aprN的N端编码序列改造促进纳豆激酶的高效表达

为提高纳豆激酶的表达量,在不改变编码纳豆激酶的氨基酸序列前提下,将aprN基因的N端编码序列(N-terminal coding sequences,NCSs)进行同义突变,构建包含突变序列的pHY-P43质粒,经转化和测序分别构建4株突变菌株NK1、NK2、NK3和NK4,纤维蛋白板检测纳豆激酶活力,利用SDS-PAGE验证,通过响应面优化发酵条件。结果表明,NK1、NK2、NK3、NK4菌株纳豆激酶活力分别为94.8、101.9、124.2、69.4 IU/mL。其中NK3菌株的酶活力最高,较原始菌株提高了50%;NK4菌株酶活力最低仅为原始菌株酶活力的83%。SDS-PAGE显示重组酶生产纳豆激酶的分子质量约为28 kDa,与理论的分子质量27 kDa相符。通过响应面分析得出优化后重组菌株NK3产纳豆激酶的最佳条件为:初始pH 7.56、发酵温度35℃、发酵时间38 h。纳豆激酶酶活力138.1 IU/mL,较未优化前提高11.2%。该研究为提高纳豆激酶活力提供一种新的策略,且不改变纳豆激酶本身的性质。

纳豆激酶粗提物泡腾片的制备及其质量评价

为开发功能性纳豆激酶粗提物泡腾片,本研究以感官评价为考察指标,采用单因素和Box-Behnken响应面试验对纳豆激酶粗提物泡腾片制备工艺进行了优化。结果表明:纳豆激酶粗提物泡腾片的最佳制备工艺为崩解剂比例(酸源碱源)1.2∶1、崩解剂添加量70%、纳豆激酶粗提物添加量15%、麦芽糊精添加量10%、甜菊糖苷添加量0.9%、聚乙烯吡咯烷酮添加量2.5%,聚乙二醇8000添加量2.5%。在此条件下,所制泡腾片片剂表面光滑、口感良好、具有纳豆激酶粗提物独特气味,感官评价分为92.5±0.012,纳豆激酶活力为(298.20±1.15)U/g,所有质量指标均符合中国药典规定。

NSK-SD纳豆激酶在心血管疾病高危人群中应用疗效的临床研究

目的评估纳豆激酶在心血管疾病高危人群中应用疗效。方法纳豆激酶临床研究课题组选取2021年1月—2022年12月浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院收治的97例心血管高危患者为研究对象,在90 d的研究期间服用8000 FU/d纳豆激酶(NSK-SD),分别在基线、第30天和第90天进行采血,检测血脂、凝血四项、血小板聚集率和D-二聚体水平,在基线和第90天进行TCD检测和颈动脉彩超。结果97例患者全部完成了这项研究,依从性良好。服用纳豆激酶30 d后血浆黏度显著下降(P<0.05);服用纳豆激酶90 d,ADP血小板聚集率300 s、ADP血小板最大聚集率、D-二聚体、全血低切黏度(5/s)、全血黏度(50/s)和全血高切黏度(200/s)显著下降(P<0.05);此外,全血低切黏度1/s在服用30 d和90 d后均显著下降(P<0.05)。影像学检查显示,大脑血流速度和流速差异常患者改善率分别为71.4%和87.5%;颈动脉内斑块和中膜增厚的改善比例分别为46.7%和42.1%。结论纳豆激酶可以显著改善心血管疾病高危人群的ADP血小板聚集率300 s、ADP血小板最大聚集率和全血黏度,且疗效与治疗时间呈正相关。服用纳豆激酶90 d后的影像学检查发现患者的大脑供血得到明显改善,颈动脉粥样硬化进展也得到了明显的抑制。这表明纳豆激酶对心脑血管疾病的防治有较为显著的作用。

