基于高通量测序技术分析不同窖龄窖泥真菌群落多样性与空间异质性

利用Illumina NovaSeq高通量测序、冗余分析和FUNGuild等方法对甘肃金徽酒10a和50a窖龄窖池及其不同空间位置窖泥的真菌群落结构、真菌菌群与理化因子之间的关系以及真菌功能预测等进行研究。结果表明,随着窖池深度的增加,10 a窖池窖泥的多样性和丰富度呈现降低趋势,50 a窖池窖泥的多样性整体呈现升高趋势,而丰富度则呈现先降低后升高趋势,其中10a窖池窖壁上层的多样性和丰富度均显著高于其他位置(P<0.05),而50a窖池窖底层的多样性和丰富度均显著高于其他位置(P<0.05)。10a窖池窖壁层的多样性和丰富度显著高于50a窖池(P<0.05),而50a窖底层的多样性和丰富度明显高于10a窖池(P<0.05)。所有窖泥样品共检测到21个真菌门和520个真菌属,其中子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)和罗兹菌门(Rozellomycota)4个优势真菌门以及曲霉属(Aspergillus)和哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)等多数优势真菌属的相对丰度随窖池窖龄和空间位置的变化差异显著(P<0.05)。镰刀霉属(Fusarium)、Aspergillus、Kazachstania和红曲霉属(Monascus)与水分、腐殖质、K^(+)和Ca^(2+)含量呈正相关,枝孢菌属(Cladosporium)、维希尼克氏酵母属(Vishniacozyma)与pH值呈正相关。窖泥真菌营养类型主要有腐生营养型和病理-腐生-共生营养型等7种,功能类群包括4个单一功能群和7个混合功能群。通过系统分析不同窖龄窖池和空间位置的窖泥真菌群落多样性,为明确甘肃金徽酒窖泥的真菌群落结构及空间分布规律奠定了理论基础。

产己酸微生物筛选及其在浓香型白酒窖泥养护中的应用研究

该研究采用富集培养及己酸定性和定量分析从浓香型白酒酒厂的窖泥中分离筛选高产己酸的己酸菌,通过形态学观察及分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并将其应用于窖泥养护中,检测养护前后窖泥的理化指标及挥发性风味成分。结果表明,筛选并鉴定得到一株可稳定高产己酸的水原拉梅尔芽孢杆菌(Rummeliibacillus suwonensis)DFN-1,其传代3次后,己酸产量为8.15 g/L。通过菌株DFN-1养护窖泥后,窖泥的品质明显得到改善,其水分含量提高10.62%,腐殖质含量提高47.10%,总氮含量提高30.55%,耐热芽孢杆菌数提高9.98%,铵态氮含量提高35.94%,特征风味物质己酸和己酸乙酯相对含量分别提高至31.73%和0.43%。

人工窖泥微生物群落对浓香型白酒发酵过程风味代谢物形成的影响

本研究以无窖泥酒醅的小型模拟发酵体系为对照,比较窖泥组和无窖泥发酵酒醅微生物群落和代谢组分的异同。结果表明,窖泥显著提高酒醅中丁酸、己酸、乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯等浓香型白酒骨架风味化合物的含量,降低乳酸和乳酸乙酯等组分的含量。在起始阶段,两组酒醅上层和下层的优势菌之一Lactobacillus的相对丰度都显著增高,结束时仅略有差异。窖泥组Lactobacillus的衰减期较对照组提前了约15 d。Lactobacillus降低的同时,对照组中Rhodococcus及窖泥组中Kroppenstedtia、Clostridium_sensu_stricto_12和Acetobacter的相对丰度增高。发酵过程中糖酵解途径中大多数酶以及己酸合成酶(EC 1.3.1.38、EC 2.3.1.16、EC 6.2.1.1)和丁酸合成酶(EC 2.3.1.9、EC 2.8.3.8)的丰度增加,且下层酒醅这些酶的丰度显著高于上层。以乳酸为底物的乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27)丰度在窖泥组中增加。这些结果揭示了窖泥对酒醅微生物群落及代谢组分的贡献特点。

窖泥养护液在凤香型白酒生产中的应用

实验通过在新建窖池添加窖泥养护液的方式,提高新建制酒车间基酒品质,添加后对窖泥微生物改进及基酒中己酸乙酯含量进行跟踪检测,结果表明,该方法的养护效果显著,窖池微生物环境改善明显,芽孢杆菌数量增加了2.6倍,基酒中己酸乙酯含量在破窖期、顶窖期、圆一排、圆二排、圆三排、插窖期、挑窖期分别提高了114.1%、28.9%、10.2%、35.5%、58.5%、65.8%、85.7%。该方法为新建窖池基酒品质的提升提供了技术支撑。

