生物材料促进角膜碱烧伤修复的作用机制和应用途径

背景:在角膜碱烧伤治疗中,传统治疗方法存在多种局限,尤其在控制炎症、预防新生血管形成和抑制角膜瘢痕化方面表现不佳。天然材料、合成材料或复合材料为治疗提供了多元化的选择,然而生物材料促进角膜碱烧伤修复的相关机制尚未形成系统深入的认识。目的:对目前生物材料促进角膜碱烧伤修复的国内外研究进行梳理,综述生物材料修复角膜碱烧伤的机制及其应用途径。方法:第一作者以“角膜,碱烧伤,羊膜,透明质酸,胶原,壳聚糖,高分子材料”“Amniotic membrane,Hyaluronic acid,Collagen,Chitosan,Polymer,Cornea,Alkali burn”为关键词在Pub Med、Web of Science、中国知网和万方文献数据库内检索,根据纳入标准和排除标准,最终纳入符合要求的76篇文献进行综述。结果与结论:(1)在角膜碱烧伤修复领域,羊膜、透明质酸、胶原、壳聚糖和可降解高分子材料等生物材料被广泛研究和应用,这些生物材料各有其特点和优缺点,在不同方面都有所突出。(2)首先,羊膜因含丰富的生物活性因子而被认为是最有前景的生物材料之一,其生物相容性良好,并且能够调节角膜炎症反应,但是存在供体短缺和易感染疾病的问题。(3)透明质酸具有良好的保湿性和生物相容性,并且能够提高角膜细胞的生存率和增加角膜透明度。(4)胶原具有良好的生物相容性和支架结构,能够促进角膜细胞的黏附和增殖,促进角膜组织结构的重建。(5)壳聚糖具有良好的生物相容性和可降解性,可作为载体用于药物递送和细胞移植。(6)可降解高分子材料具有较好的降解可控性,可为角膜碱烧伤的修复提供良好的支持和递送平台,但其稳定性和生物相容性仍需进一步研究。(7)综合来看,目前还没有一种生物材料能够完全解决角膜碱烧伤的修复问题,每种生物材料都有其特定的适用场景和局限性。(8)未来的研究方向应该是通过进一步改进生物材料的性能和结构,探索更有效的组合应用方式,以及深入了解生物材料与角膜组织的相互作用机制,以提高角膜碱烧伤的治疗效果和患者的生活质量。

枸杞糖肽对角膜碱烧伤小鼠角膜炎症反应及愈合的作用及其机制研究

目的探讨枸杞糖肽(LbGp)在角膜碱烧伤损伤愈合中的作用及其机制。方法根据治疗方式不同将45只健康、SPF级、6~8周、雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组(N组)、损伤对照组(PBS组)、LbGp治疗组(LbGp组),每组15只。PBS组和LbGp组小鼠右眼复制碱烧伤模型,采用点眼联合结膜下注射的方式分别给予PBS溶液或LbGp溶液(10 mg/mL)治疗。治疗后第3天采用裂隙灯显微镜及HE染色观察各组小鼠角膜上皮修复情况和角膜组织结构;实时荧光定量聚合酶链反应、Western blotting及免疫组织化学染色技术检测各组小鼠角膜组织NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、髓过氧化物酶(MPO)的表达及核转录因子κB(NF-κB)的磷酸化水平。治疗后的第14天采用裂隙灯显微镜对角膜混浊程度进行评分,HE染色观察角膜组织结构。结果治疗后第3天LbGp组小鼠角膜上皮愈合速度快于PBS组(P<0.05)。N组、PBS组及LbGp组的NF-κB-p65、NLRP3、IL-1β及IL-6基因和蛋白相对表达量比较,差异均有统计学意义(P<0.05),PBS组均高于N组(P<0.05),LbGp组均低于PBS组(P<0.05)。LbGp组角膜基质中MPO染色阳性的中性粒细胞的浸润较PBS组减轻。治疗后第14天LbGp组小鼠角膜混浊评分低于PBS组(P<0.05)。结论LbGp治疗可以抑制小鼠角膜碱烧伤后NF-κB的激活及NLRP3、IL-1β的表达,从而减轻过度的炎症反应,促进小鼠角膜上皮再生及角膜结构恢复,有助于恢复角膜的透明性和完整性。

