基于纳米孔靶向全基因测序技术的新冠肺炎病例快速鉴定研究

目的探索快速识别新型冠状病毒的方法,为新冠肺炎防控提供技术支撑。方法分别运用基于三代纳米孔测序技术平台MinION Mk1C和基于二代测序技术平台Ion Torrent S5的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)靶向全基因组测序技术对1例境外输入新冠肺炎确诊病例进行基因组测序。使用artic-ncov2019软件、CLC Genomics Workbench(Version 21.0)软件和DNAstar软件等进行数据处理和分析。结果基于三代纳米孔测序技术平台MinION Mk1C和基于二代测序技术平台Ion Torrent S5分别在7 h和30 h左右获得SARS-CoV-2全基因组数据,分别为29848bp和29801bp,两者共同29801bp数据部分同源性100%,经分析为新冠病毒B.1.1.7变异株。结论在对该病例样本的全基因测序中,基于三代纳米孔测序技术平台MinION Mk1C的SARS-CoV-2靶向全基因组测序技术将检测周期缩短至7 h左右,能够实现快速、准确地对SARS-CoV-2进行实时测序。

基因测序技术的研发现状及其在医药领域的应用

自第1代测序技术发现以来,基因测序技术发生了快速更迭,经历了高通量测序技术、单分子实时测序技术、纳米孔测序技术的发展变革,并不断推动着医药领域的发展。本文将系统综述基因测序技术的发展历程,总结各类技术特点、优势、劣势及代表性企业,介绍各类技术在医药领域应用场景,为基因测序技术未来发展提供重要参考。

高通量测序技术在低频突变检测中的应用

体细胞突变的累积与衰老、肿瘤及多种疾病的发生密切相关。在正常组织细胞中,基因组中自发突变和诱发突变的变异等位基因频率极低,对这类低频突变的检测一直面临挑战。第二代和第三代高通量测序(next-generation sequencing,NGS)技术的出现,可以实现任意物种全基因组上变异的直接检测,克服传统突变检测技术的诸多局限性。但是常规NGS由于测序错误率较高从而限制了其在低频突变检测上的应用,基于分子一致性测序策略进行错误矫正的高准确性NGS测序技术作为有效的低频突变检测工具,有望在环境诱变剂的评价与研究、细胞与基因治疗药物风险评估、人群健康风险监测和生命科学基础研究领域发挥重要作用。本文对比经典突变检测方法,对基于NGS的低频突变检测技术研究进展进行综述,并对应用前景进行展望,以期为该技术的进一步开发、研究和在相关领域的应用提供参考。

基于第三代基因测序对地中海贫血基因检测的研究进展

地中海贫血是世界上分布最广泛的单基因常染色体隐性遗传病,其临床表现从无症状到需要持续输血来维系生命的严重贫血,这对社会及家庭造成了严重的经济负担,因此,在产前进行相应的筛查与诊断很有必要。常规的检测方法大多只能检测出常见的地中海贫血基因型,对于罕见的基因变异容易造成误诊或漏诊,这对于临床遗传咨询造成一定困难。第三代基因测序(Third-generation sequencing,TGS)目前已应用于地中海贫血基因的检测,相较于常规检测方法,其更加准确、可靠,更具有优越性。本文就第三代基因测序技术在地中海贫血基因检测方面的最新研究进展作一综述。

利用转录组测序挖掘奶牛基因多态位点的准确性研究

转录组测序(RNA-Seq)不仅用于揭示基因表达谱,同时还可以检测基因多态位点,是挖掘奶牛蛋白编码基因功能突变的有效策略。本研究对20头中国荷斯坦牛进行全基因组测序(DNA-Seq)与转录组测序(RNA-Seq),以DNA-Seq检出的单核苷酸多态位点(SNP)为参考基准,评估RNA-Seq检出SNP的准确性及其影响因素。结果显示,同一个体DNA-Seq和RNA-Seq的SNP位点一致性为0.65~0.75,而不同个体间的一致性仅为0.28~0.42。通过优化RNA-Seq检测SNP的筛选标准,包括针对连续SNP(SnpCluster)、单一连续碱基(Homopolymer)、测序深度(DP<5)、位点基因型频率(P<0.13)等4个过滤参数的优化,检出的高准确性SNP占比由71.07%提升至95.27%。最后,经功能注释筛选出10号染色体上E1BHN1基因一个起始密码子突变(BTA10:25435325 T/A),该突变导致免疫球蛋白结构域类似物蛋白从异四聚体变成异二聚体,推测该位点可能为奶牛隐性致死突变位点。

