伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/gG^-/LacZ^+突变株的构建

为了以国内地方分离株鄂A株为亲本构建伪狂犬病病毒双基因缺失株 ,采用外切酶Ⅲ和绿豆核酸酶酶切 ,构建了缺失主要毒力基因TK基因部分编码区的重组质粒 pSTK1-4 ,进一步改造成为转移质粒 pUCPB4。用HindⅢ将质粒pUCPB4线性化 ,然后与用EcoRI消化的伪狂犬病病毒鄂A株TK-/LacZ+ 突变株基因组DNA共转染PK- 15细胞 ,待完全病变后 ,收毒作空斑试验 ,PCR筛选TK缺失的重组病毒。重组病毒空斑纯化 3次 ,随机挑取空斑进行PCR扩增 ,证实所获得的病毒为均一的无TK-/LacZ+ 突变株污染的TK缺失的重组病毒。分别以TK缺失株病毒与鄂A野毒株为模板对TK基因进行PCR扩增 ,扩增产物经酶切分析和测序后发现 :TK缺失重组病毒的TK基因缺失了 2 0 5个碱基 ,XhoI和SalI位点消失 ,SmaI酶切片段发生变化。两种病毒在PK - 15细胞上形成空斑的大小和增殖的滴度无明显的差别。进一步提取TK缺失突变株基因组DNA ,与含gG -LacZ的转移质粒pUSKZ通过磷酸钙法共转染PK - 15细胞 ,待完全病变后 ,在X - gal存在下筛选蓝斑 ,将挑取的蓝斑纯化 3次后 ,对纯化的重组病毒进行TK、LacZ扩增 ,结果既能扩增出较以鄂A野毒株为模板扩增的要小的TK基因片段 ,同时又能扩增出LacZ基因 ,证实所得到的重组病毒为TK-/ gG-/LacZ+ 突变株。此双缺失突变株的构?

酵母海藻糖酶缺失突变株的构建及其耐性

【目的】构建酵母海藻糖酶缺失突变株,并进行耐性分析,进一步研究海藻糖与酵母耐性之间的关系,为商业生产打下一定的基础。【方法】利用同源重组的方法,敲除了编码酸性海藻糖酶的ATH1基因和中性海藻糖酶的NTH1基因,构建了酸性海藻糖酶缺失突变株(△ath1)、中性海藻糖酶缺失突变株(△nth1)和双缺失突变株(△ath1△nth1),并进行了耐性分析。【结果】结合PCR和Southernblot的结果,验证了突变株构建的正确。所有突变株的海藻糖积累量和细胞密度均高于亲本,冷冻、高温、高糖和酒精耐性提高了。【结论】说明海藻糖含量与酵母耐性有一定的相关性。突变株耐性的改善,表明它们在酿造和烘焙产业中具有潜在的商业价值。

HSV-1突变株M6感染人支气管上皮细胞后对巨噬细胞介导的免疫反应的影响

目的探究1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)突变株M6感染人支气管上皮细胞(16HBE细胞)后对巨噬细胞介导的免疫反应的影响。方法用HSV-1感染16HBE细胞分析培养液中细胞因子的变化;将巨噬细胞与被HSV-1毒株感染的16HBE细胞的上清液共培养并通过尾静脉回输至小鼠体内,分别在第1、3、7、28、56、90天对小鼠淋巴结细胞因子表达水平、脾脏T细胞比例变化、小鼠中和抗体表达水平以及特异性T细胞反应进行检测。结果16HBE细胞被HSV-1突变株感染后,上清液中募集和激活巨噬细胞相关的细胞因子均较高水平表达但略低于野毒株组;尾静脉回输实验后,突变株组小鼠淋巴结炎症因子、趋化因子和T细胞的比例随时间发生了不同的变化,并引起了弱于野毒株组的体液免疫和强于野毒株组的特异性T细胞免疫反应,且仅极少数与野毒株组具有显著性差异(P<0.05)。结论16HBE细胞被HSV-1突变株M6感染后能够释放募集和激活巨噬细胞的细胞因子,使巨噬细胞携带HSV-1突变株的特异性活化信息,激活了宿主的免疫系统,诱导了宿主的体液免疫和细胞免疫。