托珠单抗调控角膜碱烧伤后修复的研究

目的:评估外用白介素(Interleukin,IL)-6特异性抑制剂托珠单抗滴眼液在调控角膜碱烧伤后修复的安全性和有效性。方法:6只角膜假烧伤小鼠局部使用托珠单抗滴眼(2.5 mg/mL)和6只角膜假烧伤小鼠局部使用生理盐水滴眼,分别作为实验组和空白组以评估托珠单抗滴眼液的安全性。30只碱烧伤小鼠,按照1∶1随机分配到治疗组和对照组,治疗组使用托珠单抗滴眼液滴眼,对照组使用生理盐水,每日6次,连续用14 d。通过前段光学相干断层扫描观察虹膜前粘连、角膜后弹力层脱离及角膜水肿,在体视显微镜下检查角膜瘢痕形成及上皮伤口愈合。在角膜切片上评估IL-6定位、肌成纤维细胞、免疫细胞浸润和角膜上皮化生。在角膜铺片上评估角膜新生血管和新生淋巴管面积。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)方法检测小鼠角膜IL-6的表达水平。结果:对未进行碱烧伤的角膜使用托珠单抗治疗未观察到明显的角膜结构的损伤。角膜碱烧伤后可见角膜结构的破坏,角膜瘢痕形成并伴有角膜上皮伤口的延迟愈合。使用托珠单抗治疗后,虹膜前粘连的发生率从86.67%下降至20%(P<0.01),角膜后弹力层脱离的发生率从93.33%下降至53.33%(P<0.05),角膜厚度小于对照组[(100.03±15.73)μm vs.(207.02±56.30)μm,P<0.001],角膜混浊评分从对照组的3.76±0.44下降到治疗组的1.94±0.83(P<0.001),治疗组在第5天(P<0.05)、第10天(P<0.001)和第14天(P<0.001)的上皮愈合率高于对照组。角膜碱烧伤后可见IL-6大量分布于角膜全层,且可见大量肌成纤维细胞形成及免疫细胞浸润,托珠单抗治疗后抑制了IL-6的表达(下降77.5%,P<0.05),肌成纤维细胞数量从每视野(91.44±65.60)个减少至(12.89±10.51)个(P<0.01),免疫细胞的数量从每视野(60.30±28.71)个细胞减少至每视野(6.80±3.82)个细胞(P<0.001)。此外,托珠单抗还减少角膜切片中每视野的杯状细胞数目,由(11.30±5.29)个减少至(2.00±1.90个)(P<0.01),并减少角膜新生血管和新生淋巴管的形成(分别减少了76.86%和71.16%,均P<0.001)。结论:局部使用托珠单抗抑制IL-6未见明显角膜毒性,且可以调控角膜碱烧伤后的修复。

石斛酚抑制碱烧伤大鼠角膜新生血管的实验研究

目的 探讨石斛酚抑制碱烧伤大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization, CNV)的作用。方法 构建SD大鼠角膜碱烧伤模型,随机分成正常对照组、模型对照组、低浓度石斛酚组、高浓度石斛酚组、阿柏西普组,每组各10只。低浓度石斛酚组、高浓度石斛酚组、阿柏西普组分别于伤后第1天结膜下注射2.5 mg/0.05 mL、5 mg/0.05 mL石斛酚,2 mg/0.05 mL阿柏西普。伤后第3、7、14天,观察并计算角膜新生血管占全角膜面积的百分比、角膜混浊评分并测量角膜厚度。碱烧伤第14天,处死全部大鼠,通过苏木素-伊红(HE)染色和免疫组化观察角膜组织中VEGF和CD34蛋白表达水平,以及通过ELISA检测各组VEGF、IL-1β、TNF-α的蛋白含量。结果 碱烧伤后第7、14天,低浓度石斛酚组、高浓度石斛酚组、阿柏西普组角膜新生血管面积占全角膜面积百分比均显著低于模型对照组(所有P<0.05)。碱烧伤后第14天,高浓度石斛酚组角膜混浊评分显著小于模型对照组(P<0.05),模型对照组、低浓度石斛酚组角膜厚度均显著高于正常对照组(所有P<0.001)。但是,高浓度石斛酚组、阿柏西普组角膜厚度与正常对照组相比较,均无显著性差异(所有P>0.05)。此外,低浓度石斛酚组、高浓度石斛酚组、阿柏西普组角膜组织中VEGF、IL-1β、TNF-α蛋白表达均显著低于模型对照组(所有P<0.01)。结论 结膜下注射石斛酚对碱烧伤大鼠角膜新生血管有抑制作用,并能促进角膜水肿的吸收。