黑豆纳豆激酶粗提取物的免疫调节作用

以壶关大黑豆为原料发酵纳豆,分离得到黑豆纳豆激酶粗提取物(BNCE),对其结构进行初探,测定其酶活力和溶栓能力,并研究BNCE的免疫调节作用。通过红外光谱分析和扫描电镜对BNCE结构进行鉴定;分别使用纤维蛋白平板法和动物血块法测定BNCE的酶活及其对小鼠血块的体外溶栓作用;用MTT比色法探究BNCE对RAW264.7细胞增殖的影响;中性红染色法测定BNCE对RAW264.7细胞吞噬率的影响;ELISA法检测BNCE对RAW264.7细胞分泌IL-6、TNF-α和IL-1β的影响。结果表明,BNCE具有蛋白质的化学结构,表观呈现大小不同且无规则的碎片形状,具有一定的纤溶活性和体外溶栓作用。BNCE可以促进正常状态以及LPS激活状态下RAW264.7细胞的增殖,增强其吞噬率,并且有浓度依赖性。另外,BNCE还可以促进正常状态下的RAW264.7细胞TNF-α和IL-1β的分泌,抑制IL-6的分泌;也能抑制LPS激活状态下RAW264.7细胞IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌。因此,BNCE具有一定的免疫调节作用,在食品工业上可以作为保健食品的一种优质原料。

枯草芽孢杆菌产纳豆激酶的复合诱变选育及发酵条件优化

使用紫外线和离子束对枯草芽孢杆菌进行了诱变,比较并筛选出稳定的高产纳豆激酶菌株,并对突变优势菌株的发酵条件进行了优化,以进一步提高酶活。研究结果显示,最终获得了具有高酶活和较强稳定性的菌株B subtilis IB-2。离子束诱变菌株B subtilis IB-2酶活达到320 FU/mL,比初始菌株提高了19.4%。其最佳发酵工艺条件为:发酵时间33.5 h、接种量7.5%、种龄9 h、温度37℃、转速200 r/min,纳豆激酶酶活达到355.07 FU/mL,与预测值基本一致,纳豆激酶活力较优化前提高了10.2%。

纳豆芽孢杆菌Bacillus natto NK4液态发酵产纳豆激酶的工艺优化

为提高纳豆激酶的产量,采用单因素试验及正交试验对纳豆芽孢杆菌Bacillus natto NK4进行发酵条件优化,获得该菌种液体发酵产酶的最优条件。结果表明,纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶最佳的发酵条件为接种量2%,培养基初始pH值6.0,培养温度34℃,发酵时间72 h。此时,纳豆激酶酶活力由848.28 IU/mL提高到1569.31 IU/mL。

响应面法探究纳豆激酶活性保留条件及肠溶性胶囊的保护作用

采用纤维蛋白降解法测定活性,响应面法分析纳豆激酶在不同因素中活性变化,明确纳豆激酶最优活性保留条件。采用胃液-肠液串联式方法,比较普通纳豆激酶胶囊与肠溶性胶囊在人工胃肠液中的稳定性,为开发肠溶性纳豆激酶胶囊做理论支撑。结果表明纳豆激酶活性保留最优条件为:PH=8、转速为40 r/min、时间为1.3 h、温度为23℃。此时纳豆激酶活性保留为20291.7 FU/g。在人工胃液处理后,活性下降到30.9%。普通胶囊与肠溶性胶囊在人工胃肠液处理后活性分别为28.0%、53.1%。最终结论为纳豆激酶在酸性的胃液中极不稳定,活性丧失巨大。在人工肠液中酶较稳定。肠溶性胶囊与普通胶囊相比具有保护作用,将纳豆激酶制成肠溶性的产品服用,能使得纳豆激酶更加稳定、活性更高。

纳豆激酶研究进展

纳豆激酶(NK)主要是由枯草芽孢杆菌代谢产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶,具有很好的溶栓效应,有望成为新一代溶栓药物。首先从NK的基因组成及信号肽、前导肽和成熟肽的结构和功能等方面阐述了对NK的分子生物学研究。其次从酶的温度、pH、离子影响和最适底物类型等酶学性质对NK的特性进行了总结。再者对NK的三级结构及催化位点进行了分析,以位于活性中心的催化三联体(Asp32,His64,Ser221)为例探讨了NK与底物结合及催化的机制。再根据已有的文献报道,从NK的菌种改造、分离纯化及NK不同方式制备的剂型等方面介绍了国内外目前的研究现状。最后,在菌种改造和分离纯化等研究方向上对NK的未来研究进行了分析和展望,如可以使用基因编辑技术对菌种的代谢通路进行改造,达到提高产量的目的;采用分子印迹技术纯化NK。

