不同月龄波尔山羊睾丸中精原干细胞活性及增殖特征研究

[目的]探究不同月龄波尔山羊睾丸中精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)在体外培养过程中的活性及增殖特征。[方法]分别采集1、3、5、58月龄的波尔山羊睾丸,通过组织学方法分别观察不同月龄波尔山羊睾丸的发育情况;分别收集不同月龄波尔山羊睾丸组织,利用三步酶消化法分离成单细胞,通过台盼蓝染色观察睾丸消化细胞总数和死亡细胞数;采用0.2%明胶富集差速贴壁法纯化SSCs并培养10 d,通过流式细胞术鉴定细胞悬液纯化前、纯化后及培养10 d后的Thy-1阳性(Thy-1+)细胞数;将纯化的SSCs培养10 d后,采用碱性磷酸酶染色鉴定SSCs克隆,分别计算不同月龄波尔山羊睾丸SSCs形成的克隆数和克隆面积。[结果]睾丸组织学观察发现1月龄波尔山羊曲细精管管腔生殖细胞数量最少,随着波尔山羊月龄的增加,逐渐发育出各级生殖细胞,但58月龄波尔山羊睾丸生精上皮明显退化。不同月龄波尔山羊睾丸组织经过三步酶消化,在纯化前及纯化后获得的睾丸细胞总数以5月龄波尔山羊最高,显著(P<0.05)高于1月龄波尔山羊;不同月龄波尔山羊纯化前及纯化后的睾丸细胞存活率之间均无显著(P>0.05)差异。在纯化前、纯化后的睾丸组织细胞以及培养10 d的纯化SSCs中,Thy-1+细胞数占睾丸细胞总数的比例均以1月龄波尔山羊最高,显著(P<0.05)高于其他月龄波尔山羊。培养10 d后,不同月龄波尔山羊睾丸来源的SSCs克隆均表现为碱性磷酸酶阳性,1月龄波尔山羊睾丸SSCs形成的平均克隆数显著(P<0.05)高于其他月龄波尔山羊,不同月龄波尔山羊的SSCs平均克隆面积无显著(P>0.05)差异。[结论]5月龄波尔山羊睾丸中细胞总数最多,1月龄波尔山羊睾丸中细胞总数最少,但SSCs活性和增殖效率最高。

精原干细胞体外分离培养的研究进展

精原干细胞是雄性动物睾丸内能够增殖分化产生精子的生殖干细胞,具有传递遗传信息的能力。鉴于其独特的生物学特性,精原干细胞在构建转基因动物和制备多潜能干细胞等领域具有十分重要的作用。精原干细胞的获取有多种分离纯化方法,在体外培养前通常结合使用两种或两种以上的方法来富集高纯度的精原干细胞。目前,关于精原干细胞体外长期培养的研究已在多种家畜上取得了一定进展。文章综述了精原干细胞的生物学特性及其微环境、精原干细胞富集的主要方法和体外培养的多种条件,为建立完善的家畜精原干细胞体外长期培养体系提供参考。

腹腔注射白消安对精原干细胞代谢特征的影响

目的通过构建白消安处理的小鼠模型,探讨其对小鼠睾丸精原干细胞(SSCs)代谢的影响。方法采用8周龄C57BL/6J雄性小鼠,腹腔注射10 mg/kg白消安,于第0天、第5天和第10天取材,并通过免疫磁珠法分选出Thy1阳性细胞。随后对这些细胞进行了纯度鉴定和代谢组学分析。结果实验发现白消安处理能明显降低小鼠睾丸质量(P<0.05),并损伤睾丸的组织结构。基于主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)模型显示,处理0 d、5 d和10 d的样本组间存在显著的代谢差异。共筛选鉴定出89种差异代谢物,包括谷胱甘肽(GSH)、牛磺酸、精氨酸、必需氨基酸(EAAs)和不饱和脂肪酸(UFAs)等,其重要相关代谢途径涉及甘油磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等。结论白消安通过影响特定的代谢途径,产生明显的生殖毒性效应,导致小鼠睾丸质量下降和组织结构损伤。代谢组学分析其潜在的生殖毒性机制可能与脂质代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等代谢通路有关。

