致病疫霉菌效应蛋白Pi05440毒性功能验证及寄主候选靶标筛选

致病疫霉菌(Phytophthora infestans)侵染时会分泌大量效应蛋白进入寄主细胞,通过操纵寄主靶标抑制植物免疫反应。为研究致病疫霉菌效应蛋白Pi05440的功能,本研究重点分析了Pi05440的蛋白特征、毒性功能及鉴定其寄主靶标;利用生物信息学数据库,预测Pi05440的保守结构域和信号肽。构建pRI101-GFP-Pi05440表达载体用于Pi05440的亚细胞定位和毒性功能分析;同时,利用酵母双杂交技术对Pi05440的寄主靶标蛋白进行了筛选和鉴定。结果表明,Pi05440基因全长969 bp,编码322个氨基酸。结构预测结果显示Pi05440含有3个典型的KAZAL功能域。亚细胞定位结果表明Pi05440定位在质膜和细胞间隙。在本氏烟中瞬时表达该基因显著促进致病疫霉菌扩展。通过酵母双杂交筛选,初步鉴定到3个Pi05440的候选靶标蛋白,分别为马铃薯过氧化氢酶12、马铃薯几丁质酶以及马铃薯MYB-like A蛋白。本研究为探究致病疫霉菌效应蛋白Pi05440及其靶标蛋白如何调控植物免疫提供了重要线索。

基于ITS和β-tubulin基因分析的居间疫霉菌系统发育

【目的】对我国亚热带部分森林中的疫霉菌及其所致病害进行了系统调查和分析,研究疫霉菌的种类和遗传多样性,探讨疫霉菌的系统发育关系,为林木疫病的防治提供理论依据。【方法】利用健康叶片诱捕林间溪流里的疫霉菌,对有症状的叶片组织进行分离纯化,显微镜下根据其菌丝分枝和结构特征,初步判定为疫霉菌。对菌株的ITS和β-tubulin基因进行PCR扩增和测序,将序列拼接后,用MAFFT 7.0、PAUP 4.0 beta10、Mr Bayes 3.2.6及PhyML 3.0等软件进行基因序列系统发育分析。【结果】分离鉴定得到46株中国新记录种,通过进一步培养和显微镜下观察,其形态特征与居间疫霉菌Phytophthora intercalaris相吻合。拼接之后得到完整的ITS序列为847~849 bp,与参考菌株(KT163268)序列一致性为99.29%~99.53%;β-tubulin序列均为882 bp,与参考菌株(KT163336)序列一致性为99.43%~99.66%。系统发育分析结果显示供试菌株与居间疫霉菌以100%的支持率聚为一支。本研究不仅增加了居间疫霉菌的菌株数量,也扩大了该菌的分布范围,同时也增加了中国疫霉菌的种类。【结论】居间疫霉菌种内不同地理来源的菌株之间具有较高的序列一致性,但是也存在一些碱基的差异,从而形成不同的基因型。

广东辣椒疫霉菌分离鉴定及其致病力和生理小种分化研究

分离鉴定了来源于广东省不同辣椒产区的5个病原菌分离物，经形态特征鉴定及回接发病特征观察，确定这些菌株均为辣椒疫霉菌Phytophthora capsici Leonian．广东5个菌株在cA培养基上诱导产生的孢子囊形态类似，孢子囊形状多为卵圆形或长椭圆形，乳突明显，孢子囊平均大小40．8-45．9μm（l）×23．2—30．9μm（6），l/b1．4—1．8．菌株间菌丝生长速率、产孢能力及致病力有明显差异，经生理小种鉴别，4个为Race3，1个为Race1，初步推定Race3为广东辣椒疫病病原菌的优势小种．

蒙城大豆疫霉菌的鉴定及其生理小种

在安徽省蒙城县对大豆疫霉根腐病的发生情况进行调查。应用选择性培养基对类似大豆疫霉根腐病症状的病株进行病原菌分离 ,在春大豆蒙城早熟青豆病株上分离到 2株疫霉菌 PMC1、PMC2和一些 Fusarium spp.,在夏大豆上分离到的主要病原菌为 Pythium spp.和 Fusarium spp.,未分离到疫霉菌。根据疫霉菌分离物 PMC1和 PMC2形态和生理学特征以及对大豆的专化致病性 ,2个分离物被鉴定为大豆疫霉菌 (Phytophthora sojae Kaufmann & Gerdemann)。应用国际通用鉴别寄主进行生理小种鉴定 ,PMC1和 PMC2的毒力公式分别为 1b,1d,3a,3c,5 ,7和 1b,1d,4 ,5 ,为新的小种类型 ,定名为中国 6号小种、中国 7号小种 (CNR- 6和 CNR- 7)。这是首次报道大豆疫霉菌在我国淮北地区存在。

