高效液相体积排阻色谱法定量检测重组猪伪狂犬病毒gD蛋白

本试验旨在建立高效液相体积排阻色谱(HPSEC)法进行重组猪伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD的定量质控并评价其应用,进一步扩展该方法在兽用疫苗领域的应用范围。制备并鉴定gD蛋白标准品,检测其在保存过程中的稳定性;采用HPSEC法定量检测gD蛋白并鉴定其色谱峰;建立HPSEC法检测gD蛋白标准品的标准曲线,并进行线性、检测限、准确度和精密度验证;考察HPSEC法定量检测细胞培养料液样品、纯化样品和乳化样品中gD蛋白浓度的适用性;对比HPSEC法和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法定量gD蛋白结果的相关性。结果显示,制备的gD蛋白标准品纯度>98%,可稳定存放12个月,浓度偏差为0.01%~2.80%。HPSEC法具有良好的线性(R^(2)=0.9999,n=8);检测限在5.0μg/mL以下;准确度较高,5个浓度的gD蛋白标准品检测准确度为93.2%~104.6%(n=6);精密度良好,5个浓度的gD蛋白标准品6次重复检测的相对标准偏差(RSD)为0.2%~1.6%(n=6);日间精密度良好,3批次细胞培养料液样品3 d各6次重复检测的RSD为1.1%~2.0%(n=6);可应用于细胞培养过程中gD蛋白在细胞培养料液样品中表达量的监测,纯化样品和乳化样品中gD蛋白的检测。分别采用HPSEC法和SDS-PAGE法定量12批细胞培养料液样品中gD蛋白浓度,2种方法结果高度正相关(Rs^(2)=0.9298,n=12),配对t检验无显著性差异(Ps=0.1457)。结果表明,HPSEC法定量检测猪伪狂犬病毒gD蛋白适用性好、重复性好、准确度高,能应用于抗原生产不同阶段样品的质量控制,指导疫苗工艺开发。

假病毒中和试验对狂犬病毒中和抗体效价的检测效能分析

目的:组织不同的实验室分析假病毒中和法(Pseudo Virus-based Neutralization Assay,PBNA)对不同样品的狂犬病病毒中和抗体水平的检测能力,并比较其与经典的快速免疫荧光灶抑制试验(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test,RFFIT)以及小鼠中和试验法(Mouse Neutralization Test,MNT)的相关性。方法:共9家实验室,分别采用PBNA、RFFIT以及MNT法对6份样品进行狂犬病病毒中和抗体检测,每个实验室进行3~5次重复实验。采用配对t检验及Pearson相关系数对3种检测方法的结果进行统计学分析。结果:PBNA与RFFIT、PBNA与MNT、RFFIT与MNT Pearson相关系数分别为0.985、0.988和0.974,抗体几何平均滴度进行t检验,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:3种方法重复检测6份样品的定量结果具有高度的相关性,PBNA法可作为《中华人民共和国药典》方法RFFIT、MNT的一种替代或补充方法,用于人用狂犬病疫苗临床血清、狂犬病人免疫球蛋白及抗狂犬病血清的狂犬病病毒中和抗体效价检测。