黄牛精原干细胞研究进展

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是一类原始精原细胞,具有自我更新以维持自身数量相对稳定和定向分化成精母细胞的能力。随着黄牛精原干细胞研究的深入与完善,目前在黄牛精原干细胞领域的研究和应用已经取得了显著的进展。本文系统阐述了黄牛精原干细胞的分离纯化、体外培养、移植鉴定和永生化细胞系培养等方面的基本状况,同时探讨了我国黄牛精原干细胞研究领域中目前存在的问题,分析了黄牛精原干细胞的应用前景。

利用精原干细胞法生产转基因动物的研究进展

综述了利用精原干细胞生产转基因动物的发展历程、方法以及最新研究进展.重点从精原干细胞移植法和曲细精管微注射法两个方面,系统分析了利用精原干细胞生产转基因动物的优缺点,以及当前存在的问题.

小鼠精原干细胞体外培养体系建立与功能鉴定

目的构建小鼠精原干细胞(SSCs)体外培养体系,并对培养的SSCs进行功能鉴定。方法采用两步酶法消化小鼠睾丸组织制备单细胞悬液,CD90、CD49f免疫磁珠分选SSCs,采用Sertoli细胞共培养方法体外培养SSCs,并将培养的SSCs移植到受体小鼠曲细精管,定期观察移植后SSCs在受体小鼠曲细精管增殖分化情况。结果本次研究培养的SSCs在体外大量增殖,SSCs标记物检测显示,CD90、CD49f未分化SSCs标记物表达阳性率均>99%,而CD117分化SSCs标记物表达阳性率<1%,SSCs转染GFP慢病毒后移植到受体小鼠曲细精管内可以广泛定植并增殖分化,移植后12w在受体小鼠曲细精管内可见GFP+精子细胞。结论本研究中建立的小鼠SSCs体外培养体系,不仅能够促进SSCs大量增殖,同时保持了其未分化SSCs干细胞特性。

Fertil Steril:精原干细胞库-Klinefelter综合症患者生殖保护的新思路

Klinefelter综合征（Klinefelter syndrome,KS）又称XXY,47XXY综合征,简称克氏综合症,是一系列由于男性有两条或两条以上X染色体所导致的疾病。临床主要表现为睾丸发育不良、无精症（约占95%）,部分伴有典型体貌特征（体形瘦高、体毛稀少、男乳女化）及阅读/语言障碍。在全球范围内,发病率约1/600;在男性无精症患者中,发生率约11%。

精原干细胞的体外培养及其潜在治疗应用价值

精原干细胞(SSCs)能够自我更新,产生大量分化的生殖细胞并在出生以后形成精子,将遗传信息传递给下一代。因为所有雌性生殖干细胞在出生前已停止增殖,所以SSCs是成年哺乳动物唯一的生殖干细胞。将有生育能力的雄性供体睾丸细胞移植到不育症雄性睾丸细胞中,不育症的雄性可以重新进行精子发生和恢复生育能力。这项移植技术已经用来研究SSCs的生物学特性。研究发现,精原干细胞可以在小鼠的曲细精管进行复制,然后迁移,精原干细胞所需自我更新的生长因子保存在哺乳动物中。因此相信该培养技术很快会被应用于人类的精原干细胞中。本文讨论了现有的和潜在的运用移植技术和体外培养精原干细胞的方法。由于辅助的生殖技术能使精子细胞进入卵母细胞使之受精,所以在体外培养分化精原干细胞使之成为成熟生殖细胞的技术,将会促使人的临床精原干细胞的应用得到长足发展。