液体窖泥及其应用

介绍一种创新的液体窖泥配方及其在酿酒过程中的应用。在酿酒过程中,该配方结合传统工艺和现代生物技术,通过延长酯化时间和引入己酸菌液,显著提升了白酒中己酸乙酯的含量,从而改善了白酒的风味和品质,同时,该创新工艺解决了诸如增己降乳、老窖退化等行业难题,为酿酒工艺的改进提供了重要的实践参考。

窖池中酸性脲酶产生菌的分离鉴定及其对模拟窖泥pH值和风味物质的影响

为改善窖池老化现象,该文从水井坊窖泥中分离酸性脲酶产生菌,将分离株与产香克氏梭菌S008复配后固态发酵,探究酸性脲酶产生菌对模拟窖泥pH值及挥发性风味物质影响。结果表明,筛选出4株酸性脲酶产生菌,鉴定并命名为布氏乳杆菌S162、科氏葡萄球菌S163、鲁梅利芽孢杆菌S164和水原拉梅尔芽孢杆菌S165;4株菌的脲酶活性在0.45~1.51 U/mL;复配菌株的模拟窖泥pH值呈现:上部>中部>下部,其中S163的模拟窖泥pH值最高(P<0.05)。在风味物质检测中,协同发酵后S163乙醛含量(2.38 mg/100 mL)最高,而S162乙缩醛含量(2.50 mg/100 mL)最高;正丙醇、正丁醇、正己醇和异戊醇含量分别是S008单菌发酵的1.41~1.97倍、0.92~1.85倍、0.66~1.58倍、1.13~1.69倍;S164与S008协同发酵对己酸含量提升最显著(P<0.05);4株菌与S008协同发酵可以分别提高“四大酯”含量2.66~5.02倍、1.21~4.85倍、1.33~3.31倍、1.27~2.86倍。研究表明,酸性脲酶产生菌与克氏梭菌S008协同发酵可以不同程度提高模拟窖泥pH值及主要挥发性风味物质含量。

高效定向驯化人工窖泥功能菌群及机制的研究

窖泥的质量和窖龄密切相关,且显著影响基酒的品质和产率。窖泥中功能菌群的形成是一个非常缓慢的过程,因此缩短优质人工窖泥(artificial pit mud,APM)的生产周期迫在眉睫。挖掘优良窖泥功能菌群资源,优化窖泥培养工艺是攻克发展障碍的关键。研究了太空(taikong,TK)大曲对窖泥群落结构的影响特点,确定了百年窖龄泥是人工窖泥功能菌群的强化源。TK大曲驯化生产APM及发酵后窖泥(pit mud,PM)显著改善了窖泥群落结构及挥发性代谢组分,提高了细菌群落的α-多样性。浓香型白酒酿造功能菌梭状芽孢杆菌(Clostridium_sensu_stricto_12)和古菌,尤其是甲烷八叠球菌(Methanosarcinales)的丰度显著增高了2~4倍,其中己酸和己酸乙酯是关键代谢物。研究结果可为基于优质窖泥和大曲的人工窖泥培养技术开发提供理论与技术支撑。

感官定量描述结合化学分析技术解析浓香型白酒窖泥臭味物质基础

窖泥臭味是浓香型白酒常见的异味,研究浓香型白酒窖泥臭味物质基础,对提高酒体品质具有重要意义。该研究联合使用感官分析技术和多种挥发性化合物检测技术对浓香型白酒中风味物质进行解析,进一步对30批正常和窖泥臭缺陷型浓香型原酒中135种风味物质准确定量,采用感官分析结合化学分析技术筛选出对浓香型白酒窖泥臭味具有重要作用的化合物,最终通过香气添加试验确认窖泥臭味物质基础。结果表明,芴、吲哚、3-甲基吲哚、4-甲基苯酚、丁酸、异丁酸、戊酸、庚酸、甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫、丁酸甲硫醇酯与浓香型白酒窖泥臭味密切相关,这些物质的含量对浓香型白酒的感官特征具有重要影响,含量过高会导致浓香型白酒出现窖泥臭味。

浓香型白酒窖泥质量评价研究进展

综述了浓香型白酒窖泥质量评价的研究进展。首先介绍了窖泥的重要性及其在酿酒过程中的作用,然后总结了现有窖泥质量标准的特点和不足,阐述了近年来关于窖泥质量评价标准的研究成果,包括微生物群落结构、代谢产物、环境因素等方面的影响,最后讨论了窖泥质量评估指标的选取原则和评估方法,并指出了当前存在的不足和未来研究的方向。