全外显子测序联合基因组拷贝数变异测序在儿科遗传病诊断中的应用

目的探讨全外显子测序(whole exome sequencing,WES)联合基因组拷贝数变异测序(copy number variation sequencing,CNVseq)在儿科遗传病诊断中的应用价值。方法选取2019年8月至2023年7月郑州市妇幼保健院新生儿科及儿科收治的怀疑患有遗传性疾病或临床诊断不明确的患儿为研究对象,采集患儿及其父母外周血进行WES及CNVseq检测,对检出的变异进行分类及评级,并进行一代测序或qPCR验证。结果共纳入患儿33例,其中男性18例,女性15例,年龄范围为1 d~8岁。WES的阳性检出率为36.4%(12/33),CNVseq阳性检出率为9.1%(3/33),两者联合阳性检出率为45.5%(15/33)。结论WES联合CNVseq是儿童遗传性疾病分子诊断的有力工具,可作为一线检测手段在临床大力推广。

高通量测序技术在生殖医学领域的研究与应用

高通量测序技术的发明是基因组学领域一项具有里程碑意义的事件。经过20多年的发展与更迭,高通量测序技术在遗传学检测、肿瘤检测、病原体鉴定、疾病诊断等领域为精准医疗提供了一个高效的检测工具,成为推动现代医学发展的重要力量。在生殖医学领域,在高通量测序技术基础之上发展出的适用于各种生殖医学应用场景的新技术,为更进一步揭示人类生殖自然规律、生殖疾病致病机制以及临床诊断和治疗提供新策略。

纳米孔测序技术在感染性疾病病原微生物鉴定中的研究进展

感染性疾病是严重威胁人类健康的重大疾病之一。当前,全球感染性疾病的发病率有所上升,而病原微生物呈现多样化、复杂化。随着近年来快速发展的全基因组测序技术,可直接对病原微生物进行鉴定,比传统的病原微生物的鉴定有微生物鉴定中具有独特的优势。因此,本文概述了纳米孔测序技术在病毒、细菌病原鉴定、抗药性基因分析以及宏基因组中的应用。

单细胞转录组测序技术在脊髓损伤研究中的应用

背景:近年来,单细胞转录组测序技术在脊髓损伤的研究为创伤后中枢神经系统的细胞和分子异质性以及结构变化提供了新的见解。目的:就单细胞转录组测序技术在脊髓损伤的研究进展进行综述,更加全面、深入地阐述单细胞转录组测序技术在脊髓损伤领域的应用。方法:应用计算机系统检索PubMed、Web of Science、中国知网和万方数据库中2009-2023年出版的文献,英文检索词为“single-cell RNA sequencing,spinal cord injury,sequencing technology”;中文检索词为“单细胞转录组测序,脊髓损伤,测序技术”。排除质量较差、内容重复及不相关的文献,最终纳入57篇文献进行综述分析。结果与结论:目前,单细胞转录组测序技术在脊髓损伤的研究可归纳为以下几点:①鉴定了小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、巨噬细胞、B细胞、神经元和神经干细胞等细胞亚群,并识别了这几种亚群的特异性标记基因。②小胶质细胞在脊髓损伤后保持永久活跃,通过增殖、免疫和稳态功能来协调脊髓损伤后的早期阶段。星形胶质细胞以激活的方式在脊髓损伤中发挥许多重要功能,包括维持微环境平衡、清除坏死组织、形成保护屏障以及胶质瘢痕等。巨噬细胞和小胶质细胞均在脊髓损伤后的慢性神经炎症中起重要作用。③神经干细胞和神经元亚群能够在脊髓损伤后进行自我更新,新发现的SCV^(sx2::Hoxa7:Zfhx3→lumbar)和SCV^(sx2::Hoxa10)等神经元亚群可再生到自然靶区,有利于运动功能的恢复。④发现细胞亚群的动态变化提高了研究者们对脊髓损伤病变进程的理解,并为脊髓损伤在不同时间点的治疗提供了新见解。截至目前,这些研究结果均还需要更多的基础研究和足够的临床试验来验证。在未来,单细胞转录组测序技术通过与生物信息学、计算机科学、组织工程学和临床医学等跨学科合作,有望为脊髓损伤的诊疗打开新的一扇窗户。