PEDV G2突变株动力学特征比较研究

[目的]本研究旨在通过对猪流行性腹泻病毒(PEDV)经连续传代后的毒株(PEDV-BJ-150)进行全面研究,探究其生物学特性、遗传变异、致病能力和细胞适应性,以评估其作为潜在减毒疫苗株的潜力。[方法]通过对PEDV-BJ-150和原始PEDV-BJ-01毒株进行细胞培养、动物感染试验和基因组测序,评估其在不同细胞系中的增殖能力、病毒滴度、致病性以及基因组的核苷酸序列变异并利用动物模型评估其感染特性和病理变化。[结果]PEDV-BJ-150经连续传代后在Vero-M细胞中表现出更高的增殖能力和滴度,尤其在悬浮适应株Vero-M和贴壁适应株Vero-M中表现出显著的滴度差异。实验结果显示其在体内感染后的致病性降低,尤其在肺部未检测到病毒存在,鼻翼和小肠部位显示更高的病毒滴度。此外,基因组测序结果表明PEDV-BJ-150的S蛋白存在多个位置的氨基酸突变,可能影响其细胞嗜性和致病能力。[结论]本研究发现经连续传代的PEDV-BJ-150在体内表现出的毒力和致病能力明显降低,表明其有作为减毒疫苗株的潜力。特别是S蛋白中的连续性氨基酸缺失可能导致病毒致病性降低,这为疫苗研发提供了新的思路。此外,研究发现不同组织对PEDV的感染特性不同,这对于深入了解病毒传播机制具有重要意义。本研究的创新之处在于发现了PEDV经连续传代后的致病性变化和S蛋白突变对病毒特性的影响,为病毒进化和疫苗设计提供了新的见解。这项研究为了解PEDV的病毒学特性和毒力变化提供了重要线索,对于病毒疫苗研发和应对疫情具有潜在的应用前景。

3株抗生素抗性放线菌活性突变株新产代谢产物及其抗肿瘤活性初步测试

从无活性海洋来源放线菌M15的3株抗生素抗性抗肿瘤活性突变株发酵物中分离鉴定了9个原始菌M15发酵物中没有的代谢产物,其化学结构分别鉴定为1,9-二甲酯-吩嗪(1)、过氧化麦角甾醇(2)、对-甲胺基苯甲酸(3)、染料木素(4)、大豆黄素(5)、N-(2-羟基苯基)-乙酰胺(6)、邻二羟基苯甲酸(7)、尿嘧啶(8)和2-吡咯酸(9)。在初步预试活性测试中,化合物1,2,4,5,7,8对K562细胞示有一定抑制作用,相关活性有待进一步详细测评。

PRRSV Nsp4基因突变株对β2M表达的影响

[目的]本试验旨在探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp4基因是否在抑制细胞β2M表达方面发挥关键性作用,以进一步研究PRRSV对抗原递呈的免疫抑制机制。[方法]建立PRRSV的反向遗传平台并成功拯救出PRRSV野生毒株SH2020。根据之前对Nsp4基因不同结构域的研究以及氨基酸位点功能预测,在其DomainⅡ和DomainⅢ分别筛选出3个和5个不同的氨基酸位点,并在病毒感染性克隆质粒上对这些位点进行不同的氨基酸替换突变,再将构建好的感染性克隆质粒转染Marc-145细胞以拯救各个Nsp4突变PRRSV病毒,将拯救的PRRSV病毒以MOI=0.02感染PAM细胞,并通过RT-qPCR和Western blot验证PRRSV Nsp4基因是否能够在PAM细胞β2M表达方面发挥作用。[结果]成功拯救出PRRSV D2-5(Nsp4-A80L)突变毒株,并且在Marc-145细胞上的生长动力学特性与野生毒株SH2020相似;而Nsp4基因其余位点突变则会导致PRRSV生长受到显著抑制从而无法进行试验。Western blot和RT-qPCR试验结果证实PRRSV D2-5毒株能够显著促进β2M在Marc-145和PAM细胞的表达,而野生毒株SH2020则表现出了对β2M表达的抑制作用。[结论]Nsp4基因在PRRSV抑制细胞β2M表达方面发挥重要作用,并且Nsp4-A80L突变能够显著促进β2M的表达。

红曲霉单产黄色素突变株的选育

在对红曲色素生产菌选育的过程中 ,得到了 9株在麦汁平板上不产红色素的突变株。对稳定性良好的 8株突变株进行固体发酵实验 ,两个样品呈黄色 ,其它呈白色。发酵样品在可见光谱范围内扫描 ,两黄色样品仅在 3 70nm处有一吸收峰 ,其它白色样品无吸收峰。单产黄色素突变株再经液体发酵实验 ,同样单产黄色素 。

球孢白僵菌高壳聚糖酶突变株的筛选

以球孢白僵菌 (Beauveriabassiana) 1 31 6为出发菌株 ,通过紫外线和高能电子束分别诱变分生孢子 ,采用平板透明圈法初筛和摇瓶培养复筛的方法 ,经 3轮诱变 ,筛选到 5株高产突变株。其中一株最高产的定名为Beauveriabassiana 1 31 6 V1 ,其壳聚糖酶活力是原始菌株的 1 6倍 ;而且经传代培养 。