精原干细胞的生命历程

精原干细胞是动物体内的一种成体干细胞,在睾丸微环境中可以像胚胎干细胞一样具有增殖、分化潜能。近年来借助于各种细胞学技术,人们对精原干细胞在不同睾丸微环境中的分化和发育状况进行了深入研究,睾丸内不同种类细胞间的相互作用以及特定微环境对干细胞转分化的影响,已成为本领域的热点核心内容。将从精原干细胞生命历程的角度讨论该过程中所取得的研究成果和存在的问题。

小鼠精原干细胞的形态结构及其细胞化学和免疫组化特性

应用光镜、电镜观察了 ７～８ ｄ 小鼠精原干细胞的形态结构特点；应用细胞化学、免疫组织化学方法研究了体外培养小鼠精原干细胞的细胞化学和免疫组织化学特性。结果显示，精原干细胞呈圆形，直径（９±１） μｍ ，核大，呈圆形或轻微卵圆形，胞质较少；核内常染色质占绝对优势，异染色质极少；胞质内核糖体、线粒体较丰富，其他细胞器不发达；精原干细胞 Ａ Ｋ Ｐ染色呈阳性或强阳性，胞质内脂滴很少或没有；精原干细胞表达特异的 ｃｋｉｔ 受体；体外培养的小鼠精原干细胞常呈不完全的胞质分裂，细胞间由细胞间桥相连而呈链状或团状的细胞群丛，细胞群常由偶数细胞组成。

枸杞多糖对精原干细胞体外增殖的影响

背景:精原干细胞移植对不育具有潜在的临床应用价值,体外建立精原干细胞的培养系统获得数量较多的精原干细胞,仍是目前研究中亟待解决的问题。目的:观察枸杞多糖对精原干细胞体外增殖的影响。方法:采用两步酶消化法获取出生4～6d雄性C57BL/6小鼠睾丸Sertoli细胞与精原干细胞,将精原干细胞接种在Sertoli细胞饲养层上,再加入枸杞多糖或联合细胞因子添加到细胞培养液中。1周后以流式细胞仪检测细胞周期及细胞活性率,并检测各组精原干细胞GFRa-1、Thy-1、c-kit的阳性率。结果与结论:单独加入枸杞多糖后精原干细胞数量明显增加,增殖明显,联合加入胶质细胞源性神经营养因子与白血病抑制因子精原干细胞增殖更加明显(P<0.05)。并发现体外培养1周后的精原干细胞仍保持其睾丸组织内的精原干细胞特征,大多仍维持在未分化状态。表明在枸杞多糖或枸杞多糖联合胶质细胞源性神经营养因子及白血病抑制因子作用下,可促进精原干细胞体外增殖。

以支持细胞为饲养层培养小鼠精原干细胞

为探索精原干细胞(Spermatogonialstemcells,SSCs)体外自增殖的条件以及SSCs体外快速扩增的方法,以6-8日龄昆明乳鼠为材料,分离小鼠睾丸细胞,采用Percoll梯度离心法富集SSCs;以经丝裂霉素C处理的Sertoli细胞作饲养层,以DMEM为基本培养基,加入5%胎牛血清和103u/ml的白血病抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor,LIF),体外培养SSCs;运用免疫荧光技术,以SSCs特异性表面分子Thy1为标志,对原代培养20d和传代培养14d的细胞进行鉴定。该培养体系下,SSCs贴壁时间为6h-9h,48h后可见细胞分裂,迅速增殖出现在接种12d以后。接种后第20d形成数十至上百个细胞的细胞团,细胞总数比接种时增加了45-245倍,100倍显微镜下观察可见,单位视野内细胞团数为26±4个。传代后细胞增殖较快。原代培养20d和传代培养14d的细胞均为Thy1阳性;而传代20d后,细胞周缘不整,有伪足出现,呈现出死亡迹象。该培养条比较适合SSCs短期快速增殖。