皮质类固醇激素对于Hughes Ⅰ级角膜碱烧伤的治疗影响

眼部碱烧伤是常见的眼外伤，碱烧伤后角膜上皮的缺损、基质的溃疡、新生血管的生成等均可能影响角膜透明性，甚至造成单眼或双眼严重的视力损害，是临床常见的致盲原因。

眼前节碱烧伤早期治疗中阿司匹林的应用

眼部碱性烧伤是致盲率极高的严重眼外伤。随着乡镇企业的发展,本病在近年有增加趋势。我院自1991～1993年对15例21眼碱烧伤,除了进行冲洗、自血中和、抗感染等常规治疗外,还需早期应用阿司匹林,每天口服600mg,10天为一个疗程,经临床观察,效果满意,现报告如下。

羊膜移植术治疗兔重度角结膜碱烧伤后遗血管性角膜白斑

目的探讨羊膜移植术在重建眼表面、治疗重度角结膜碱烧伤后遗血管性角膜白斑的作用。方法采用甘油保存的人羊膜移植术治疗兔重度角结膜碱烧伤后遗血管性角膜白斑１０例（１０眼）。结果４例羊膜上皮面朝上者，术后１５～２０ｄ角膜表面上皮被覆完整，３０ｄ病理显示结膜上皮向角膜上皮转化；５例朝下和１例羊膜水肿者，术后羊膜被破坏，眼表面重建失败。结论羊膜移植术可用于重度角结膜碱烧伤晚期眼表面重建，支持羊膜无抗原性。

兔角膜碱烧伤后不同时期的组织病理学变化

目的:通过动物角膜碱烧伤模型,观察烧伤后不同时期角膜组织病理学的变化。方法:新西兰白兔36只,制作角膜中央部中度碱烧伤模型并依据取材时间完全随机分为12组:分别于烧伤后1,2,3,5,7d;2,3,4,5,6,7,8wk取材,做光镜、电镜观察。结果:角膜碱烧伤后1wk内上皮即修复,但2～3wk再次脱落,炎症细胞2wk后开始浸润,中期PMN较多,晚期淋巴细胞较多。结论:角膜碱烧伤后碱性物质的直接损害,MMP,及免疫反应均参与了对角膜的损害。

角膜碱烧伤血清特异性抗体的变化特征

目的动态检测角膜碱烧伤后血清抗角膜变性蛋白抗体的水平，了解其变化特征。方法新西兰白兔１３只，制作单眼角膜中央部中度碱烧伤模型，制备正常及碱烧伤角膜蛋白提取液，以酶标法（ＥＬＩＳＡ）检测角膜碱烧伤前后不同时期血清抗角膜变性蛋白抗体水平。结果角膜碱烧伤后机体产生特异性ＩｇＧ抗体，２周升高明显，５～６周达高峰，之后下降，至８周时仍然明显高于烧伤前水平。再次烧伤角膜，抗体产生更为强烈。结论体液免疫参与了角膜碱烧伤后的病理过程。