航天诱导的凤仙花突变株性状及减数分裂过程的研究

本文报道了种子经神舟 4号飞船搭载的凤仙花突变植株的性状及减数分裂过程的变化。该突变株在花色及花型等宏观性状上有很大变异。观察减数分裂过程 ,发现其小孢子母细胞减数第 1次分裂前期基本正常 ,但到后期Ⅰ出现染色体分配的严重不均 ,并出现落后染色体、分散染色体等。减数第 2次分裂完成时 ,多数形成 4分孢子 ,但同时也出现各种形式的多分孢子。小孢子中染色体数目从 1～ 2 1条不等 ,甚至多达 30多条。小孢子的形状和大小变异明显 ,且小孢子的大小与所含染色体的数目呈正相关。碘液染色检查发现绝大多数花粉不育 ,并与该突变株的低结实率一致。分析认为花粉的大小差异和花粉的育性与减数分裂异常有关 。

苏云金芽孢杆菌无晶体突变株的逐级升温筛选及其转化性能

逐级从４２ ℃到４４ ℃和４６ ℃升温培养、并用０－０５ ％ ＳＤＳ 处理苏云金芽孢杆菌ＹＢＴ１４６３ ，获得了一系列内生质粒被部分或完全消除的无晶体（Ｃｒｙ －） 突变株，对４ 种Ｃｒｙ － 突变株的转化性能及导入的外源质粒的稳定性进行了研究。用限量培养基和４２ ℃培养筛选到Ｃｒｙ － 突变株后，升温至４４ ℃，从Ｃｒｙ － 突变株得到内生质粒被进一步消除的突变株；然后升温至４６ ℃来培养其中突变株ＢＭＢ１７０ ，并用０－０５ ％ 的ＳＤＳ进行处理，最终筛选到１ 株无质粒突变株ＢＭＢ１７１ 。用ｐＨＴ３１０１ 、ｐＢＭＢ１７３６ 、ｐＢＴＬ１ 和ｐＨＶ１２４９ 等４ 种外源质粒进行的转化及稳定性研究表明，转化频率的大小及导入质粒的稳定性与用作受体菌的Ｃｒｙ － 突变株携有的内生质粒数之间呈现一定的相关性，Ｃｒｙ－ 突变株的转化频率显著高于出发菌株，其中ＢＭＢ１７１ 的转化频率最高达１０７ 转化子／μｇ ＤＮＡ，且所导入的外源质粒的稳定性也高于其它Ｃｒｙ － 突变株及出发菌株ＹＢＴ１４６３ 。

氮源对红曲霉突变株产黄色素的影响

本文对诱变得到的红曲霉突变株MYM2产黄色素进行培养基氮源的优化,研究了几种常见的无机氮源和有机氮源对MYM2产黄色素的影响。结果表明,有机氮源玉米浆和无机氮源氯化铵有利于MYM2产黄色素,最佳质量分数均为1%左右,该条件下产黄色素色价分别达到84.12U/mL和72.17U/mL。使用这两种氮源混合来培养MYM2,最终黄色素产量达到96.51U/mL,其胞外色调和胞内色调都达到3以上。

一株嗜酸乳杆菌突变株转化亚油酸为共轭亚油酸条件的研究

以嗜酸乳杆菌为出发菌株,用紫外诱变方法,得到一株共轭亚油酸转化量较高的突变株,其转化亚油酸为共轭亚油酸的最佳条件为:反应温度35℃,pH值4.0,保温时间48h,亚油酸与培养液的比例为1000mg:100ml,在此条件下共轭亚油酸的产率达38.1%。在1mmol/L浓度下,Na+、Fe2+、Mg2+有助于提高共轭亚油酸的产量,而Hg2+、Co2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+不利于共轭亚油酸的合成。用超声波处理细胞后,共轭亚油酸的产率显著提高。

^(60)Co辐射诱变姬松茸突变株J_3的氨基酸分析与比较研究

测定并比较了^(60)Co辐射诱变姬松茸突变株J_3子实体与姬松茸原菌株子实体的氨基酸含量。结果表明,姬松茸突变株J_3子实体富含8种人体必需氨基酸、支链氨基酸、谷氨酸、赖氨酸和儿童氨基酸,分别比姬松茸原菌株子实体高66.67％、52.44％、77.36％、59.58％和71.57％。姬松茸突变株J_3子实体中支链氨基酸与芳香氨基酸比值也高于姬松茸原菌株及2种食用蛋白质和4种农产品。

酿酒酵母菌的紫外诱变及其突变株的性能测定

对从葡萄表面筛选的野生型酿酒酵母菌进行紫外线诱变,培养后筛选出7株酿酒酵母菌的突变株,通过测定其菌株的发酵性能、发酵液残留总糖含量以及产酒精能力,从中筛选出1株发酵液中残糖含量少、酒精度高、起酵速度快的酿酒酵母突变株。