辣蓼黄酮通过调控核因子E2相关因子2信号通路及组蛋白乙酰化缓解伪狂犬病毒感染小鼠诱导的脾脏和肺脏氧化应激

本研究通过探索辣蓼黄酮对核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路及组蛋白乙酰化的调控效果,以阐明辣蓼黄酮干预伪狂犬病毒(PRV)感染小鼠诱导氧化应激的分子机制。将60只无特定病原体(SPF)级昆明种小鼠,随机分为6个组(每组10只小鼠),即空白对照组、PRV组、维生素C(VC)组(灌服100 mg/kg BW VC)及辣蓼黄酮高、中、低剂量组(灌服200、100和50 mg/kg BW辣蓼黄酮混悬液),各组灌服量均为0.2 mL。PRV感染小鼠7 d后,通过荧光定量PCR测定小鼠脾脏和肺脏组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、Nrf2、血红素加氧酶-1(HO-1)、依赖还原型辅酶Ⅰ(Ⅱ)醌氧化还原酶1(NQO1)、乙酰转移酶(HAT)和去乙酰转移酶(HDAC)的mRNA表达水平;通过免疫组化和蛋白免疫印迹法(Western Blot)测定iNOS、Nrf2、HO-1、NQO1、乙酰化组蛋白H3(AcH3)和乙酰化组蛋白H4(AcH4)的蛋白表达水平。结果表明:与空白对照组相比,PRV组脾脏组织中iNOS、HAT的mRNA表达水平和AcH3的蛋白表达水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),脾脏组织中HO-1、HDAC的mRNA表达水平极显著降低(P<0.01);PRV组肺脏组织中iNOS、Nrf2、HO-1、NQO1、HAT的mRNA表达水平和iNOS、Nrf2、AcH3的蛋白表达水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),肺脏组织中AcH4的蛋白表达水平极显著降低(P<0.01)。与PRV组相比,辣蓼黄酮高、中、低剂量组脾脏组织中Nrf2、HO-1和HDAC的mRNA表达水平和AcH4的蛋白表达水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),脾脏组织中HAT的mRNA表达水平和AcH3的蛋白表达水平显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01);辣蓼黄酮高、中、低剂量组肺脏组织中iNOS的mRNA表达水平和AcH3的蛋白表达水平显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01),肺脏组织中AcH4的蛋白表达水平极显著升高(P<0.01)。由此可见,辣蓼黄酮对Nrf2信号通路和组蛋白乙酰化修饰具有调控作用,且其通过该调控作用缓解PRV感染小鼠脾脏和肺脏诱导的氧化应激。

猪伪狂犬病毒荧光重组酶介导核酸扩增快速检测方法的建立与应用

【目的】基于荧光重组酶介导核酸扩增(Recombinase-aided amplification,RAA)技术,建立一种猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)快速检测方法。【方法】根据PRV gE基因序列,设计特异性引物及探针,优化扩增体系,建立PRV荧光重组酶介导核酸扩增检测方法,检验其特异性、敏感性和重复性,应用该方法对临床样品进行检测。【结果】该方法在43℃恒温反应23 min即可完成PRV核酸扩增,最低检出限为111 copies·μL^(-1);与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrheavirus,PEDV)、猪轮状病毒(Porcinerotavirus,PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)均无交叉反应。重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于5%;40份临床样品检测结果显示PRV阳性率为15%(6/40),检测结果与常规聚合酶链式反应(PCR)一致。【结论】成功建立了简便快速、高效准确的PRV实时荧光RAA检测方法,为PRV的快速检测和流行病学调查提供了新的检测手段。

狂犬病毒的间谍行动

狂犬病是一种严重的病毒性感染,因其发病快、致死率高而闻名。这种病毒主要通过犬类等动物的咬伤或唾液传播给人类,一旦发病,常常导致死亡。虽然疫苗接种和健康教育的进步已经在一定程度上减少了狂犬病在全球的影响,但这种疾病仍然是一个严峻的公共卫生挑战。人类的免疫系统可比作一个设有层层防线和中枢指挥系统的国家,而狂犬病毒则可视为一个思维缜密、装备精良的间谍。假设有一名成年男性被疯狗小迪咬伤,狂犬病毒借机潜伏。免疫系统将如何与病毒展开智斗,让我们拭目以待。