基于高通量测序技术分析不同窖龄窖泥真菌群落多样性与空间异质性

利用Illumina NovaSeq高通量测序、冗余分析和FUNGuild等方法对甘肃金徽酒10a和50a窖龄窖池及其不同空间位置窖泥的真菌群落结构、真菌菌群与理化因子之间的关系以及真菌功能预测等进行研究。结果表明,随着窖池深度的增加,10 a窖池窖泥的多样性和丰富度呈现降低趋势,50 a窖池窖泥的多样性整体呈现升高趋势,而丰富度则呈现先降低后升高趋势,其中10a窖池窖壁上层的多样性和丰富度均显著高于其他位置(P<0.05),而50a窖池窖底层的多样性和丰富度均显著高于其他位置(P<0.05)。10a窖池窖壁层的多样性和丰富度显著高于50a窖池(P<0.05),而50a窖底层的多样性和丰富度明显高于10a窖池(P<0.05)。所有窖泥样品共检测到21个真菌门和520个真菌属,其中子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)和罗兹菌门(Rozellomycota)4个优势真菌门以及曲霉属(Aspergillus)和哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)等多数优势真菌属的相对丰度随窖池窖龄和空间位置的变化差异显著(P<0.05)。镰刀霉属(Fusarium)、Aspergillus、Kazachstania和红曲霉属(Monascus)与水分、腐殖质、K^(+)和Ca^(2+)含量呈正相关,枝孢菌属(Cladosporium)、维希尼克氏酵母属(Vishniacozyma)与pH值呈正相关。窖泥真菌营养类型主要有腐生营养型和病理-腐生-共生营养型等7种,功能类群包括4个单一功能群和7个混合功能群。通过系统分析不同窖龄窖池和空间位置的窖泥真菌群落多样性,为明确甘肃金徽酒窖泥的真菌群落结构及空间分布规律奠定了理论基础。

单细胞转录组测序技术及其在免疫学研究中的应用

免疫系统具有复杂性、多变性以及可塑性,目前其组成和动态变化的研究只局限在群体效应,无法体现其异质性。单细胞技术的出现革新了研究者们对免疫学问题的认识。单细胞RNA测序技术是目前应用最广泛的单细胞技术,它能够在单细胞和单分子的水平进行免疫学分析,揭示生理或病理条件下的免疫反应过程。本文对单细胞RNA测序技术的一般流程、发展及其在免疫学方面的应用进展进行综述,并展望其在免疫学方面的发展前景。

基于GBS测序的湘东黑山羊的亲缘关系及近交系数

利用基因分型测序(GBS)对60只湘东黑山羊(9只公羊、51只母羊)进行基因组测序,获得湘东黑山羊染色体上的SNP数据和连续纯合子片段(ROH)数据。通过SNP数据进行基于G矩阵的基因组亲缘关系分析和NJ聚类分析,构建湘东黑山羊的群体家系结构,并通过ROH数据得到群体平均近交系数。结果表明,60只湘东黑山羊的平均测序深度为9.15X,与参考基因组比对率平均为99.59%;在SNP检测过程中,3只母羊不符合基因型数据质控标准,将其过滤后获得其他57只黑山羊29条染色体上153046个SNPs位点和1937个ROH片段;构建的湘东黑山羊8个家系,其中9只公羊和6只母羊被分为7个家系,另42只母羊被单独分类;基于ROH片段分析的湘东黑山羊群体中每个个体的近交系数均值为0.047,说明湘东黑山羊公羊在繁育过程中有较大的利用空间。