流产布鲁氏菌疫苗A19-ΔVirB12突变株生物学特性研究

目的为了开发布鲁氏菌病新型标记疫苗,对流产布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株生物学特性研究。方法以亲本A19菌株为参照,对A19-ΔVirB12突变株的菌落形态、生物学特性、毒力、遗传稳定性、免疫原性进行实验比较。结果 A19-ΔVirB12突变株形态及生化特性同亲本株A19基本一致,其毒力弱于A19。A19-ΔVirB12突变株遗传稳定性良好且与A19具有相似的免疫原性。结论流产布鲁氏菌A19-ΔVirB12株毒力较低、遗传性状稳定、并具有良好的免疫保护效力,可作为新型动物布鲁氏菌病标记疫苗研制的候选株。

伪狂犬病毒UL14基因缺失突变株的构建及其生物学特性研究

UL14在α-疱疹病毒中相当保守,但其在伪狂犬病毒中的功能尚不清楚。本研究以伪狂犬病毒鄂A株(PRV-Ea)为亲本株,通过同源重组,将编码EGFP的真核表达盒插入到伪狂犬病毒基因组的UL14基因中,PCR检测和荧光观察证实获得了能稳定表达EGFP的UL14插入失活突变株PRV-UL14D。将PRV-UL14D感染IBRS-2细胞,发现该突变株较PRV-Ea野毒株增殖缓慢,而且PRV-UL14D突变株感染细胞后形成的蚀斑也明显小于PRV-Ea野毒株,但在稳定表达UL14的IBRS-2细胞系中,PRV-UL14D与PRV-Ea野毒株的增殖速度、形成的蚀斑大小均无明显差异。进一步将PRV-UL14D感染BALB/c小鼠,发现与相同剂量的PRV-Ea野毒株感染相比,小鼠平均死亡时间明显延缓。上述研究结果表明,UL14并非伪狂犬病毒增殖必需的,但其缺失可延缓病毒增殖,推测UL14可能与病毒粒子在细胞间的扩散有关。

以克隆载体为自杀载体快速构建布鲁氏菌的无痕缺失突变株

构建突变株是病原微生物致病机理研究的重要手段。以往研究中布鲁氏菌的无痕缺失突变株都采用传统的自杀载体来构建,效率低下。首先对布鲁氏菌的电击转化条件进行了优化,然后选择含有反向筛选基因sacB的pEX18Gm质粒作为自杀载体,构建了缺失Ⅳ型启动子区的布鲁氏菌无痕缺失突变株。这不仅为构建布鲁氏菌的突变株提供了一个快速有效的技术平台,也为深入研究Ⅳ型分泌系统的功能奠定了基础。

pUC19K质粒的构建及其在布鲁氏菌突变株构建中的应用

突变株的构建是细菌基因功能研究的前提。构建了一个可用于布鲁氏菌突变株构建的自杀质粒。在pUC19质粒的多克隆位点插入卡那霉素抗性基因,在该基因两侧添加多个酶切位点,构建成为pUC19K。利用该质粒,构建了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因的突变株。结果表明,利用该自杀质粒,通过一轮筛选即可得到目标基因被抗性基因替换的突变株。pUC19K质粒的构建及成功应用,为布鲁氏菌突变株的构建提供了一个快速有效的手段,也为布鲁氏菌的基因功能研究奠定了基础。

伪狂犬病病毒鄂A株gG^-/LacZ^+突变株的构建

以从湖北某猪场分离鉴定的鄂A株为亲本 ,提取其基因组DNA ,克隆含 gG基因的SphⅠ /KpnⅠ片段 ,然后将LacZ基因融合到 gG启动子下游 ,得到重组质粒 pUSKZ ,将重组质粒与鄂A株基因组共转染PK 15细胞 ,待细胞完全病变后 ,在X gal存在下 ,作蓝斑筛选纯化。经斑点杂交和PCR扩增证实得到的是基因型为 gG- /LacZ+ 的重组伪狂犬病病毒。

^(60)Co辐射诱变姬松茸突变株J_3中蛋白质的营养评价

对姬松茸突变株J3蛋白质的营养价值进行了研究 ,分析表明 ,姬松茸突变株J3蛋白质所含 9种人体必需氨基酸占氨基酸总量的 46% ,其氨基酸评分 94 5,必需氨基酸指数 92 4,生物价 89 0 ,氨基酸比值系数分为 72 3 ,营养指数 3 2 5与姬松茸原菌株相比居第一位 ,只有化学评分居第二位 74 1 8。这些结果证实姬松茸突变株J3的蛋白质具有很高的营养价值。