生物素酶缺乏症13例临床分析及随访

目的探讨生物素酶缺乏症(BTD)的临床特点、诊治和预后转归。方法收集13例BTD患儿的临床资料,应用气相色谱质谱(GC/MS)联用尿液有机酸分析、外周血生物素酶(BT)活性测定、聚合酶链反应-直接测序方法对BT基因的各个外显子及其两侧侧翼序列进行突变的检测,并对患儿进行随诊。结果13例患儿均检出BT基因突变,其中男8例,女5例,主要临床表现为反复气促(100%,13例)、皮疹(61.5%,8例)、抽搐(38.5%,5例)等。12例患儿(92.3%)尿液GC/MS分析提示3-羟基异戊酸升高,血气分析示持续性代谢性酸中毒、高乳酸血症。所有患儿均给予生物素治疗,48h内代谢紊乱纠正。随诊1~11年平均(4.681±2.739)年,均未再发代谢异常,体格、智力发育正常。结论反复皮肤黏膜损害、气促、反复癫痫发作、代谢性酸中毒、高乳酸血症是BTD的主要临床特征,对可疑患儿应尽早进行血尿代谢产物筛查及生物素酶活性测定,早期开始生物素治疗疗效显著,长期随诊预后良好。

碱促进的(3aS,4R,6aR)-双苄基生物素转化为(3aS,4S,6aR)-双苄基生物素的研究

目的:将生物素关键中体(3aS,4S,6aR)-双苄基生物素合成过程中产生的杂质(3aS,4R,6aR)-双苄基生物素经化学反应转化为产物(3aS,4S,6aR)-双苄基生物素。方法:通过碱催化反应,(3aS,4R,6aR)-双苄基生物素能顺利地转化为(3aS,4S,6aR)-双苄基生物素。结果:以异丙醇为溶剂,甲醇钠为催化剂,(3aS,4R,6aR)-双苄基生物素在25℃下搅拌24 h,以32.5%的收率得到(3aS,4S,6aR)-双苄基生物素。结论:该工艺为生物素工业生产中产生的杂质(3aS,4R,6aR)-双苄基生物素的回收利用提供了一种可行的方法。

牛支原体能量耦合因子转运蛋白S组件Mb BioY摄取外源生物素的功能分析

牛支原体(M.bovis)感染与生存依赖于外界微环境提供的各类营养代谢因子。开展M.bovis外源生物素摄取的机制研究,将对M.bovis防控具有极其重要的意义。通过对M.bovis PG45 Mb BioY(MBOVPG45_0349)基因进行系统发育分析、分子对接分析,筛选M.bovis PG45 Mb BioY突变株,比较PG45和PG45ΔMb BioY的生物素敏感性,异源构建Mb BioY功能性克隆验证其功能。结果表明,PG45染色体上存在一种崭新的生物素膜转运蛋白,全长996 bp,GC含量30.95%,蛋白长度为332个氨基酸,是由7个跨膜结构域组成的能量偶合因子(ECF)转运蛋白S成分Mb BioY。进一步验证后发现,当M.bovis缺失Mb BioY会影响其生长,表现出生物素代谢营养缺陷的表型。通过异源敲入生物素代谢营养缺陷大肠杆菌MG1655,表明Mb BioY单独存在时,就能够恢复生物素代谢营养缺陷大肠杆菌缺失株的生理功能。初步证明,Mb BioY编码的是能量偶合因子(ECF)转运蛋白的S成分具有摄取外源生物素的能力,该研究结果将补充细菌生物素代谢调控的多样性和复杂性,为M.bovis的有效防控提供独特视角。

肺癌病理应用支气管冲洗细胞块免疫组化链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶连接法染色的诊断效果及检出率评价

目的探讨肺癌病理应用支气管冲洗细胞块免疫组化链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP)染色的诊断效果及检出率。方法选取2017年2月至2021年12月广东省开平市中心医院收治的70例经支气管冲洗液检查阳性患者作为研究对象。采用液基薄层细胞学(TCT)技术制备细胞块,分别采用免疫组化SP法、苏木精伊红染色(HE)进行常规细胞学检查,比较两种检测方法诊断效能及不同肺癌类型免疫组化SP法检查后不同抗体阳性表达率比较。结果免疫组化SP法对恶性肿瘤诊断的灵敏度为96.15%、准确度为95.71%,均高于HE染色的69.23%、70.00%(P<0.05),特异度为94.44%,高于HE染色的72.22%,但差异无统计学意义。免疫组化SP法对肺癌病理类型总检出率高于HE染色,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化SP法对肌上皮(p63)、细胞角蛋白5/6抗体(CK5/6)、细胞角蛋白7(CK7);甲状腺转录因子-1(TTF-1)、突触素(Syn)、人表皮生长因子受体-5(CD56),增殖细胞的核抗原(Ki67),天冬氨酸蛋白酶(Napsin-A)表达阳性率均高于HE染色,差异统计学意义(P<0.05)。不同类型肺癌患者p63、CK5/6、CK7、TTF-1、Syn、CD56、Ki67、Napsin-A阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论支气管冲洗液细胞块免疫组化SP法染色对肺癌有较高的诊断价值,对不同类型肺癌有较高的检出率及鉴别率,具有重要的临床意义。

