菌株 .表达量占菌体总蛋白的 2 0 % .对其表达产物进行了初步纯化 ,SDS PAGE结果显示纯度可达 90 %以上 .用L92 9细胞测定其生物学活性表明 。

普通酸奶制品在贮存过程中发酵剂菌的β-半乳糖苷酶活性测定及变化规律研究

采用菌体细胞蛋白重来测定β-半乳糖苷酶活性是比较精确的方法。β-半乳糖苷酶为胞内酶,通过对溶菌酶、超声波、丙酮干粉三种破壁方法比较,确定用超声波破壁法对乳酸菌细胞破壁。发酵剂菌体的β-半乳糖苷酶活性随酸奶样品贮存时间的延长而下降,由最初的0.9707下降到0.468(第15d)。确定β-半乳糖苷酶为导致酸奶制品发生后酸化的关键酶。

紫茎泽兰乙醇提取物对美国白蛾幼虫的生物活性测定

为寻求新的美国白蛾生物防治方法,本试验采用不同浓度紫茎泽兰乙醇提取物处理4龄美国白蛾幼虫,采用微量点滴法和夹毒叶片法分别测定提取物对4龄美国白蛾幼虫的致死率,研究紫茎泽兰提取物对美国白蛾幼虫的生物活性。结果表明:各级浓度提取物乙醇溶液对美国白蛾各龄级幼虫均有不同程度的杀灭效果,5.0、2.0、1.0、0.5和0.25 g/L紫茎泽兰乙醇提取物溶液处理的4龄美国白蛾幼虫24 h后,校正死亡率为64.85%、63.15%、53.77%、34.56%和3.89%。

木聚糖酶酶活性测定方法及酶活性单位定义

为统一木聚糖酶酶活性的单位定义及测定方法进行了实验。通过对现有酶活性的单位定义及测定方法的比较分析,得出木聚糖酶的酶活性单位定义为:在特定条件下,每分钟水解木聚糖形成1μmol木糖(还原糖)所需酶量为1个酶活力单位(U),并且采用还原糖法中的DNS法作为测定木聚糖酶酶活性的方法,该法具有合理性和科学性,建议以此作为木聚糖酶酶活性测定及酶活性单位定义的统一方法。

几种海产双壳贝类血淋巴中抗菌物质的诱导及其活性测定

以贻贝 (Mytilusedulis)、毛蚶 (Scapharcasubcrenata)、海湾扇贝 (Argopectenirrdians)和菲律宾蛤仔 (Ruditapesphilippinesis)为试验材料 ,分别用活的和灭活的大肠杆菌为诱导物进行诱导 ,采用3种革兰氏阳性细菌和3种革兰氏阴性细菌作为指示菌 ,对4种供试双壳贝类血淋巴进行抗菌活性测定。结果表明:(1)贻贝在诱导前其血淋巴对金黄色葡萄球菌和四联微球菌有抑菌活性 ,免疫诱导可使血淋巴对鳗弧菌出现抑菌作用 ;(2)毛蚶在诱导前其血淋巴中含有对金黄色葡萄球菌和鳗弧菌有抑菌活性的物质 ,诱导对这两种菌的抑菌活性有明显的提高 ,但未诱导出对另外4种供试细菌有活性的物质 ;(3)海湾扇贝在诱导前其血淋巴对所有供试细菌均无抑菌活性 ,但经诱导后产生对金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和鳗弧菌有抑菌活性的物质 ,且活菌诱导比灭活菌诱导效果好 ;(4)菲律宾蛤仔在诱导前其血淋巴仅对金黄色葡萄球菌和鳗弧菌表现出抑菌活性 ,经诱导后其血淋巴不仅对这两种菌的抑菌活性增强 ,而且还诱导出对副溶血弧菌有抑菌活性的物质。