纳豆激酶及其药理学研究进展

纳豆激酶是一种源自日本传统发酵食品纳豆的丝氨酸蛋白酶,具有多种生物学活性和药理作用。因其具有强大的溶解血栓的能力,受到广大研究者的关注,有望成为新一代溶栓药物。本文首先介绍了纳豆激酶的来源、提取方法和生物学活性,包括其对特定蛋白质的分解能力和在生物体内发挥的溶栓作用。接着,文章详细讨论了纳豆激酶的多种药理作用,包括其在溶栓、抗炎、神经保护、抗动脉粥样硬化以及改善视网膜健康等方面的潜在应用。此外,文章还展望了纳豆激酶未来的研究方向,强调了继续探索和优化提取纯化方法的重要性,并指出深入了解其分子作用机制对于开发更有效的治疗策略至关重要。

纳豆激酶酶原基因和纳豆激酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的:构建可高效生产有活性的纳豆激酶的大肠杆菌工程菌。方法:将纳豆激酶酶原(pro-nattokinase,pro-NK)基因和纳豆激酶(natokinase,NK)基因,并分别克隆到表达融合蛋白的高效表达载体pJN上,构建出表达质粒pJNK1和pJNK2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。结果:IPTG诱导下,两个融合蛋白的表达量均达到30%。活性检测显示表达纳豆激酶酶原融合蛋白的菌株pJNK-1(BL)诱导后菌体破碎上清的溶栓活性比表达纳豆激酶融合蛋白的菌株pJNK-2(BL)高2-3倍。结论:纳豆激酶酶原融合蛋白部分自减切产生纳豆激酶成熟肽。

纳豆枯草杆菌的筛选和纳豆激酶发酵条件优化

纳豆激酶是由纳豆枯草杆菌产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶。针对目前常用菌株的产酶活力较低、不能完全满足要求的问题,采用酪蛋白平板初筛—摇瓶复筛的筛选策略,从纳豆中筛选获得了一株高产纳豆激酶的菌株,该菌株在筛选培养基上进行摇瓶培养,发酵液中纳豆激酶的酶活达到970IU/mL.用Plackett Burman方法对影响液体发酵的各因素的效应进行了评价,并筛选出了有显著效应的四个主要因素:胰蛋白胨浓度、种龄、发酵温度和Na2HPO4浓度;在此基础上,用最陡爬坡路径逼近最大产酶条件区域;最后通过中心组合实验及响应面分析优化了纳豆枯草杆菌液体发酵的条件.通过在初始发酵条件和优化发酵条件下的对比研究,液体发酵液中纳豆激酶浓度从1005IU/mL提高到1314IU/mL,表明响应面法优化可成功地用于纳豆枯草杆菌液体发酵的条件优化.

纳豆激酶基因的克隆与表达

利用ＰＣＲ方法从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组ＤＮＡ 中扩增得到了纳豆激酶基因，并测定其核苷酸序列．利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体，并在大肠杆菌中进行了表达．ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳表明，表达蛋白占菌体蛋白的１５．２％ ，琼脂糖－纤维蛋白平板法测出表达产物具有溶解血栓活性．

纳豆激酶粗制液对家兔溶血栓作用及其机制研究

目的 : 观察纳豆激酶粗酶液体外、体内溶解血栓的作用。方法 : 2 0 % Fe Cl3制造兔颈动脉血栓模型 ;1 8只日本大耳兔 ,随机分为 3组 ,即十二指肠肠腔注射纳豆激酶 (Nattokinase,NK)高、低剂量实验组 (分别 45 0 0 U/ kg、2 5 0 0 U/ kg)、生理盐水模型对照组。结果 : 体外试验表明 ,纳豆菌株 B.N.1 2液体发酵粗酶液作用血凝块 1 0 h、2 2 h后 ,溶解率分别为 78.2 3 %、98.1 6% ,对照组分别为 2 1 .43 %、2 3 .91 % (P<0 .0 5 ,P<0 .0 1 ) ;动物试验表明 ,与对照组相比 ,NK高剂量组注射 1 .0 h、1 .5 h后 ,凝血时间 (coagulation time,CT) (P<0 .0 5 )、凝血酶原时间 (prothrombintime,PT) (P<0 .0 5 )、凝血酶时间 (thrombin time,TT) (P<0 .0 1 )和活化的部分凝血活酶时间(activiated partial thrombopastin time,APTT) (P<0 .0 5 )均显著延长 ,注射 2 h后优球蛋白溶解时间 (euglobulinlysis time,ELT)和纤维蛋白原 (fibrinogen,FIG)含量显著降低 (P<0 .0 1、P<0 .0 5 ) ,纤维蛋白降解产物 (fibrinogen degradation products,FDP)含量明显增高 (P<0 .0 5 ) ,血浆D-二聚体 (D-dimer)呈阳性 ,病理组织切片表明肺静脉、肾小球毛细血管中无明显血栓 ,只有少量红细胞聚积 ;低剂量组 CT、PT和