中国大豆疫霉菌分布及毒力多样性研究

通过大豆疫霉根腐病发生的田间调查、从病株和土壤中分离大豆疫霉菌 ,对大豆疫霉菌在我国的分布进行了研究 ,结果表明 ,除东北地区外 ,我国黄淮流域和长江流域也存在大豆疫霉菌。应用 13个鉴别寄主 ,对来自不同地区的 83个大豆疫霉菌分离物进行毒力鉴定 ,证明我国大豆疫霉菌存在丰富的毒力多样性。与植株分离物相比 ,土壤分离物的毒力多样性程度更高。对不同地区来源分离物的毒力组成比较表明 ,长江流域分离物的毒力多样性最丰富 ,其次是黄淮流域 ,而东北地区分离物的毒力组成相对简单。

大蒜挥发物和浸提液对辣椒疫霉菌的抑菌活性分析

采用菌丝生长速率法和凹玻片法测定了大蒜各部位挥发物和浸提液对辣椒疫霉菌各生育阶段的抑菌活性,并用GC-MS深入分析了大蒜浸提液中的抑菌活性成分,以期为利用大蒜和辣椒轮作或间作控制辣椒疫病提供指导。试验结果表明,大蒜各组织挥发物和浸提液对辣椒疫霉菌均具有抑菌活性,其中蒜瓣抑菌活性最强,挥发物浓度0.3 g/皿即完全抑制辣椒疫霉菌菌丝生长,浸提液浓度16.7 mg/mL时的抑制率为67.09%。蒜瓣浸提液浓度2 mg/mL时对辣椒疫霉菌游动孢子释放、休止和萌发的抑制率分别为18.44%,100%和100%。GC-MS分析表明,3种组织浸提液中均含有多种含硫化合物,包括二烯丙基一硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)、二烯丙基三硫化物(DATS)和二甲基三硫化物(DMTS)等。化合物单体活性验证结果表明,DADS、DATS和DMTS均具有抑菌活性,其中二烯丙基三硫化物(DATS)抑菌活性最强,浓度100 mg/L时抑制率为47.30%。综上所述,大蒜不同组织产生和释放的含硫化合物对辣椒疫霉菌具有杀菌活性,生产上可以利用大蒜和辣椒间作或轮作降低辣椒疫病的危害。

基于环介导等温扩增技术检测橡树疫霉菌

应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了基于颜色判定的简单、快速和灵敏的橡树疫霉菌(Phytophthora ramorum)检测方法。以ITS为靶序列对橡树疫霉菌的分子检测存在无法区分近似种的问题,笔者在橡树疫霉菌的基因组研究中,发现了PrA3aPro类转座子序列。生物信息学分析表明,该序列非常适合作为大豆疫霉分子检测的靶标。利用LAMP技术,以PrA3aPro为靶序列,设计LAMP特异性引物,建立LAMP反应体系与条件,并进行灵敏度和特异性试验。结果表明:整个检测过程仅需1 h,即可通过肉眼直接目测试验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,然后经3种方法验证扩增结果:1)浊度仪验证浊度变化;2)琼脂糖凝胶电泳验证;3)在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定。特异性试验中,在橡树疫霉菌株中能够产生浊度曲线,扩增到梯形条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而在其他疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象。在灵敏度试验中,PrA3aPro-LAMP技术最低检测限为1 ng.μL-1。该方法的建立为橡树疫霉菌的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。