促伪狂犬病毒gD蛋白可溶性表达标签的筛选及融合蛋白生物学活性的检测

为筛选有助于伪狂犬病病毒(PRV)gD蛋白可溶性表达的标签,并检测其融合蛋白的生物学活性,本研究通过PCR扩增PRV gD基因后,分别连接携带MBP、SUMO、NusA和GST 4个不同促溶标签的原核表达载体,构建重组质粒pET21b-MBP-gD、pET21b-SUMO-gD、pET21b-NusA-gD和pET21b-GST-gD。经双酶切和基因测序鉴定正确后分别转化大肠杆菌BL21(DE3),采用IPTG诱导后经SDS-PAGE检测各重组蛋白的表达,筛选可溶性表达效果最好的标签。结果显示,各重组质粒经酶切鉴定均获得852 bp的目的条带与各自的载体条带,均与预期相符,进一步测序结果显示插入基因序列与密码子优化后的PRV gD基因序列一致。SDS-PAGE检测结果显示,MBP标签融合gD蛋白的可溶性表达量最大,GST标签次之,SUMO标签和NusA标签融合的gD蛋白则均以包涵体形式表达。因此,选用重组MBP-gD蛋白(rMBP-gD)做后续鉴定。将rMBP-gD经Ni-NTA柱纯化后采用western blot和间接ELISA检测其反应原性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测该重组蛋白与PK15细胞的结合;将该重组蛋白与PRV-GFP共孵育PK15细胞后,经流式细胞术检测其竞争结合PK15细胞,从而抑制PRV的感染情况。结果显示,rMBP-gD具有反应原性,且可以结合PK15细胞,rMBP-gD蛋白可竞争结合PK15细胞抑制PRV的感染。上述结果首次证实,可溶性原核表达的rMBP-gD表达效果好,且具有生物学活性,本研究为PRV基因工程亚单位疫苗的后续研究奠定了基础。

伪狂犬病毒免疫逃逸机制研究进展

伪狂犬病毒(PRV)可引发多种动物的伪狂犬病并能感染人类,对畜牧业发展和公共健康构成严重威胁。长期存在的免疫压力促使PRV不断产生变异毒株,给伪狂犬病的防控带来巨大挑战。其中,PRV介导的免疫逃逸是防控困难的重要原因。PRV编码基因在DNA复制、颗粒形成、疾病发展和免疫抑制等方面起关键作用。本文从病毒潜伏感染、先天免疫逃逸和获得性免疫逃逸3个方面,综述PRV劫持或干扰宿主免疫应答反应的研究进展,总结病毒元件与宿主蛋白的相互作用关系,并对PRV介导的内质网应激进行探讨,为进一步揭示PRV致病机制和探索更有效的防治措施提供参考。

猪伪狂犬病毒gB蛋白间接化学发光抗体检测方法的建立

研究旨在建立一种快速检测猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)gB蛋白间接CLIA抗体检测方法,以期为猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)的防控和规模化猪群疫苗免疫水平评估提供技术支持。本研究将羧基磁珠与重组gB蛋白进行偶联反应形成免疫磁珠,利用全自动化学发光仪对各项反应条件进行优化;选用6种不同浓度的标准品绘制标准曲线;通过绘制ROC曲线确定阴阳性判定标准;初步完成方法建立后分别对其特异性、敏感度、重复性、符合率进行评估。结果显示磁珠偶联最佳pH 6.0,蛋白偶联最佳浓度为40μg/mL,10%BSA为最优封闭剂,酶标抗体最佳稀释度为1:20000,血清反应时间为5 min,酶标抗体反应时间为10 min,预激发液反应时间为5 min,最终绘制出一条R2=0.9987的标准曲线,同时将判定标准定为:≥16.78 U为阳性,<16.78 U则为阴性。方法学评估中与7种猪类病原的阳性血清均无交叉反应,敏感度略高于商业化试剂盒,批内批间系数均小于10%,与商业化ELISA试剂盒比对总符合率为98.9%。本研究建立的猪伪狂犬病毒gB蛋白间接化学发光抗体检测方法可用于PR流行病学调查及疫苗免疫水平评估,为后续试剂盒研发提供理论参考。

