将荧光定量PCR技术与等位基因特异性扩增(Allele specific amplification,ASA)方法相结合,发展了一种可以快速检测基因点突变的实时荧光等位基因特异性扩增(Real-time ASA)方法.将该法用于检测K-ras癌基因第12位密码子发生的点突变,分...将荧光定量PCR技术与等位基因特异性扩增(Allele specific amplification,ASA)方法相结合,发展了一种可以快速检测基因点突变的实时荧光等位基因特异性扩增(Real-time ASA)方法.将该法用于检测K-ras癌基因第12位密码子发生的点突变,分别采用针对其不同点突变方式(GAT,GTT,CGT)设计的突变型引物对待测样品进行ASA,只有突变型样品能被顺利扩增出双链DNA产物,该产物才能与双链DNA染料SYBR GreenⅠ结合,发出荧光信号从而被检测到.用该法检测31例结肠癌组织中的K-ras癌基因点突变,其中有15例样品检出为突变型.Real-time ASA法可检测到样品中含量为1/1000的突变型基因,具有灵敏、快速、简便、安全、高通量和低成本等优点,可望用于大量临床样本的点突变筛查.展开更多
目的:通过DNA条形码鉴定和建立特异性引物扩增的方法,有效区分菲牛蛭与其他水蛭品种。方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对水蛭样品的COI序列进行扩增,利用MEGA 6.06软件通过建树法进行NJ树聚类分析,针对菲牛蛭素的编码基因序列、利用Primer...目的:通过DNA条形码鉴定和建立特异性引物扩增的方法,有效区分菲牛蛭与其他水蛭品种。方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对水蛭样品的COI序列进行扩增,利用MEGA 6.06软件通过建树法进行NJ树聚类分析,针对菲牛蛭素的编码基因序列、利用Primer Premier 5软件进行引物设计,对经设计、合成的8对引物通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验进行筛选,并确定特异性引物的最佳退火温度。结果:通过COI序列的NJ树聚类分析可以确定20批水蛭样品中的9批菲牛蛭样品,经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出8对引物进行合成,通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳预实验筛选出引物7、为最佳实验引物,且确定了引物7的最佳退火温度为49℃。结论:通过COI序列的DNA条形码研究,确定了样品中的菲牛蛭,通过特异性引物PCR扩增和电泳检测,有效地将菲牛蛭与其他水蛭样品进行区分,为菲牛蛭的分子生物学鉴定方法提供了参考。展开更多
针对传统电泳检测方法存在操作复杂、费时等缺点,提出一种用于检测K-ras癌基因点突变的实时荧光等位基因特异性扩增(Allele specific amplification,ASA)方法。该法采用突变型引物对结肠癌基因组中的K-ras基因进行等位基因特异性扩增,...针对传统电泳检测方法存在操作复杂、费时等缺点,提出一种用于检测K-ras癌基因点突变的实时荧光等位基因特异性扩增(Allele specific amplification,ASA)方法。该法采用突变型引物对结肠癌基因组中的K-ras基因进行等位基因特异性扩增,只有突变型样品能被顺利扩增出双链DNA产物,该产物能与双链DNA染料SYBR GreenⅠ结合,产生荧光信号从而被检测到。通过对荧光域值和溶解曲线分析来区分不同的基因突变类型。该法可以检测到野生型DNA中含量为1/1 000的突变型DNA,整个检测时间小于1 h。我们用该法检测31例结肠癌样品中K-ras基因密码子12发生的点突变,其中有15例检出为阳性。此外,还采用等位基因特异性扩增结合电泳分析对样品进行了检测,并对两种方法进行了比较。结果显示:实时荧光等位基因特异性扩增方法具有操作简便、快速、检测成本低等优点,为临床诊断基因突变引起的疾病提供了一种可行的手段。展开更多
文摘目的:通过DNA条形码鉴定和建立特异性引物扩增的方法,有效区分菲牛蛭与其他水蛭品种。方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对水蛭样品的COI序列进行扩增,利用MEGA 6.06软件通过建树法进行NJ树聚类分析,针对菲牛蛭素的编码基因序列、利用Primer Premier 5软件进行引物设计,对经设计、合成的8对引物通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验进行筛选,并确定特异性引物的最佳退火温度。结果:通过COI序列的NJ树聚类分析可以确定20批水蛭样品中的9批菲牛蛭样品,经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出8对引物进行合成,通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳预实验筛选出引物7、为最佳实验引物,且确定了引物7的最佳退火温度为49℃。结论:通过COI序列的DNA条形码研究,确定了样品中的菲牛蛭,通过特异性引物PCR扩增和电泳检测,有效地将菲牛蛭与其他水蛭样品进行区分,为菲牛蛭的分子生物学鉴定方法提供了参考。
基金supported by the National Natural Science Foundation of China(81071790,30600128,81102159)The Key Project of Chinese Ministry of Education(211131)+2 种基金The Natural Science Foundation of Guangdong Province(7005825,S2011040003622)The Science and Technology Project of Guangzhou Nansha District(RG201001003)The Foundation for Distinguished Young Talents in Higher Education of Guangdong(2009)
文摘针对传统电泳检测方法存在操作复杂、费时等缺点,提出一种用于检测K-ras癌基因点突变的实时荧光等位基因特异性扩增(Allele specific amplification,ASA)方法。该法采用突变型引物对结肠癌基因组中的K-ras基因进行等位基因特异性扩增,只有突变型样品能被顺利扩增出双链DNA产物,该产物能与双链DNA染料SYBR GreenⅠ结合,产生荧光信号从而被检测到。通过对荧光域值和溶解曲线分析来区分不同的基因突变类型。该法可以检测到野生型DNA中含量为1/1 000的突变型DNA,整个检测时间小于1 h。我们用该法检测31例结肠癌样品中K-ras基因密码子12发生的点突变,其中有15例检出为阳性。此外,还采用等位基因特异性扩增结合电泳分析对样品进行了检测,并对两种方法进行了比较。结果显示:实时荧光等位基因特异性扩增方法具有操作简便、快速、检测成本低等优点,为临床诊断基因突变引起的疾病提供了一种可行的手段。