生物素的应用

生物素是一种水溶性含硫维生素,为动物所必需。由于生物素在饲料中分布广,且肠道微生物可以合成,多年来人们曾认为,日粮中不必添加。但60年代和70年代中期,分别发现家禽和猪出现生物素缺乏以后,营养学家开始重视生物素的作用（MeDowell,1989）。最近许多研究证实,在猪和鸡日粮中补充生物素具有正效应。 1 生物素的结构 天然存在的生物素为d型,分子式为C10H16N2O3S,d-生物素具有活性,无嗅无味,难溶于水,极难溶于乙醇,几乎不溶于醚及三氯甲烷,熔点为228～232℃。生物素的生物活性尚未确定,常用d-生物素的重量单位表示。

生物素对种鹅繁殖性能和蛋品质与血清生殖激素的影响

试验旨在研究饲粮中添加不同水平生物素对产蛋期种鹅繁殖性能、生产性能、蛋品质以及血清生殖激素分泌的影响,确定产蛋期种鹅生物素适宜添加量。选用150只体况相近的34周龄五龙鹅(豁眼鹅)种鹅,随机分为6组,每组5个重复,每个重复5只鹅(1公4母)。各组生物素添加水平分别0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/kg。试验时间为2022年3月—8月,预试期1周,试验期17周。结果表明:不同水平生物素组间种蛋孵化率差异不显著,但0.2、0.5 mg/kg生物素组种蛋受精率和合格率高于对照组(P<0.05);与对照组相比,各生物素组料蛋比分别降低了8.99%、7.07%、12.42%、10.28%、11.13%,其中0.3 mg/kg生物素组料蛋比最低(P<0.05),0.2 mg/kg生物素组平均蛋重高于对照组和0.4、0.5 mg/kg生物素组(P<0.01);0.1 mg/kg生物素组蛋壳强度高于0.4 mg/kg组(P<0.05),添加生物素对其他指标影响不显著;0.3、0.4、0.5 mg/kg生物素组孕酮水平高于对照组和其他试验组(P<0.05),0.5 mg/kg生物素组高于0、0.1 mg/kg生物素组(P<0.05);0.2、0.3mg/kg生物素组促黄体素高于对照组(P<0.01);0.2、0.4mg/kg生物素组雌二醇高于对照组和其他试验组(P<0.05);0.3、0.4 mg/kg生物素组促卵泡高于对照组和0.1、0.5 mg/kg生物素组(P<0.01)。本试验条件下,产蛋期种鹅饲粮生物素适宜添加量为0.2~0.3 mg/kg。

生物素对产蛋期种鹅血清生化指标、肠道黏膜上皮形态及肠道菌群结构的影响

本试验旨在研究生物素对产蛋期种鹅血清生化指标、肠道黏膜上皮形态及肠道菌群结构的影响。试验选用150只体型相近的34周龄五龙鹅(豁眼鹅)种鹅,随机分为6组,每组5个重复,每个重复5只鹅(1公4母)。各组饲粮中生物素添加水平分别为0(对照)、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/kg。预试期1周,正试期17周。结果表明:1)饲粮生物素添加水平对血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯含量没有显著影响(P>0.05)。0.2、0.3、0.4 mg/kg生物素组的血清总蛋白含量显著高于对照组(P<0.05),0.1、0.2、0.3、0.5 mg/kg生物素组的血清白蛋白含量显著高于对照组(P<0.05),0.2、0.3、0.4、0.5 mg/kg生物素组的血清高密度脂蛋白胆固醇含量显著高于对照组(P<0.05)。2)0.2、0.3、0.4、0.5 mg/kg生物素组的十二指肠绒毛高度显著高于对照组(P<0.05),且0.2 mg/kg生物素组的十二指肠绒毛高度显著高于其他各组(P<0.05)。0.3 mg/kg生物素组的十二指肠绒毛高度/隐窝深度显著高于除0.2 mg/kg生物素组外的其他各组(P<0.05)。饲粮生物素添加水平对十二指肠隐窝深度没有显著影响(P>0.05)。3)与对照组相比,0.2 mg/kg生物素组的盲肠福西亚马赛菌属和侏儒杆菌属的相对丰度显著升高(P<0.05),盲肠罗姆布茨菌属、苏黎世杆菌属、黄酮菌属的相对丰度显著降低(P<0.05)。由此可见,饲粮中添加适宜水平生物素可以促进产蛋期种鹅肠道黏膜上皮形态发育,调节肠道菌群结构。在本试验条件下,产蛋期种鹅饲粮生物素适宜添加水平为0.26~0.34 mg/kg。