土壤中大豆疫霉菌诱捕方法的改进

在大豆疫霉菌的土壤分离方法中,使用最广泛和最为经济的是Canaday等[1]建立的大豆叶碟诱捕法,但该方法分离效率很低,而且对进口大豆中夹带的土样进行诱捕时,在土壤浸润阶段土样表面易长满杂菌菌丝,致使诱捕无法进行.朱振东等[2]应用诱捕后的叶碟接种感病大豆,再对发病大豆植株进行组织分离,建立了一种分离土壤中大豆疫霉菌的方法,但该方法也无法解决由于杂菌的干扰而造成的分离率低的问题.因此,如何控制杂菌污染对分离土壤中的大豆疫霉菌非常重要.基于此,本研究应用选择性化学药剂控制大豆疫霉菌土壤诱捕过程中的杂菌污染,改良了大豆疫霉菌的土壤诱捕方法,并应用该方法从不同来源的土壤样品中分离到了大豆疫霉菌.

开口箭提取物对荔枝霜疫霉菌的抑制作用及其对荔枝果实的贮藏效果

目的寻找植物源抗菌物质用于果蔬采后病害的控制。方法对开口箭(Tupistrachinensis)根茎甲醇提取物进行了液-液分部萃取,利用生长速率法和果实接种病原菌的方法测定了提取物(萃)对荔枝霜疫霉菌(Peronophythoralitchii)的离体与活体抗菌活性,并用提(萃)取物处理荔枝进行了贮藏试验。结果开口箭甲醇提取物及其乙酸乙酯分部萃取物和正丁醇分部萃取物抑制荔枝霜疫霉菌菌丝生长的EC50分别为1598.10、662.86和1147.31μg.ml-1,用甲醇提取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物溶液处理,荔枝果实接种感病率明显降低,并且上述提(萃)取物具有防治荔枝贮藏病害发生和延缓主要品质性状劣变的作用。结论开口箭甲醇提取物及其乙酸乙酯分部萃取物和正丁醇分部萃取物对荔枝霜疫霉菌具有明显的离体和活体抗菌活性,对荔枝果实具有较好的贮藏效果。

沼液处理对土壤辣椒疫霉菌抑制效果及土壤性状的影响

设施辣椒栽培土传病害严重,已成为制约辣椒生产可持续发展的瓶颈问题。采用室内模拟的方法,以江苏铜山、南京、宜兴3地不同pH土壤为研究对象,研究原始沼液及铵强化沼液对辣椒疫霉菌的抑制效果,以期为探索新的克服土传病害方法提供理论依据。结果表明,淹水或沼液处理均导致土壤铵态氮含量增加,硝态氮含量降低。沼液处理后,土壤水溶性有机碳、水溶性有机氮显著增加。淹水降低了土壤细菌、真菌的数量及土壤脲酶、脱氢酶活性,而对放线菌数量影响不明显。淹水期间,土壤细菌、放线菌数量呈先上升后下降趋势,而真菌数量持续下降。铵强化沼液处理的土壤细菌数量最多,真菌、放线菌数量处理间差异不明显。各处理脱氢酶、脲酶活性于第2～4 d内达最大值,此后缓慢下降。试验结束时,铜山、南京、宜兴3种土壤脱氢酶活性较试验初始值分别降低15.2%～59.6%、7.9%～38.4%、2.8%～37.9%,脲酶活性分别下降了16.7%、17.3%、17.1%;疫霉菌的数量分别下降2～3、1～2、1个数量级。铵强化沼液处理的疫霉菌数量最低,较淹水对照分别降低54.7%、62.8%、51.9%,说明提高沼液氨浓度,可以增强对土壤疫霉菌的抑制效果。

不同地区辣椒疫霉菌遗传多样性的RAPD分析

通过利用12个十碱基随机引物对来自我国7个不同地理区域的56个辣椒疫霉菌株进行RAPD分析,探索了我国主要辣椒种植区间的辣椒疫霉菌的遗传分化关系。结果表明:1)受试56个菌株共产生70条谱带,其中多态性为56条,占80%,说明我国主要辣椒种植区的辣椒疫霉菌具有较丰富的遗传多样性;2)根据引物扩增的DNA指纹图谱,运用UPGMA分析法,以遗传相似系数0.6为阈值,将供试56个菌株划分为8个基因型(I、II、III、IV、V、V I、V II、V III),发现除少数来自相近地理海拔的绝大多数菌株被划分为同一个基因型外,其它不同地理区域的菌株基因型的划分与地理来源无直接的关系。在此基础上,结合我国不同地理区域辣椒疫霉病发生情况,提出我国辣椒疫霉菌基因型的划分除少数与地理区域有关外,其它绝大多数地区的辣椒疫霉菌基因型的划分与地理来源无直接的相关性。