几种因素对培养小鼠精原干细胞的影响

探讨了小鼠胚胎成纤维细胞饲养层及干细胞因子 ( SCF)、白血病抑制因子 ( LIF)、碱性成纤维细胞生长因子 ( b FGF)等对体外培养小鼠精原干细胞的作用。结果显示 ,在饲养层上 ,精原干细胞贴壁时间缩至 8～1 2 h,饲养层具有促进其分裂增殖的作用 ;培养液中加入不同浓度的 SCF、LIF及 b FGF,可延长精原干细胞在体外的存活时间 ,其中加入 30μg/L SCF后 ,其体外存活时间与对照组相比差异显著 ( P <0 .0 5 )。

人精原干细胞特异性标志的初步筛选

目的:寻求可能用于人精原干细胞(SSC)分离和纯化的特异性表面标志。方法:通过免疫组化方法,应用造血干细胞(HSC)表面标志c-kit、Thy-1,人胚胎干细胞(ES)表面标志阶段特异性胚胎抗原SSEA-3、SSEA-4、碱性磷酸酶(ALP),原始生殖细胞(PGC)标志SSEA-1以及小鼠SSC表面标志α6和β1整合素对成人及胎儿睾丸SSC的特异性表达进行筛选和鉴定。结果:在成人睾丸组织中,α6整合素在生精小管生殖细胞表面存在较广泛而显著阳性表达,而β1整合素主要在生精小管基底部细胞存在显著阳性染色,Thy-1在成人睾丸生精小管基底部细胞可见散在阳性染色,少量间质细胞中亦可见阳性染色。上述3种抗原标志在成人生殖细胞表面的表达具有一定的特异性。在胎儿睾丸生精小管中,可见SSEA-1在生殖细胞表面存在显著阳性表达,具有明显特异性。结论:α6、β1整合素和Thy-1可作为阳性标志用于人SSC的分选。SSEA-1可作为识别胎儿SSC的特异性标志。

牛精原干细胞的分离和纯化及体外培养的一般特性

采用两步酶消化法制备5月龄的牛生殖细胞悬液，用Percoll不连续密度梯度法分离精原细胞，接种于含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基中，37℃，5%CO2饱和湿度培养，观察培养细胞的生长和形态变化。结果5月龄牛的曲细精管主要包含细胞为精原细胞、Sertoli细胞，每克睾丸实质收获生精上皮细胞总数平均为3．18×10^6个细胞，精原细胞纯化后纯度达69．27％，精原细胞主要分布于27％～35％的Percoll梯度中。牛精原干细胞体外培养6～7d后开始分裂，20d后精原干细胞形成小集落。结果表明用两步酶消化、Percoll不连续密度梯度法分离的精原细胞能满足体外培养的需要，可以存活并发生增殖。

环磷酰胺干扰精原干细胞功能的初步研究

目的:初步探讨环磷酰胺对精原干细胞分化功能的干扰作用。方法:根据W istar大鼠生精细胞发育不同阶段分为1、3、9周龄组,每组24只,随机均分为实验组和对照组,实验组腹腔内注射环磷酰胺100 mg/(kg.体重),对照组注射等量生理盐水,24 h后用原位缺口末端标记法检测生精细胞凋亡。另取仅有精原干细胞的1周龄W istar雄性大鼠60只,随机均分为实验组和对照组(给药方法同上),在给药后24 h、3周、9周分别用免疫组化法检测c-K it蛋白,流式细胞仪分析细胞周期。结果:环磷酰胺干预后,1周龄实验组与对照组大鼠生精细胞凋亡差异无显著性(P>0.05),其余各周龄组实验组生精细胞凋亡均显著增高(P<0.01)。1周龄实验组大鼠睾丸在环磷酰胺处理后不同时间点的细胞周期S期细胞比例、精原细胞c-K it蛋白表达水平均明显低于对照组(P<0.01)。结论:环磷酰胺诱导精原干细胞凋亡不明显,可能更重要的是干扰精原干细胞的增殖分化功能。