角膜基质细胞诱导分化的脂肪间充质干细胞羊膜片移植治疗兔角膜碱烧伤的疗效及其机制

背景角膜化学烧伤是致盲眼病之一，先前的各种疗法在临床上的应用均受到一定的限制，而脂肪间充质干细胞（ADSCs）移植疗法受到密切关注。目的观察诱导分化的ADSCs羊膜片移植治疗兔角膜碱烧伤的疗效及其机制。方法无菌条件下剪取兔角膜，用悬浮基质片法分离并培养兔角膜基质细胞（CSCs）。取兔腹股沟脂肪组织，以酶消化法（质量分数0．25％胰蛋白酶）分离及培养兔ADSCs，并用流式细胞术鉴定ADSCs表面抗原的表达。将CSCs与ADSCs共培养，采用免疫荧光技术和逆转录PCR（RT-PCR）鉴定CSCs诱导后ADSCs向角膜基质样细胞分化的表达，分别将诱导或未诱导的ADSCs种植于羊膜上制备成细胞羊膜片。选择60只新西兰白兔，右眼用浸有质量分数1％NaOH的滤纸贴敷于角膜中央50S制备兔角膜碱烧伤模型，按随机数字表法将模型眼随机分为诱导ADSCs＋羊膜移植组、未诱导ADSCs＋羊膜移植组、单纯羊膜移植组及模型组。分别于术后1周、2周和1个月在裂隙灯显微镜下观察各组兔模型眼角膜的混浊程度和新生血管形成情况，并对角膜炎症进行评分，采用ELISA法检测术后1个月角膜组织匀浆中CD45、叮干扰素（IFN-γ）、白细胞介素．10（IL-10）蛋白及房水中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的质量浓度。结果从脂肪组织分离培养的ADSCs表面抗原CDl05、CD29、CD44的阳性表达率分别为90．23％、88．56％、98．88％；分离培养的CSCs波形蛋白呈阳性表达；CSCs与ADSCs共培养后多数细胞双标记染色阳性。苏木精一伊红染色显示，ADSCs种植于羊膜后生长良好。术后1个月，模型组角膜混浊呈瓷白色，新生血管面积最大，而诱导ADSCs＋羊膜移植组角膜透明，新生血管最少。术后1个月，诱导ADSCs＋羊膜移植组、未诱导ADSCs＋羊膜移植组、单纯羊膜移植组和模型组兔角膜混浊程度评分分别为1．65±0．18、2．05±0．17、2．68±0．25和2．904-0．18，新生血管面积分别为（10．59±1．78）、（22．58±1．63）、（37．98±1．90）和（45．37±1．65）mm^2，术后1周、2周及1个月4个组间角膜混浊程度评分和角膜新生血管（CNV）面积的差异均有统计学意义（F=280．826、330．172、465．707，均P=0．000；F=60．020、670．811、1510．231，均P=0．000），其中诱导ADSCs＋羊膜移植组角膜炎症评分睨显低于其他3个组，CNV面积小于其他3个组，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。术后1个月，4个组间角膜组织匀浆中CD45、IL-10、IFN-γ质量浓度的差异均有统计学意义（F=916．545、1739．358、462．134，均P=0．000），其中与未诱导ADSCs＋羊膜移植组、单纯羊膜移植组和模型组比较，诱导ADSCs＋羊膜移植组CD45、IFN-γ质量浓度明显降低，而IL-10质量浓度明显升高，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。4个组兔房水中VEGF质量浓度的总体比较差异有统计学意义（F=129．126，P=0．000），其中诱导ADSCs＋羊膜移植组兔房水中VEGF质量浓度明显低于未诱导ADSCs＋羊膜移植组、单纯羊膜移植组和模型组，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论CSCs诱导的ADSCs羊膜片移植法治疗兔角膜碱烧伤有较好的疗效，其作用机制可能是ADSCs在CECs诱导下分化为具有角膜上皮细胞特征的细胞，同时羊膜可减轻免疫炎症反应，抑制新生血管形成。