“霜霉威(Propamocarb)”“甲霜灵(Metalaxyl)”对我国辣椒疫霉菌作用方式比较及交互抗性的研究

通过霜霉威(Propamocarb商品名普力克)、甲霜灵(Metalaxyl商品名瑞毒霉)对辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)6个菌株作用方式的体外测定结果表明,霜霉威浓度在2000ppm时对P. capsici孢子囊和卵孢子的形成,游动孢子的释放、游动及休止孢萌发、菌丝体的生长没有明显的抑制作用。而甲霜灵对P. capsici的各种孢子的产生及菌丝体的生长有较强的抑制作用,对菌丝体生长抑制的Ec_(50)和Ec_(95)分别为0.5596ppm和2.1511ppm;对孢子囊形成抑制的Ec_(50)和Ec_(95)分别为0.1520ppm和15.0032ppm。0.1ppm的甲霜灵可显著抑制卵孢子的生成。但500ppm的甲霜灵对于游动孢子的释放和休止孢萌发没有明显的抑制作用。对霜霉威和甲霜灵的体内活性试验结果表明,800ppm的霜霉威对辣椒疫霉菌的内吸保护防效达94％,1.0ppm的甲霜灵对该病的防效达100％。室内初步试验结果表明,甲霜灵与霜霉威对P. capsici没有交互抗性。

辣椒疫霉菌拮抗木霉菌株的分离与初步筛选

为了对辣椒疫病生物防治木霉菌剂的应用奠定基础，采用平板稀释法从5个土样中分离木霉菌，经对峙培养、幼苗拮抗试验考察了分离菌株性状和对辣椒疫病的抑制效果。结果表明：从5个土样分离出的69株木霉菌中，16株木霉菌对辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici ）的生长抑制率＞50％，12株木霉菌对辣椒疫霉菌的防效达100％，各木霉菌株菌丝生长速率在1．86-2．50 cm／d，木霉菌菌丝生长速率与其对辣椒疫霉菌生长抑制率无显著相关性；木霉菌丝对辣椒疫霉菌丝有缠绕、分解作用。

三种羧酸酰胺类杀菌剂对黄瓜疫霉菌不同发育阶段的影响及其敏感性测定

离体条件下测定了3种羧酸酰胺类(Carboxylic acid amides,CAAs)杀菌剂氟吗啉、烯酰吗啉和异丙菌胺对黄瓜疫霉菌不同生长发育阶段的抑制作用。结果表明,3种杀菌剂抑制黄瓜疫霉菌休止孢萌发的EC50值分别为0.54,0.46和0.34μg/mL;抑制菌丝生长的EC50值分别为0.92,0.70和0.67μg/mL;抑制孢子囊形成的EC50值分别为0.48,0.31和0.26μg/mL。但对游动孢子的释放、游动及休止孢的形成均没有抑制作用。氟吗啉、烯酰吗啉和异丙菌胺抑制田间采集的供试菌株菌丝生长的平均EC50值分别为1.09(±0.24),0.29(±0.04)和0.32(±0.07)μg/mL,供试菌株对3种杀菌剂的敏感性均呈正态分布,未检测到抗药性菌株的存在。

诱导大豆疫霉菌大量产生游动孢子囊的最佳方法研究

大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)是疫霉菌中难在培养条件下形成孢子囊的菌种之一。对诱发大豆疫霉菌产生游动孢子囊的10种方法进行比较研究,结果表明,供试的10种方法除了MSS溶液法外均能诱发产生游动孢子囊,其中以土壤浸出液法和皮氏液加土壤浸出液法效果最佳,产孢量大,所需的时间最短,游动孢子囊成熟度一致,且能一次性释放出游动孢子,从而成功地解决了大豆疫霉菌产生孢子囊难这一重要问题。