猪伪狂犬病毒抗体检测方法的研究进展

伪狂犬病,也称阿氏病(Aujeszky'sdisease),是由伪狂犬病毒(PRV)引起的一种高度传染性疾病。在没有特定宿主的情况下,伪狂犬病毒可以侵入多种哺乳动物,包括猪、牛、羊等,从而导致易感动物发生严重的临床症状和急性死亡。我国于20世纪50年代首次报道猪伪狂犬病,且自2011年以来,部分地区出现新的猪伪狂犬病变异株,致使养猪业遭受严重的经济损失。尽管科学家们一直在致力于诊断方法的设计和相关疫苗的开发,但伪狂犬病仍在养猪业广泛存在,近些年发现其对人类的健康也存在着潜在威胁,从而引起了世界范围内的强烈关注。目前我国的猪场普遍实行伪狂犬疫苗免疫,因此检测免疫后疫苗产生的抗体水平至关重要。本文总结目前对PRV的抗体检测方法,针对其优缺点进行对比分析,以对猪场临床上选择抗体检测方法提供参考。

猪伪狂犬病毒及其疫苗的研究进展

猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)作为一种高度传染性病毒,对全球养猪业构成严重威胁。本文深入剖析了PRV病原学特征及流行特点,为理解该病毒的致病机制提供了理论基础;同时,对现有的PRV疫苗进行了分类介绍,对比免疫效果、应用现状以及分析4种疫苗的优缺点,以期为新型疫苗的研发提供参考。

天津地区猪伪狂犬病毒变异株的分离鉴定及主要相关毒力基因分析

为了鉴定猪伪狂犬病病毒(PRV)流行株及其携带毒力基因的变异情况,本研究采集1份天津地区某猪场免疫过Bartha-K61疫苗但患严重神经症状的仔猪脑组织样品,采用荧光定量PCR(q PCR)检测PRV g E基因,并将检测为PRV的阳性样品接种PK-15细胞分离培养,并传3代后采用Reed-Muench法测定分离病毒的TCID_(50),采用q PCR和间接免疫荧光试验(IFA)进一步鉴定分离病毒。结果显示,经q PCR检测仔猪脑组织样品出现扩增曲线,阳性样品分离培养后测得病毒滴度为10^(7.57)TCID_(50)/m L,分离病毒的q PCR结果出现扩增曲线,且其感染的细胞出现绿色荧光。表明分离到一株PRV,命名为TJbd2023株。采用PCR分别扩增TJbd2023株主要相关毒力基因g B、g C、g D、g E、g G、g I和TK,采用Meg Align软件分析分离病毒与Gen Bank登录的PRV参考株上述各毒力相关基因序列的同源性,通过Neighbor-Joining(NJ)法构建上述各毒力相关基因的进化树,采用Meg Align软件分析各毒力基因编码氨基酸主要位点的变异情况。结果显示,分别扩增到TJbd2023株的各相应毒力基因;各毒力基因的同源性分析结果显示,TJbd2023株与国内2012年后流行变异株的相似性高达98.4%~100.0%,与疫苗株(Bartha-K61)的相似性为89.6%~93.2%。进化树结果显示,这7个毒力基因均与国内GD0304株(MH582511)、BJYT株(KC981239)和DL1408株(KU360259)等PRV变异株位于同一分支,与疫苗株(Bartha-K61)未在同一分支。g B、g C、g E氨基酸序列除出现PRV变异株相同的突变位点外,g B还出现R^(223)H和E^(836)K的突变、g D出现R^(320)S和g E出现T^(242)A的突变。将TJbd2023株分别以5个剂量(10^(2.57)TCID_(50)/m L~10^(6.57)TCID_(50)/m L)感染6周龄KM小鼠,通过小鼠的临床症状、死亡率、死亡小鼠各组织的病理变化评估该病毒的致病性。结果显示,在5 d的观察期内,感染组小鼠陆续出现奇痒及神经症状,各实验组小鼠的死亡率分别为60%、80%、100%及100%,对照组小鼠均健活。死亡小鼠各组织病变观察可见肺组织浸润性出血、肝组织血管充血及淋巴细胞增多、脑胶质细胞增多及血管周围炎性细胞聚集形成血管套等病变,对照组小鼠各组织均无明显病变。上述结果表明,本研究在天津地区分离到一株PRV变异株,其毒力因子发生了独特的氨基酸位点突变,对小鼠的致病性较强,该结果丰富了PRV的致病性及其毒力因子变异的特征,为PR的综合防控提供参考。