人精原干细胞的磁式分选和功能鉴定

目的 :目前对人睾丸内精原干细胞 (SSC)的生物学本质特性尚缺乏深入研究。本研究旨在寻求人SSC的特异性表面标志以及对其进行有效分选和功能鉴定的合理方法。 方法 :应用α6、β1 整合素、Thy 1 (CD90 )和c kit作为人SSC标志 ,利用免疫磁珠分选技术对成人睾丸单细胞悬液进行多参数复合分选 ,并利用流式细胞仪对分选后细胞的光散射特性和DNA倍体特性进行检测 ;将人分选后生殖细胞进行显微注射移植 ,观察人SSC在裸鼠睾丸内克隆形成的数量及其精子发生的可能性 ,对上述分选后人SSC进行功能性评价。 结果 :分选后α+ 6Thy 1 + c kit-和 β+ 1 Thy 1 + c kit-细胞均为大小、形态特征较为均一的细胞亚群 ,分别占分离细胞总数的 2 %～ 3%和 0 .5 %～ 1 %。其光散射特性分析显示均为明显低侧向散射特征。DNA倍体分析显示明显DNA倍体组成改变 ,合成期和四倍体细胞消失 ,仅有单倍体、二倍体和减数分裂期细胞 ,α+ 6Thy 1 + c kit-细胞群中 ,二倍体细胞数提高至该细胞群的5 1 .2 %。功能性评价结果表明 ,分选后α+ 6Thy 1 + c kit-细胞中干细胞浓度富积约 4 0倍 ,β+ 1 Thy 1 + c kit-细胞中干细胞浓度富积约 2 0倍。 结论 :α6,β1 整合素和Thy 1可作为阳性标志用于人SSC的分选。应用上述标志的复合免疫磁珠分?

体内精原干细胞转染法建立转基因小鼠

将人Bcl-2 cDNA与小鼠乳清酸蛋白(WAP)5’上游调控序列融合后,与脂质体按一定比例混合,再加入适量的台盼蓝制成转染液,注入到小鼠睾丸中的曲细精管中,转染精原干细胞以探讨建立转基因小鼠的可行性。共注射了3只公鼠,4天后将公鼠与发情母鼠合笼交配,共生仔鼠20只。检测结果表明,有3只呈PCR阳性,Southern blot检测,阳性鼠2只,1只公鼠,1只母鼠,其中,公鼠意外死亡;Western blot证实,1只母鼠的乳腺组织表达了Bcl-2蛋白,其F1代的16只小鼠中,有7只呈PCR阳性。证实了体内精原干细胞转染建立转基因动物的可行性。

温度对体外培养小鼠精原干细胞的影响

将分离纯化的小鼠精原干细胞分别置于 37、34、30℃及 5% CO2 、饱和湿度条件下进行体外培养。结果表明 ,3种温度下的精原干细胞均可以存活并增殖 ,但随着体外培养时间的延长 ,细胞的生长状态、增殖数量和存活时间有明显差异。34℃下细胞平均存活时间最长 ,增殖数量最多。统计分析显示 ,34℃与 30、37℃下细胞平均存活时间有显著差异 ( P<0 .0 5) ,表明

小鼠精原干细胞体外培养的一般特性

将分离纯化的 7～ 8d小鼠精原干细胞进行体外培养 ,结果显示 ,精原干细胞 2 4 h后可完全贴壁 ,贴壁后呈规则的圆形或卵圆形 ,直径 ( 1 1± 1 ) μm,以链、团状或散在方式贴附于混杂其中的睾丸体细胞层上 ;睾丸体细胞为多突起细胞 ,胞质形成 2～ 4个突起 ;体外培养 50～ 6 0 h后 ,精原干细胞开始分裂。上述结果表明 ,在本试验培养基所提供的体外环境中 ,精原干细胞能够存活一定时间并发生贴壁。