影响大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)游动孢子产生的条件

间歇性地给菌丝块换水可以诱导菌丝产生孢子囊 ,进而释放游动孢子。挑取 5～ 8块直径为 8mm于利马豆或 V8汁平板上培养 4～ 8d的菌块 ,置于直径 7cm的培养皿内 ,加入蒸馏水正好没过菌块表面 ,每 30 min换水一次 ,换水 4次后加入 15 ml Petri培养液 ,2 5℃、黑暗条件下培养 18～ 2 0 h,可诱发菌块大量产孢。

辣椒疫霉菌产孢培养基及诱导方法筛选

为筛选适合辣椒疫霉菌产孢的培养基和诱导方法。通过计算游动孢子数量,研究比较不同培养基和诱导方法对辣椒疫霉菌产生孢子囊数量的影响。研究结果显示:CA培养基最适合孢子囊的产生,孢子囊密度为5.68×102/cm2,其次为RA培养基,PDA、BA和LA最不适合孢子囊的产生。采用创伤接种法,将辣椒疫霉菌菌丝体接种于20 d大小的黄瓜果实上,于28℃,24 h光照培养4 d后,黄瓜接种部位可产生病斑,病斑及周围产生密集菌丝,病斑上产生大量孢子囊,其产孢量为1.35×104/cm2,而同样接种方法的甜椒果实上所产生的孢子囊数量较少或不产生。不同诱导方法比较显示,日光照射受伤菌丝所产生的孢子囊数量高于菌丝块水培法。研究结果表明,CA培养基、创伤接种黄瓜果实和日光照射受伤菌丝适宜辣椒疫霉菌孢子囊的产生。

大豆疫霉菌对大豆下胚轴侵染过程的细胞学研究

接种后1.5～24 h,用光镜和电镜研究了2个大豆品种与大豆疫霉菌Ps411的亲和性和非亲和性互作.观察结果表明,大豆疫霉菌对大豆下胚轴的侵染过程可分为侵入前、侵入、皮层组织中的扩展和进入维管束组织4个连续阶段.大豆下胚轴接种后在25℃保湿培养,1.5 h后游动孢子即形成休止孢并萌发产生附着孢,3 h后侵入表皮细胞,6 h后进入皮层组织,24 h后进入维管束组织.病原菌主要以侵染菌丝直接侵入表皮,表皮细胞间隙是主要侵入部位.皮层细胞是病原菌定殖和发展的主要场所,胞间菌丝侵入皮层细胞并形成吸器.在菌丝与寄主细胞接触部位的寄主细胞壁与质膜之间常有胞壁沉积物的形成.在抗病品种上病菌的侵染事件与感病品种基本一致,但不能形成正常的吸器,胞壁沉积物明显多于感病品种,菌丝在寄主组织内的扩展明显受到抑制.利用β-1,3-葡聚糖免疫金标记单克隆抗体进行的免疫细胞化学的研究表明,胞壁沉积物内含有大量的β-1,3-葡聚糖,在大豆疫霉菌菌丝壁中也存在β-1,3-葡聚糖.以上结果表明,病原菌的侵染可诱导抗病寄主细胞内β-1,3-葡聚糖迅速的合成与积累、并形成胞壁沉积物,以抵御病菌的侵染与扩展.

影响大豆疫霉菌(Phyto phthora sojae)卵孢子萌发的条件

培养 1个月的大豆疫霉菌卵孢子在水琼脂或土壤薄膜上均可萌发 ,在水琼脂上萌发只形成芽管 ,在土壤薄膜上萌发形成芽管和孢子囊。卵孢子在两种基质上萌发最适温度为 18- 2 4℃。光照刺激卵孢子萌发 ,抑制孢子囊的形成。卵孢子萌发不需外源养分。不同菌株卵孢子萌发率差异较大。

大豆疫霉菌对甲霜灵抗性风险的研究

为了评估大豆疫霉对甲霜灵是否存在抗性风险,采用药剂驯化的方法诱导获得了大豆疫霉菌抗甲霜灵突变株hlj34M,并对其适生性进行了初步研究。该突变体菌丝生长速率、游动孢子产量和致病力与野生型相比没有显著变化。而卵孢子产量明显减少,突变体的3个单游动孢子后代的卵孢子产量与亲本菌株相比分别减少20.35%、43.63%和43.85%,统计分析差异达极显著水平。结果表明:甲霜灵的长期使用会导致大豆疫霉对其产生较大的抗性风险。