影响猪伪狂犬病毒疫苗效果的因素

伪狂犬病最早在美国等西方国家暴发,可感染包括猪、牛、绵羊在内的多种哺乳动物,其中对生猪的危害最大,可使不同日龄生猪有高热、神经共济失调、繁育生殖障碍等症状,传播快、致死率高、危害巨大,是全球公认的严重影响生猪产业发展的疫病之一。科学接种疫苗是防控猪伪狂犬病毒病的最有力手段,笔者对影响疫苗免疫效果的因素进行总结概述,以期为生猪伪狂犬疫苗免疫程序的制定提供参考。

狂犬病毒谈之色变,如何掌握护身符

近期,河南3岁男童被恶犬咬伤,18天后狂犬病发作离世,令人痛心;浙江一男子被野狗划伤,伤口并未出血,一个月后狂犬病发作不治身亡……关于狂犬病伤人的桩桩件件都让人不禁惋惜。犬猫家畜等小动物作为人类的好帮手、好朋友,接受人类的驯化已经有成千上万年的历史,随着人类社会进步和经济社会变革,动物和人类的关系正在发生着微妙的变化。

郴州市汝城县猪养殖场中伪狂犬病毒流行病学调查与分析

为了解郴州市汝城县养殖猪场中伪狂犬病毒流行情况,试验于2021—2023年采集郴州市汝城县的规模化养猪场和散养户中不同阶段猪(断奶仔猪、育肥猪、母猪、后备母猪)的血液组织样本共计1593份,采用猪伪狂犬病毒抗原ELISA试剂盒对采集的郴州市汝城县规模化养猪场和散养户中不同阶段猪(断奶仔猪、育肥猪、母猪、后备母猪)的血液组织样本进行伪狂犬病毒抗原检测,分析其流行情况。结果显示,2021—2023年的断奶仔猪、育肥猪、母猪、后备母猪血清中的猪伪狂犬病毒抗检测的总阳性率分别为13.2%、30.9%,13.9%和14.4%,其中断奶仔猪、母猪、后备母猪血清样本中的猪伪狂犬病毒抗原的总阳性率呈现逐年下降的趋势,育肥猪的血清样本中的猪伪狂犬病毒抗原的总阳性率呈现逐年上升的趋势,养猪场和散养户猪场血清中猪伪狂犬病gB抗原阳性率分别为87.5%、71.8%,其中规模猪场血清样本中的猪伪狂犬病gB抗原整体抗体水平较高。综上,以上结果可为养殖场开展猪伪狂犬病净化工作提供参考依据,为猪养殖场猪病流行规律、发展趋势,做好疫病的提前预警。

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其在小鼠的免疫反应

猪伪狂犬病毒(PRV)是一种良好的兽用活病毒疫苗载体。但以PRV基因缺失疫苗株TK ^-/gE ^-/LacZ+为载体表达PRRSV GP5的重组病毒TK ^-/gE ^-/GP5+免疫实验动物后难以激发抗PRRSV的中和抗体。为了进一步增强这种重组病毒的免疫效力,本研究用具有更好免疫原性的修饰的ORF5基因(ORF5m)代替天然ORF5基因,构建了表达PRRSV的修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒TK~ ^-/gE~ ^-/GP5m+。经PCR、SouthernBlot、Western blot证实构建正确,并能表达具有活性的GP5m蛋白。将TK ^-/gE ^-/GP5m+与TK ^-/gE ^-/GP5+分别免疫Balb/c小鼠,结果TK ^-/gE ^-/GP5m+免疫小鼠不仅产生了较高水平的抗PRRSV的中和抗体(3/6只达到了1:16),而且在诱导PRRSV特异性细胞免疫方面也显著优于TK ^-/gE ^-/GP5+,表明TK ^-/gE ^-/GP5m+是一种极有希望的PRRSV和PRV二价基因工程候选疫苗。