窖泥培养液配方优化及其在退化窖池养护中的应用

以浓香型白酒生产过程中的原材料、副产物为基础,研制窖泥培养液,对退化窖池进行养护。采用单因素试验对窖泥培养液基础配方进行优化,在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken法,以老窖泥添加量、黄水添加量、培养温度和培养时间为因素对培养液进行优化。结果表明,当老窖泥添加量为11.80%、黄水添加量为10.80%、培养温度为37℃、培养时间为37 d时,窖泥培养液中的己酸产率达到最大值,为7.27 g/L。将培养液对退化窖池进行实践应用,原酒中己酸乙酯含量由1.74 g/L提升至3.47 g/L。

浓香型白酒窖泥中可挥发性风味物质与其细菌群落关系解析

窖泥质量是影响浓香型白酒质量的关键因素之一。为了揭示浓香型白酒窖泥中与挥发性物质积累有关的细菌群落的空间分布,对不同层次窖泥的理化性质进行了研究,采用顶空气相固相微萃取-气相色谱-质谱法(HS-SPME-GC-MS)分析挥发性风味物质,采用变性梯度凝胶电泳法(DGGE)分析窖泥中细菌群落特征,并对二者进行了相关分析。结果表明,主要分布于窖泥下层的Clostridium与己酸、己酸乙酯、丁酸乙酯、己醇有较强的相关性,与丁酸有中等的相关性,对浓香型白酒的香气和风味成分起关键作用,Lactobacillus与乳酸乙酯、正丁醇、2,3-丁二醇呈正相关,Petrimonas sulfuriphila与丙酸高度相关,Syntrophomonas curvata也与正丁醇有关,Proteiniphilum acetatigenes与2-甲基苯酚显著相关,而Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans与3-甲基苯酚高度相关,Caloramator mitchellensis与十三酸乙酯呈显著正相关;位于窖泥下层的Lactobacillus acetotolerans、Anaeromassilibacillus senegalensis、Clostridium kluyveri、Clostridium luticellarii、Proteiniphilum saccharofermentans和Petrimonas sulfuriphila与总碳、腐殖质、K^(+)、NH_(4)^(+)-N、Mg^(2+)、PO_(4)^(3-)呈正相关,Clostridium jeddahense、Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans、Sedimentibacter hydroxybenzoicus、Petrimonas mucosa,Ardenticatena maritima、Syntrophaceticus schinkii、Clostridium sporosphaeroides、Fermentimonas caenicola和Janthinobacterium lividum呈中等程度的正相关,Thermoclostridium caenicola、Clostridium kluyveri、Clostridium sporosphaeroides、Clostridium luticellarii和Clostridium jeddahense与总碳、腐殖质和镁离子呈显著正相关,Petrimonas sulfuriphila与腐殖质呈正相关,Christensenella massiliensis与NH_(4)^(+)-N、总碳、腐殖质、PO_(4)^(3-)呈负相关。结果可为进一步研究窖泥中挥发性化合物在不同层次中的积累机理提供依据。

基于PCR-DGGE技术分析浓香白酒窖泥梭菌多样性

窖泥是浓香型白酒酿制过程中最主要的微生物源,窖泥中微生物的类型、丰度、新陈代谢活动等均对浓香型白酒品质产生很大的影响。为探究窖泥中梭菌微生物的多样性,利用窖泥理化结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术对10个窖泥样品中的梭菌群落及变化规律进行研究。结果表明,所选10个窖泥的理化参数均符合优质窖泥指标要求;在微生物层面,窖泥中检测到的梭菌在属水平上有:嗜碱菌属、丁酸弧菌属、梭菌属、喜热菌属、瘤胃梭菌属、粪球菌属、沉淀杆菌属(Sedimentibacter)、钙原杆菌属(Caldicoprobacter)、温带菌(Tepidimicrobium)、梯氏菌(Tissierella)、孢子菌(Sporanaerobacter)、硫酸盐还原菌属、鲁替孢菌属和梭状芽胞杆菌(Clostridiisalibacter)等,这些菌是优质窖泥的重要指示菌,可知窖泥中含有极其丰富的酿酒功能菌。揭示了可能在白酒酿造中起关键作用的梭菌菌群,在分子水平上为研究浓香型白酒提供了理论依据。