诺帝滴眼液对碱烧伤诱导角膜新生血管的抑制作用

目的 观察自制诺帝滴眼液（Nordy eye drop）对Long．Evans大鼠角膜碱烧伤后新生血管（CRNV）有无抑制作用及其对正常角膜有无毒副作用。方法 采用0．025％、0．1％两个不同浓度诺帝滴眼液滴眼21d，通过裂隙灯、光镜、电镜观察检测诺帝滴眼液的毒副作用。建立角膜碱烧伤后角膜新生血管模型，0．025％、0．1％两个不同浓度诺帝滴眼液4次／d滴眼治疗，0．1％地塞米松磷酸钠滴眼液作为阳性对照、空白溶液作为阴性对照，观察诺帝治疗效果。结果 诺帝滴眼液滴眼21d后观察正常大鼠，无畏光、结膜充血等刺激症状，组织学检查显示结构正常，未见炎性细胞浸润。大鼠角膜碱烧伤后1d时仅见角膜缘血管网扩张，3d时新生血管长入，7～14d达高峰，14d时治疗组和地塞米松组新生血管开始退化；比较各组CRNV面积与角膜面积的比值，治疗组和阳性对照组均小于阴性对照组并有非常显著性差异（P〈0．01）。治疗组与阳性对照组间、0．025％与0．1％治疗组间均无显著性差异（P〉0．05）。结论 0．025％、0．1％的诺帝滴眼液局部滴眼无明显毒副作用，并且对CRNV有显著抑制作用。

碱性成纤维细胞生长因子促进角膜碱烧伤上皮修复的实验研究

120只兔角膜碱烧伤眼随机分成5组，分别以3种不同剂量的bFGF滴眼液和素高捷疗滴眼治疗，荧光素染色裂隙灯照相，照片经计算机图象系统分析，并做形态学检查。结果表明bFGF滴服液能促进角膜上皮的愈合。

IL-1 ra治疗角膜碱烧伤的免疫学机制研究

目的 研究白介素-1受体拮抗剂（IL—1ra）治疗角膜碱烧伤的免疫学机制。方法Wistar大鼠角膜碱烧伤模型，每组30只。Ⅰ组为阴性对照组，Ⅱ-Ⅳ组为IL-1ra结膜下注射治疗组（1000、500、200μg／ml，2次／d）。在烧伤后不同时间段（3、7、21d）收集角膜，行苏木精一伊红染色，CD3、CD4、CD8阳性细胞计数。结果IL—1ra治疗组角膜水肿程度轻，CD3＋、CD4＋、CD8＋细胞计数在各个时间点均少于对照组（P〈0．05）。7d、21d时1000μg／ml和500μg／ml组之间细胞计数无统计学差异（P〉0．05），但均少于200μg／ml组（P〈0．05）。结论 IL-1ra可剂量依赖性地抑制淋巴细胞在角膜的聚集和活化．下调角膜碱烧伤后免疫应激水平。

血管内皮生长因子靶向抗体对大鼠角膜碱烧伤后新生血管抑制作用的研究

目的通过对角膜碱烧伤大鼠模型结膜下注射VEGF靶向抗体MIL60,观察其对角膜新生血管(corneal neovascularization,CoNV)生长的影响,初步探讨MIL60抑制大鼠CoNV生长的基本作用机制。方法建立碱烧伤诱导的SD大鼠CoNV模型(右眼造模),根据碱烧伤后第1天结膜下注射的药物不同将72只大鼠随机分为:25 mg·m L^(-1) MIL60组、地塞米松组、MIL60溶剂组和NaCl组。观察并记录CoNV生长情况及角膜的形态变化,通过软件分析Co NV的长度及累及面积。碱烧伤后第3天、第7天、第14天、第21天和第28天分别处死动物,取角膜组织行HE染色和免疫组织化学染色,同时检测角膜中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、VEGF受体-1(VEGF receptor-1,VEGFR-1)、VEGFR-2和基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9,MMP-9)蛋白的表达。结果在各个时间点,与MIL60溶剂组和NaCl组比较,地塞米松组、25 mg·m L^(-1) MIL60组CoNV面积和长度显著减少,差异均具有统计学意义(均为P<0.01);25 mg·m L^(-1)MIL60组的CoNV长度和面积与地塞米松组相当(均为P>0.05)。同时,MIL60还能有效降低角膜组织中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2以及MMP-9蛋白的表达。结论 MIL60能显著抑制角膜碱烧伤后CoNV的生长,并且还能减轻碱烧伤引起的炎症反应。