应用免疫酶组化技术检测狂犬病毒的方法学探讨

目的:比较常规石蜡切片HE染色和免疫酶组化ABC法检测狂犬病毒的灵敏度。方法:在已感染狂犬病毒的10只小鼠脑组织石蜡切片上,分别用HE染色和免疫酶组化ABC法检测狂犬病毒。结果:HE染色仅在4只小鼠脑组织神经细胞胞浆内找到代表狂犬病毒抗原的内基氏小体,阳性率为40%;免疫酶组化ABC法检测10只小鼠脑组织均见内基氏小体,其阳性率为100%,明显高于HE染色法(P<0.05)。结论:用免疫酶组化ABC法检测狂犬病毒抗原比HE染色法未列举特异的事实敏感,提示用免疫酶组化ABC法检测可提高狂犬病毒诊断率。

狂犬病毒、伪狂犬病毒、马瘟病毒、牛病毒性腹泻/粘膜病病毒和传染性牛鼻气管炎病毒的保存期试验

进行了狂犬病毒 (巴黎株固定毒 )、伪狂犬病毒 (闽 A株 ,苏联株 )、马瘟病毒 (I,II,III,IV,V,VII型 )、牛病毒性腹泻 /粘膜病病毒 (Oregon C2 4 V株 ,NADL株 )和传染性牛鼻气管炎病毒(NU/6 7株 )的保存期试验。试验结果证明 ,在 - 70℃以下温度保存 ,狂犬病毒巴黎株固定毒保存 1 0年以上 ,伪狂犬病毒闽 A株保存 1 1年以上 ,伪狂犬病毒苏联株保存保存 1 7年 ,马瘟病毒 I、II、III、IV、V和 VII型病毒保存 1 2年以上 ,牛病毒性腹泻 /粘膜病病毒 NADL株和 Oregon C2 4 V株保存1 6年以上 ,传染性牛鼻气管炎病毒 NU/6 7株保存 1

抗猪伪狂犬病毒免疫球蛋白(Ig)研制试验与检测结果

本试验用配有佐剂的伪狂犬病毒抗原,按特定基础免疫与强化免疫程序接种关中毛驴,用两次盐析法沉淀提取抗猪伪狂犬病毒Ig,其中对提纯工艺所涉及的PH值,温度,硫酸铵浓度等进行探索比较,继之对单位体积内的蛋白浓度,酶标抗体效价和稀释度进行了标化,同时对质量检测进行了平行性分析,本实验以陕西关中毛驴作为免疫反应供浆动物;研制用于预防和治疗抗猪伪狂犬病免疫球蛋白(Ig)生物制剂获得理想结果犤1-4犦。经8省(区)、市试用后,深受用户和兽医防疫部门的一致好评和欢迎。

重组狂犬病毒在原核细胞中的表达

目的：探讨狂犬病毒Ｎ蛋白的免疫原性。方法：采用生物工程技术、基因重组方法。结果：以狂犬病毒基因文库及ＩＬ２基因文库设计两对引物，基因扩增后分别得到完整狂犬病毒Ｎ蛋白基因片段（１．４ｋｂ）和ＩＬ２基因片段（０．４ｋｂ），两基因片段经重组后，构建了狂犬病毒Ｎ蛋白及ＩＬ２重组基因工程菌。重组基因产物具有特异性生物活性。用ＩＬ２单抗检测有一定ＩＬ２活性。免疫小鼠后，小鼠可抵抗狂犬病毒脑内攻击。结论：采用的载体及方法、路线可行，重组产物具有生物活性。