浓香型白酒窖泥中微生物可培养与不可培养多样性分析

浓香型白酒窖泥微生物多样性与白酒品质息息相关,且可培养微生物被应用于各领域。本文采用厌氧技术对窖泥中微生物分离鉴定以及通过高通量的方式进行OTU划分、Alpha多样性分析、Beta多样性分析、分类学组成分析,以此为依据对微生物群落研究。结果表明:可培养微生物中梭菌属(56.3%)是优势菌,其次为乳酸菌(38.5%);不可培养微生物细菌优势门是厚壁菌门(66.0%),古菌是广古菌门(78.0%);从属水平结构分析,老窖泥优势菌属是互营乙酸氧化菌(24.4%),优势古菌属是甲烷囊菌属(53.9%);新窖泥优势菌属是己酸菌属和丁酸梭菌属(14.8%, 14.5%),优势古菌属是甲烷杆菌属(41.8%);窖泥内和窖泥外优势菌属是棒状杆菌属(16.2%, 14.5%),优势古菌属是甲烷短杆菌属(96.9%, 85.0%)。本研究为郎酒窖泥可培养菌株资源开发和不可培养微生物多样性的实际应用提供参考依据。

不同位置窖泥酶活力及其细菌群落结构相关性分析

窖泥微生物对酒质的影响是通过多种酶促反应实现,目前对窖泥酶活的研究较少,缺乏关于窖泥中氮代谢功能酶的空间分布特征分析。该研究分析不同位置的窖泥理化因子和酶活力,采用高通量测序技术对窖泥细菌群落进行分析,通过聚类分析研究细菌群落的空间分布特点,并标记窖泥微生物的基因序列预测参与氮代谢功能酶的相对丰度。结果表明,铵态氮含量(1478.37 mg/kg)、过氧化氢酶活力[1.731 mg/(g·d)]、蛋白酶活力[1.107 mg/(g·d)]在窖底窖泥中最大,在窖池内自上而下呈增高趋势,而脱氢酶呈减小趋势。Firmicutes是窖泥的绝对优势菌门,Caproiciproduces、Lactobacillus、Fastidiosipila分别是窖底、窖壁中层和窖壁上层窖泥的第一优势菌属。铵态氮、蛋白酶与Aminobacterium呈显著的正相关(P<0.05);酸性磷酸酶与Lactobacillus呈显著负相关(P<0.05),脲酶与Syntrophaceticus呈显著的正相关(P<0.05)。PICRUSt2功能预测中,参与氮代谢的功能酶在不同位置窖泥中的相对丰度差异显著(P<0.05)。酶活性影响窖泥物质循环,物质交换是微生物相互作用的重要驱动力,功能酶活力可以衡量氮代谢的强度,由此可见,窖泥位置对氮代谢酶的分布产生重要影响,并影响着氮代谢,该研究为解析微生物参与窖泥中的物质循环过程提供理论基础。

窖泥微生物多样性及窖泥评价与养护研究进展

全泥窖池固态发酵是浓香型与馥郁香型白酒的典型酿造工艺。窖泥作为窖池的功能载体,其微生物的丰度、多样性、代谢活性及相互间的作用关系直接影响白酒质量。本文从传统培养技术与非培养技术下的窖泥微生物研究方法、基于空间与时间维度下的窖泥微生物群落结构差异、窖泥功能菌株及其相互作用、窖泥质量评价方法构建与完善,以及以功能菌株为核心的窖泥养护与老熟等方面进行综述,总结不同技术方法在白酒微生物研究领域的发展沿革与应用现状,窖泥老熟过程中原核与真核微生物消长变化规律及窖池不同空间位置下原核与真核微生物分布的差异情况,己酸菌、丁酸菌、乳酸菌、醋酸菌和甲烷菌等窖泥核心功能微生物的作用与相互依存关系,窖泥老化原因,窖泥质量评价标准从传统感官和理化分析等单一维度向综合评判体系方法和评价机制构建与应用的转变,以及基于核心菌株的功能化属性所开展的养护与老熟研究,旨在为后续学者针对窖泥微生物多样性评估、菌群代谢功能研究及窖泥养护改良工艺研究等提供参考。

基于理化、风味物质和化学计量学的窖泥质量分级方法

窖泥质量的优劣与浓香型白酒的产量和品质密切相关,科学的窖泥质量分级方法可以为窖泥新窖配方优化和老窖养护提供理论依据。但目前窖泥质量标准仍以感官评价、理化指标和简单的微生物指标(细菌总数和芽孢杆菌数)为主,无法全面、客观地反映窖泥质量。该研究运用多种检测技术对不同质量等级窖泥理化指标及风味物质进行检测,基于偏最小二乘法(partial least squares,PLS)建立一种准确、可靠的窖泥分级方法。该研究采用理化分析、电感耦合等离子体质谱和GC-MS技术对以感官分析与对应酒质分级的不同质量等级窖泥为研究对象进行分析,采用PLS对检测结果进行分析,筛选出与窖泥质量等级相关的潜在标记物共27种,包括钠、水分、氨态氮、钾、钙、己酸、己酸乙酯、4-甲基苯酚等。采用训练集基于这27种潜在标记物建立窖泥等级快速预测模型,不同等级窖泥在PLS得分图中完全分开,利用训练集和验证集数据对模型进行验证,结果表明该模型稳定可靠,预测准确率较高。该方法在窖泥质量分级中具有较高的准确性,可用于窖泥等级分析预测。