生物素对荷斯坦奶牛泌乳性能、养分消化和瘤胃发酵的影响

本试验旨在研究生物素对荷斯坦奶牛泌乳性能、养分消化和瘤胃发酵的影响。选取产奶量、胎次和泌乳天数相近的荷斯坦奶牛48头,随机分为4组,分别在基础饲粮中添加0(对照组)、10、20和30 mg/d的生物素,每组12头牛。预试期20 d,正试期60 d。正试期间,记录每头牛每天的采食量和产奶量,采集饲粮、奶、粪便、瘤胃液和血液样品,测定乳成分含量、养分表观消化率、瘤胃发酵参数和血液指标。结果表明:随着生物素添加水平的提高,奶牛干物质采食量无显著变化(P>0.05);产奶量、乳脂肪和乳蛋白质产量、乳脂肪含量以及饲料效率呈线性提高(P<0.05);各养分表观消化率呈线性提高(P<0.05);瘤胃pH和乙酸/丙酸值呈线性降低(P<0.05);瘤胃总挥发性脂肪酸、乙酸和丙酸含量呈线性提高(P<0.05);瘤胃嗜淀粉瘤胃杆菌、溶纤维丁酸弧菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、总细菌和总真菌数量呈线性提高(P<0.05);血清葡萄糖、甘油三酯和胰岛素含量无显著变化(P>0.05),血清非酯化脂肪酸和β-羟丁酸含量呈线性降低(P<0.05),血清生物素含量呈线性提高(P<0.05)。由此可见,补充生物素改善了奶牛泌乳性能、养分消化和瘤胃发酵,推荐生物素添加水平为20 mg/d。

视神经脊髓炎样表现的生物素酶缺乏症1例

生物素酶缺乏症(BTD)是一种常染色体隐性遗传病,是由于编码生物素酶的生物素酶基因突变,引起生物素酶活性完全或部分缺乏,导致生物素减少,使依赖生物素的多种羧化酶的活性下降,致线粒体能量合成障碍,出现代谢性酸中毒、有机酸尿症及一系列神经与皮肤系统损害等表现,该病临床表现复杂,个体差异很大,易造成漏诊治、误诊。兰州大学第二医院小儿神经科收治1例11岁男性患儿,主要表现为双上肢无力及双下肢痉挛性瘫痪、视力下降,初步诊断为视神经脊髓炎谱系疾病,予以免疫治疗,疗效欠佳,经血、尿遗传代谢病筛查和基因检测,最终确诊为生物素酶缺乏症,补充生物素酶后患儿症状缓解。生物素酶缺乏症常导致严重神经系统损害,补充生物素治疗能起到良好疗效,因此进行该病早期筛查及早期诊断治疗是改善预后的关键。

微孔板式微生物法测定婴幼儿配方乳粉中叶酸、泛酸和生物素含量

目的建立微孔板式微生物法测定婴幼儿配方乳粉中的叶酸、泛酸和生物素含量的方法。方法按照国标方法分别提取婴幼儿配方乳粉中的叶酸、泛酸和生物素,在96孔微孔板中接种含有相应测试菌悬液的培养基,再分别加入标准系列溶液和试样提取液,培养后用酶标仪测定吸光度,根据标准曲线分别计算试样中的叶酸、泛酸和生物素含量,并考察测定方法的检出限、精密度和加标回收率。结果叶酸、泛酸和生物素标准曲线的相关系数均大于0.999,检出限分别为0.10μg/100 g、0.013 mg/100 g、0.57μg/100 g,相对标准偏差(relative standard deviations,RSDs)分别为1.02%、0.94%、1.08%,加标回收率分别为94.6%~100.0%、95.3%~103.3%、94.5%~100.1%。结论该微孔板方法操作简单、成本较低,结果准确性和重现性良好,适用于婴幼儿配方乳粉中叶酸、泛酸和生物素含量的大批量检测。