宏基因二代测序技术对胸内淋巴结结核的诊断价值

目的:探讨宏基因二代测序技术(metagenomic next-generation sequencing,m NGS)在胸内淋巴结结核中的诊断价值。方法:采用回顾性研究方法,搜集2020年12月至2023年9月浙江省中西医结合医院结核病诊疗中心收治的122例疑似胸内淋巴结结核患者临床资料,所有患者均行支气管内超声引导下经支气管针吸活检术(endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration,EBUS-TBNA)。穿刺标本同时进行mNGS、Gene Xpert MTB/RIF(简称“Xpert”)、PCR-荧光探针法(简称“RT-PCR”)、RNA恒温扩增荧光实时检测技术(简称“TB-SAT”)、BACTEC MGIT 960分枝杆菌全自动快速液体培养(简称“MGIT 960”)和涂片抗酸染色(简称“涂片”),比较6种方法对胸内淋巴结结核的诊断效能。结果:根据诊断标准,122例疑似患者中,最终89例诊断为胸内淋巴结结核,33例为非胸内淋巴结结核患者。以综合诊断结果为参照标准,m NGS对胸内淋巴结结核诊断的敏感度为89.9%(95%CI:81.7%~95.3%)、特异度为87.9%(95%CI:71.8%~96.6%)、准确率为89.3%(95%CI:82.5%~94.2%),AUC值为0.889(95%CI:0.819~0.939),明显高于Xpert、RT-PCR、TB-SAT、MGIT 960和涂片对胸内淋巴结结核检测的敏感度(68.5%、61.8%、33.7%、49.4%和11.2%)、特异度(93.9%、97.0%、97.0%、100.0%和100.0%)、准确率(75.4%、71.3%、50.8%、63.1%和35.2%)和AUC(0.812、0.794、0.747、0.653和0.556)。结论:m NGS检测对胸内淋巴结结核具有较高的临床诊断价值,尤其在其他结核病相关检测均阴性时,该技术可给临床诊断提供重要参考,但与传统的病原学检测手段相比较,特异度仍偏低,尤其在鉴别疾病良恶性时,需结合病理结果进行综合分析。

单细胞转录组测序技术与椎间盘退变的发病机制

背景:椎间盘退变在临床上被认为是引起下腰痛的主要病因,但由于椎间盘退变发病机制尚不明确,目前仍缺乏有效手段来延缓疾病进展。单细胞转录组测序技术可以在单个细胞水平对mRNA进行扩增和测序,揭示单个细胞的基因表达强度,根据细胞的异质性发现组织中的不同细胞亚群,在分子水平上研究椎间盘退变的发病机制,为其早期诊断和治疗提供新的理论依据。目的:介绍了单细胞转录组测序技术的基本原理并综述了近年来单细胞转录组测序技术在椎间盘退变发病机制中的研究进展。方法:应用计算机系统检索PubMed、Web of Science、中国知网和万方数据库中2012-2022年出版的文献,英文检索词为:“single-cell RNA sequencing,intervertebral disc degeneration,sequencing technology”;中文检索词为“单细胞转录组测序,椎间盘退变,测序技术”。排除重复、质量较差及不相关的文献,最终纳入70篇文献进行综述分析。结果与结论:①鉴定了稳态软骨样细胞、肥大软骨样髓核细胞、纤维髓核细胞等新型细胞亚群,识别了这几种细胞亚群的标记基因、转录因子,并阐述了这几种细胞亚群在椎间盘退变发生发展过程中的功能及分化轨迹和细胞命运,同时提出了祖细胞概念,确定了具备祖细胞特性的细胞亚群,在小鼠体内验证了该细胞亚群治疗椎间盘退变的有效性。②识别了兼具软骨特性和纤维特性的纤维软骨样纤维环细胞和纤维环干细胞,并在体外结合纤维软骨诱导剂和丝素蛋白及透明质酸制备了一种新型复合水凝胶,通过小鼠体内实验验证了这种水凝胶既能修复纤维环组织也能恢复软骨基质,对于椎间盘退变有显著治疗效果。③在终板软骨组织中发现了调节性软骨细胞,其在椎间盘退变进展中出现2种截然不同的命运并明确了2种命运中的差异基因,细胞间通讯分析表示调节性软骨细胞与内皮细胞之间互相作用从而促进血管生成。④在退变椎间盘组织中鉴定出巨噬细胞、T细胞、髓系祖细胞和嗜中性粒细胞等免疫细胞,证明了椎间盘退变过程中存在免疫反应,并发现载脂蛋白诱导了巨噬细胞M1和M2亚型的极化,这种极化过程通过MIF信号通路放大炎症反应来影响髓核祖细胞的活性。