自体角膜缘干细胞分期移植治疗中重度眼部碱烧伤

目的:观察分期人自体角膜缘干细胞移植治疗中重度眼部碱烧伤的临床效果。方法:对32眼中重度眼部碱烧伤早期进行自体角膜缘干细胞移植,随访观察2～18mo,如果未完全重建眼表面,可重复取角膜缘结膜组织(避开已手术区),进行角膜缘干细胞Ⅱ期,Ⅲ期移植。结果:32眼中,31眼眼表重建成功,29眼角膜透明,3眼角膜半透明,3眼发生轻度睑球粘连。结论:自体角膜缘干细胞移植治疗中重度眼部碱烧伤。对于重建眼表面,提高视功能,早期分期移植应用疗效较好。

兔前眼部碱烧伤机理的实验研究

兔前眼部碱烧伤后4小时、24小时和72小时,房水中丙二醛含量与正常相比明显升高(4小时P<0.001,24小时和72小时P<0.05);SOD活力与正常相比明显下降(各时间组P均<0.01)。提示超氧自由基及其代谢产物是导致碱烧伤后组织病理损伤的关键因素。这一次发现有助于指导碱烧伤的治疗。

新鲜羊膜移植术治疗急性期角膜碱烧伤的组织病理与超微结构观察

目的 了解新鲜羊膜移植在早期角膜碱烧伤治疗中抑制炎症和促上皮愈合的作用 ,并与保存羊膜作比较。方法 以 48只新西兰大白兔制作角膜碱烧伤模型 ,2 4h后设立新鲜羊膜移植组、保存羊膜移植组和对照组。术后 14、30 d取材角膜进行组织病理学检查 ,以计算机图像分析系统测量其多形核白细胞含量 ,扫描电镜和透射电镜观察角膜超微结构改变。结果 新鲜羊膜移植组角膜组织中多形核白细胞含量低于保存羊膜移植组 ,二者均低于对照组 (P<0 .0 1)。组织病理及超微结构观察显示 ,在角膜上皮细胞排列、细胞表面及细胞内结构方面 ,新鲜羊膜移植组优于保存羊膜移植组 ,二者均较对照组好。

多西环素对碱烧伤大鼠角膜组织中IL-1和TNF-α表达的影响

目的通过建立大鼠角膜碱烧伤模型,研究多西环素对碱烧伤角膜组织中白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达的影响,探索多西环素作用于角膜碱烧伤的抗炎机制。方法使用自制模具建立64只SD大鼠一侧眼角膜碱烧伤动物模型,分成以3 g·L-1多西环素眼液滴眼的实验组和以溶媒滴眼的阴性对照组,每日滴眼4次。于碱烧伤后3 d、7 d、14 d、21 d分别取下32只大鼠烧伤侧角膜组织行酶联免疫吸附实验(ELISA),检测角膜组织中IL-1、TNF-α的表达情况。结果 ELISA检测显示碱烧伤后第3天阴性对照组IL-1蛋白相对表达量为(127.58±35.92)μg·g-1,第7天为(89.54±42.63)μg·g-1,第3天多西环素组IL-1蛋白相对表达量为(53.77±21.18)μg·g-1,第7天为(36.60±10.78)μg·g-1,第3天、第7天时多西环素组IL-1与阴性对照组相比表达显著下降(均为P<0.05);第14天、第21天与阴性对照组比较IL-1蛋白表达差异均无统计学意义(均为P>0.05)。碱烧伤后第3天阴性对照组TNF-α蛋白相对表达量为(69.45±21.43)μg·g-1,第7天为(55.37±18.34)μg·g-1,第3天多西环素组TNF-α蛋白相对表达量为(24.06±9.39)μg·g-1,第7天为(14.81±5.72)μg·g-1,碱烧伤后第3天、第7天时多西环素组TNF-α与阴性对照组相比表达显著下降(P<0.05);第14天、第21天与阴性对照组比较TNF-α蛋白表达差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论多西环素作用于碱烧伤大鼠角膜可下调IL-1、TNF-α基因的表达,这可能是多西环素下调炎症因子表达,减轻炎症反应的机制之一。