建立一种基于BAS化学发光技术检测血清β-hCG,Prog水平的抗生物素干扰方法

目的在基于生物素-链霉亲和素(biotin-avidin/streptavidin,BAS)的化学发光技术检测人绒毛膜促性腺激素β亚基(β-human chorionic gonadotropin,β-hCG)和孕酮(progesterone,Prog)时,建立一种简易、有效的抗生物素干扰方法。方法采用两种浓度链霉亲和素磁珠(streptavidin coated magnetic micro particles,M)检测不同生物素浓度的高、中、低水平的β-hCG和Prog血清,通过回收试验评价两种浓度M的抗生物素干扰能力以及采用低浓度M的校准曲线时高浓度M检测的准确度。结果①β-hCG和Prog的抗生物素干扰能力在低浓度M(0.72 mg/ml)时分别为100和25 ng/ml,在高浓度M(1.44 mg/ml)时分别为500和50 ng/ml。②使用和低浓度M相同的校准曲线时,高浓度M对于生物素浓度在500 ng/ml以下的β-hCG三个水平的回收率均在90%~110%之间;对于生物素浓度在50 ng/ml以下的高、中水平的Prog,其回收率在90%~110%之间。结论在基于BAS化学发光技术检测血清β-hCG和Prog时,采用高浓度M(1.44 mg/ml)是一种简易、有效且可靠的抗生物素干扰方法。

特殊膳食食品中生物素含量测定方法研究

目的建立超高效液相串联三重四极杆质谱法(UPLC-MS/MS)测定特殊膳食食品中生物素含量的方法。方法试样中加入内标物,采用40℃温水提取,振荡混匀后超声提取,冷却后用高氯酸调节pH至1.6±0.2,离心,上清用氢氧化钠溶液调节pH至4.5±0.2,再次离心,上清过0.22μm滤膜,经Kinetex RR-C_(18)(100 mm×2.1mm,2.6μm)色谱柱分离,以0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相,以内标法定量。结果生物素在1~50 ng/ml范围内具有良好的线性关系(r>0.999),方法检出限为0.003μg/g,定量限为0.01μg/g。在10 h内样品提取液中生物素含量稳定,RSD为5.87%。在5,15,30 ng/ml加标水平下的平均回收率为90.7%~116.9%,RSD为1.71%~4.42%(n=6)。结论此法检测速度快、灵敏度高、重复性好,适用于特殊膳食食品中生物素含量的快速及准确测定。

姜黄素-生物素偶联物的合成及抗肿瘤活性研究

为进一步开发安全有效的抗口腔癌药物,利用酰基化法及羧氨缩合法制备一系列姜黄素类衍生物,采用药物拼合原理,使姜黄素连接具有一定抗肿瘤活性及靶向性的生物素,合成一系列姜黄素-生物素偶联物(目标化合物2、4、5),其结构经^(1)H NMR、^(13)C NMR和HR-MS(ESI)确证。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测目标化合物对人口腔表皮样癌细胞(KB细胞)增殖的抑制作用。结果显示:化合物2在作用24 h及48 h时对KB细胞的IC_(50)分别是40.82μmol/L和26.23μmol/L,提示其抗肿瘤活性优于姜黄素。化合物4在作用24 h及48 h时对KB细胞的IC_(50)分别是39.83μmol/L和51.24μmol/L,提示在作用24 h时,其抗肿瘤活性优于原药姜黄素。

人血清癌胚抗原的生物素-亲和素ELISA检测方法的建立

目的:建立检测血清癌胚抗原(CEA)的高灵敏度生物素-亲和素酶联免疫检测(BA-ELISA)方法。方法:亲和层析纯化得到CEA,免疫新西兰家兔制备多克隆抗体。将得到的抗体连接生物素和辣根过氧化物酶,在生物素化BSA包被的96微孔板上建立生物素-亲和素ELISA(BA-ELISA)。对这一体系的线性、灵敏度、特异度、稳定性、回收率等参数进行鉴定,并和常规ELISA、放射免疫检测以及化学发光法相比较检测了临床标本中的CEA浓度。结果:线性检测范围为(0.42～50)U/mL,检测结果表明,体系稳定性良好;灵敏度为0.42 U/mL,批内、批间差异均小于10.0%。该研究建立的方法与常规ELISA对比差异有统计学意义,与放射免疫检测对比差别无统计学意义。与化学发光法相比较,回归方程为:y=0.04825+0.99674x,r=0.994,差异无统计学意义。结论:建立的CEA的BA-ELISA检测方法易于操作、灵敏度高、价格低廉,适合应用于临床检测。

d－生物素的立体专一性全合成研究

对ｃｏｎｆａｉｏｎｅ的ｄ－生物素（１）全合成进行了改进，从半胱氨酸计算，总收率３．７％。５与４－溴代三苯膦丁酸甲酯进行Ｗｉｔｔｉｇ－Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ缩合反应可立体专一性地转化成反式－烯（６）。以叠氮三甲基硅烷代替叠氮化锂亲核进攻９分子中Ｃ３－溴原子，可显著地提高顺式－叠氮内酰胺１０的收率。