基于宏基因组测序和纯培养技术解析胀袋生抽酱油的微生物类群

该研究采用宏基因组测序技术对胀袋生抽酱油微生物类群进行了解析,对其微生物菌株进行了分离鉴定,并对分离株是否可导致酱油胀气进行了验证。宏基因组结果表明,胀袋生抽酱油样品中平均相对含量大于1.0%的微生物主要由嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)、酸鱼联合乳杆菌(Ligilactobacillus acidipiscis)、植物乳植物杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)、棒状腐败乳杆菌(Loigolactobacillus coryniformis)、短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)构成,平均相对含量分别为28.01%、25.50%、9.45%、2.49%、1.83%、1.53%和1.33%;采用纯培养技术,分离出的49株细菌被鉴定为6个属下的11个种,其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、破布子联合乳杆菌(Ligilactobacillus pobuzihii)、蛋白原酶腐败乳杆菌(Loigolactobacillus rennini)和L.acidipiscis分离株占总分离株数的39.22%、19.61%、11.76%和9.80%,分离出的2株酵母菌均被鉴定为扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera);产气验证实验发现,所有分离株均不能单独引起生抽酱油的胀袋现象。由此可见,胀袋生抽酱油具有较高的微生物多样性,在后续研究引入培养组学策略以获得更多的分离株,亦或考虑多菌株的协同作用,对酱油涨袋这一产业问题的解决可能具有积极的意义。

纳米孔测序在病原微生物检测中的应用专家共识

目的提高危重症感染性疾病的诊断及救治水平,规范纳米孔测序的临床应用,促进该技术的良性发展。方法由中国药理学会治疗药物监测研究专业基层委员会和广东省药学会临床治疗精准用药专家委员会发起并组织多学科专家,采用名义群体法讨论确定共识编写大纲,形成共识初稿;采用德尔菲法进行专家咨询,对专家意见进行分析和修订,形成共识。结果与结论最终制定的《纳米孔测序在病原微生物检测中的应用专家共识》涵盖了靶向测序、宏基因组测序和全基因组测序等方向,对纳米孔测序的样本采集与保存、检测过程、生物信息学分析、报告解读等全流程进行了规范,并对其中的关键问题给出了推荐意见。