Stenotrophomonas terrae应用于退化窖泥修复的初步研究

为修复退化窖泥,该研究将Stenotrophomonas terrae接种于退化窖泥,以正常窖泥及退化窖泥为对照,将不同窖泥进行模拟发酵实验,对发酵结束后的窖泥、糟醅、酒样理化指标及细菌菌群进行检测,并对不同窖泥样品细菌菌群进行主坐标分析(PCoA)及相关性网络分析。结果表明,与退化窖泥相比,修复后的窖泥pH、产酸能力、铵态氮含量、感官评分分别显著提升至4.82、185.83 mg/g、98.33mg/100 g、6.10分(P<0.05);对应糟醅的酸度显著降低至3.27(P<0.05),而水分及残余淀粉含量差异不显著(P>0.05);对应酒样总酯、己酸乙酯含量显著提升至1.00 g/L、0.56 g/L(P<0.05),总酸由0.49 g/L显著降低至0.27 g/L(P<0.05)。修复窖泥细菌菌群丰富度及多样性增加,基于属水平,乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度极显著降低(P<0.01),氢孢菌属(Hydrogenispora)、Clostridium_sensu_stricto_12、嗜碱菌属(Alkalibaculum)及产己酸菌属(Caproiciproducens)等功能微生物相对丰度极显著提高(P<0.01)。PCoA及相关性网络分析表明,退化窖泥接种Stenotrophomonas terrae后,可使其细菌菌群接近于正常窖泥,可增强窖泥细菌间的协同作用,提高微生物生态网络稳定性。

浓香型白酒窖泥微生物群落及其养护技术研究进展

窖泥作为酿造微生物的主要来源之一,对浓香型白酒风格的形成发挥着重要作用,若窖泥退化会直接影响浓香型白酒的产质量。该文综合阐述了窖泥微生物的群落结构差异和功能应用,概括了窖泥退化的原因及预防措施,总结了近年来养护窖泥技术的研究与应用,以期为窖泥功能微生物的利用及窖泥养护技术的应用提供参考。

窖泥微生物的分离、鉴定和己酸菌代谢产物的初步分析

该研究采用多种培养基富集方法和厌氧分离技术,从浓香型白酒窖泥中分离菌株,通过形态学观察、16S r RNA基因测序以及系统发育学分析确定其基本的分类信息,并通过气相色谱-质谱(GC-MS)及高效液相色谱(HPLC)法对颤螺旋菌科(Oscillospiraceae)己酸菌的代谢产物进行分析。结果表明,共分离得到63株细菌。基于16S r RNA基因序列可将全部菌株鉴定到属,分属于2纲3目8科15属,主要包括梭菌属(Clostridium)、植物乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)、Haloimpatiens、副梭菌属(Paraclostridium)、水原拉梅尔芽孢杆菌属(Rummeliibacillus)、产己酸菌属(Caproiciproducens)等。其中,有9株菌与近似菌的序列相似度较低(96.17%~97.70%),可能为潜在的新物种。3株颤螺旋菌科己酸菌均能利用RCM培养基发酵产乙酸、丁酸、己酸;其中Caproicibacterium sp. 20-5D、Caproiciproducens sp. CPB-2和Caproiciproducens sp. YR-4的己酸产量分别为3.84 g/L、1.03 g/L和0.35 g/L,具有较强的产混合酸能力。从浓香型白酒窖泥中获得的功能菌对丰富窖泥可培养微生物数量和功能微生物的应用与开发具有重要意义。

白酒人工窖泥培养方法研究进展

以浓香型为主的大曲白酒生产中窖泥起着重要的作用,窖泥的质量直接决定着酒体质量的优劣,人工老窖泥培养可以迅速提高酒体质量。该文综述了人工窖泥培养技术近几年来的研究进展,包括工艺流程,原辅料、营养盐等功能与作用,菌种来源及使用方法等,重点阐述了人工老窖泥的培养方法,包括不同地域窖泥物料种类、菌种及相关成分用量,培养时间及应用等,并对窖泥培养关键点进行了剖析,为白酒企业窖泥的科学培养方法、质量控制和提升提供技术参考和借鉴。