热稳定生物素化荧光素酶的制备及其在焦测序中的应用

新一代大规模焦测序技术需要稳定的可固定化的荧光素酶,为了制备热稳定性好且被生物素化的荧光素酶,本研究采用基因工程方法将生物素羧基载体蛋白C端87个氨基酸残基(BCCP87)与荧光素酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行融合表达,以实现菌体内直接表达生物素化的荧光素酶(BCCP-LUC);并对北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因进行了定点突变以增强其热稳定性;用链亲和素包被的磁珠对重组融合蛋白进行固定化,用于焦测序。实验结果表明:突变后的荧光素酶在50℃环境中仍具有活性;在43℃下10min活性保留大于80%,热稳定性明显增强。Western blot分析结果表明,荧光素酶能够在大肠杆菌内生物素化。用链亲和素包被的磁珠结合BCCP-LUC后具有较高活性(2.1×105RLU/μL Beads),经过多次洗涤活性无明显下降。采用微球固定的荧光素酶以及ATP硫酸化酶成功的进行了DNA序列的测定且定量准确,表明固定化的荧光素酶可以应用于焦测序中,为建立高通量大规模芯片焦测序技术提供有效、稳定的工具酶。

生物素化抗AIB1单克隆抗体的制备及应用研究

目的用生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)对纯化抗AIB1单克隆抗体1A2E1进行标记,并应用标记后单克隆抗体对靶细胞中AIB1蛋白进行检测。方法用BNHS与纯化抗体1A2E1交联,制备Biotin-1A2E1,用竞争抑制ELISA法及免疫细胞化学法检测Biotin-1A2E1的生物学活性。结果所制备的生物素化抗体活性高,效价为1∶3200,用于检测乳腺癌细胞中AIB1蛋白敏感性好。结论成功制备生物素化抗体Biotin-1A2E1,并可初步应用于靶细胞AIB1蛋白的检测,为肿瘤辅助诊断中AIB1蛋白的检测提供有力手段。

疑难病研究—生物素酶缺乏症

报道1例生物素酶缺乏症病例,探讨因生物素酶缺乏症所致的临床特征和诊治方法。3岁男童,因脱发、皮疹6月,进行性肢体无力3个月就诊。运用尿气相色谱质谱联用及干燥血液生物素酶活性测定进行筛查,诊断符合生物素酶缺乏症。经生物素补充治疗,患儿3d后全身情况逐渐好转,1个月后基本恢复正常。生物素酶缺乏症常导致严重皮肤与神经系统损害,早期诊断与治疗是挽救患儿生命的关键。

利用生物素-链霉亲和素进行骨髓间充质干细胞的表面标记

背景:目前尚缺乏高效、无创的方式将干细胞植入靶器官,探索引导干细胞到达靶器官或组织的途径以及提高干细胞归巢效率是现今干细胞研究的重点领域之一。目的:利用生物素-链霉亲和素反应体系建立一种简单可行的细胞表面化学修饰方法,并评价此方法进行骨髓间充质干细胞表面标记的效率及其对细胞生物学功能的影响。方法:全骨髓培养法得到第3代骨髓间充质干细胞,采用流式细胞仪鉴定;以磺化生物素-N-羟基琥珀酰亚胺、生物素、链霉亲和素将黏附分子配体唾液酸化的路易斯抗原装备到骨髓间充质干细胞表面;通过荧光显微镜评估骨髓间充质干细胞表面标记的效率,锥虫蓝染色法检测骨髓间充质干细胞的活性,CCK-8比色法检测骨髓间充质干细胞的增殖功能;成脂、成骨诱导检测骨髓间充质干细胞多分化功能。结果与结论:(1)全骨髓培养法培养2周,可得到第3代骨髓间充质干细胞,细胞表达CD90,CD29,不表达CD34和CD45。(2)以生物素及链霉亲和素成功将黏附分子配体唾液酸Lewis X(Sle X)装备到骨髓间充质干细胞表面,且对细胞活性、增殖、分化功能影响不大。(3)运用这种方法对细胞进行表型修饰,操作技术简单,修改效率可达88%,有望提高骨髓间充质干细胞的归巢率,未来会有广泛和重要的应用价值。