基于高通量测序的昭通核心烟区植烟土壤真菌多样性分析

本研究利用高通量测序技术,从分子水平探究昭通8个种烟县(区)新烟区、土传病害发病严重的连作区以及典型的轮作区的土壤真菌多样性。结果表明:从群落组成来看,昭通核心烟区土壤真菌群落包括30个门、79个纲、202个目、443个科和976个属,其中子囊菌门为昭通核心烟区土壤真菌群落的绝对优势门,被孢霉属和青霉菌属为昭通核心烟区土壤真菌群落的优势属。群落指示物种分析表明,新烟区土壤真菌群落壳二胞菌属的相对丰度显著高于连作区和轮作区,连作区拟青霉菌属、假裸囊菌属和篮状菌属的相对丰度显著高于新烟区和轮作区烟,轮作区镶刀菌属的相对丰度显著高于新烟区、被孢霉属的相对丰度显著高于连作区。从生物多样性特征来看,新烟区土壤真菌群落的生物多样性最高,物种丰富度显著高于连作区和轮作区;轮作区土壤真菌群落的物种丰富度显著高于连作区,物种均匀度显著低于连作区,真菌群落生物多样性略高于连作区。从真菌群落的功能来看,病理营养型、腐生营养型和腐生—共生营养型的真菌群落为主要组成,新烟区真菌群落占比前1至前3的营养型分别为腐生—共生营养型、腐生营养型和病理营养型,连作区分别为腐生营养型、病理营养型和腐生—共生营养型,轮作区分别为腐生—共生营养型、病理—腐生—共生营养型和腐生营养型。昭通植烟土壤真菌群落组成丰富,新烟区土壤真菌群落的生物多样性最高,物种丰富度显著高于连作区和轮作区,不同类型土壤的真菌群落结构组成差异不显著,轮作有利于降低病理营养型的真菌群落,能减少真菌性病害发生的几率。

肝癌细胞株-乙型肝炎病毒DNA整合事件的高通量靶向捕获测序分析

目的 采用探针捕获和高通量测序技术研究HepG2.2.15与HepAD38 2个乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)肝癌细胞系中病毒DNA在宿主基因组中的整合位点特征。方法 提取HepG2.2.15与HepAD38细胞基因组DNA,采用探针捕获和高通量测序策略对2个肝癌细胞株中整合的HBV DNA进行捕获测序,使用Trimmomatic、BBAP、BWA(Burrows-Wheeler Aligner)等生物信息学软件进行数据分析;最后通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)及克隆测序对病毒DNA整合特征进行验证。结果 利用探针捕获和高通量测序技术分别在HepG2.2.15与HepAD38细胞系中检测出12、7个HBV DNA整合事件,随机分布在chr1、chr2、chr7、chr9、chr16、chr17、chr19、chrX染色体上,整合位点上下游基因出现频率较高的有DPP7、TRIM56、GPC3等。结论 成功建立基于探针捕获和高通量测序技术检测HBV DNA在宿主基因组上的整合片段的方法,HepG2.2.15与HepAD38细胞系中HBV整合事件在染色体上随机发生,大部分整合位点发生在HBV基因组上的X基因区域。

基于高通量测序技术分析蒙古族传统奶酪微生物菌群多样性

以内蒙古牧区蒙古族传统木桶自然发酵生产奶酪为研究对象,采用Illumina Mi Seq高通量测序技术分析发酵凝乳及不同成熟阶段奶酪样品的微生物菌群多样性。结果表明,发酵凝乳中细菌菌群多样性最高,奶酪成熟10 d时细菌菌群丰富度及真菌菌群多样性最高,成熟30 d时真菌菌群丰富度最高。发酵凝乳及奶酪成熟过程中优势细菌属(平均相对丰度>1%)为乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、拉乌尔菌属(Raoultella)、葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)、链球菌属(Streptococcus);优势真菌属为地霉属(Geotrichum)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、未分类双足囊菌科(unclassified_f_Dipodascaceae)、毕赤酵母属(Pichia)、孢圆酵母属(Torulaspora)、德克酵母属(Dekkera)。主坐标分析(PCoA)结果表明,发酵凝乳和奶酪成熟0 d时细菌群落结构差异较大,真菌群落结构较为相似;奶酪成熟10 d、20 d和30 d时细菌群落结构较为相似,真菌群落结构差异较大。综上,奶酪成熟过程中微生物丰富,且成熟过程对微生物群落结构具有明显影响。

纳米孔测序技术及其在病原学诊断中的应用进展

在病原学诊断中,基因测序扮演着重要的角色,测序技术也在不断地更新发展,其中牛津纳米孔科技(Oxford Nanopore Technologies,ONT)公司所推出的纳米孔测序技术近年来发展迅速,并凭借其超长读长、快速实时测序、简单便携以及能够读取蛋白质序列等诸多优势在医学领域获得了广泛的关注和应用。本文将主要介绍纳米孔测序技术的原理、特点以及在病原学诊断中的应用,并对该技术的未来发展进行展望。