纳豆菌液体发酵生产纳豆激酶的研究

以纳豆菌BacillusnattostrainB -2 0 2 3为出发菌株 ,对其液体发酵生产纳豆激酶进行了研究。实验考察了氮源、碳源、离子组成、表面活性剂、发酵温度和初始pH值对纳豆菌产酶的影响。在优化发酵条件基础上 ,发酵 72h后通过纤维平板测活 ,其产酶量相当于 786尿激酶IU/ml。

纳豆中纳豆枯草杆菌的筛选和纳豆激酶的分离过程研究

采用酪蛋白平板初筛-摇瓶复筛的筛选策略,从日本传统食品纳豆中筛选获得了一株高产纳豆激酶的纳豆枯草菌菌株,与国内公开报道的不同菌株相比,有更好的产酶能力。菌株经过液体发酵后获得含酶发酵液,采用硫酸铵盐析及SephadexG-75凝胶层析、SepharoseCMFastFlow离子交换层析对纳豆激酶进行了分离纯化,两步层析的纯化倍数和酶活回收率分别达到4.75、74.3%和1.32、77%,获得了纯度很高的纳豆激酶。

纳豆激酶纤溶功能及其机理研究

以 2 0 %FeCl3制造兔颈动脉血栓模型 ,并将 18只日本大耳兔 ,随机分为 3组 ,即十二指肠注射NK高、低剂量实验组 (分别为 45 0 0UI/kg、2 5 0 0UI/kg)、生理盐水模型对照组。观察纳豆激酶粗酶液体外、体内溶解血栓的作用。体外试验表明 ,B N 12液体发酵粗酶液作用血凝块 10、2 2h后 ,溶解率分别为 78 2 3%、98 16% ,对照组分别为 2 1 43%、2 3 91% (P<0 0 5 ,P <0 0 1) ;动物试验表明 ,NK高剂量组给药 1、1 5h后 ,CT (P <0 0 5 )、PT (P <0 0 5 )、TT (P <0 0 1)和APTT (P <0 0 5 )均显著延长 ,给药 2h后ELT和Fig含量显著降低(P <0 0 1、P <0 0 5 ) ,FDP含量明显增高 (P <0 0 5 ) ,血浆D dimer呈阳性 ;低剂量组CT、PT和APTT各指标及Fig含量无显著变化 ,但ELT明显缩短 (P <0 0 5 ) ,FDP含量、TT值显著增高 (P <0 0 5 ) ,且血浆D dimer呈阳性。纳豆激酶在体内和体外均具有明显的溶栓效果 ,提高纤溶活性、增强抗凝作用是其溶栓机理之一。

纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

构建pPICZαA-NK重组质粒,并转化入E-coli TOP-10中,得到转纳豆激酶基因工程菌,提取重组质粒经单酶切、双酶切、PCR分析及序列测定,证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因.将重组质粒pPICZαA-NK线性化后,分别转化毕赤酵母GS115与KM71,在含ZeocinTM的选择性YEPD平板筛选到重组酵母.经检测重组酵母发酵上清液中具纳豆激酶溶纤活性,SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10％左右.

豆豉中纳豆杆菌的筛选和纳豆激酶的初步分离

利用改良的培养基 纤维蛋白平板法 ,从我国传统食品豆豉中筛选出具有高纤溶活性的纳豆杆菌菌株 ;菌株液体发酵法制得粗酶液 ,采用沉淀法及柱层析等方法从发酵液中初步分离纳豆激酶 ;并应用体外溶栓实验考察分析了纳豆激酶的纤溶活性 。

纳豆激酶溶解血栓机制

根据已有文献报道 ,综述了关于纳豆激酶溶栓机制的研究进展 ,将纳豆激酶的溶栓机制归纳为以下四点 :直接溶栓作用 ;刺激血管内皮细胞产生内源t PA ;激活体内尿激酶原转变为尿激酶 ;通过降解和失活纤溶酶原激活剂的抑制剂 (PAI 1 )

响应面法优化纳豆激酶液体发酵

用响应面法对Bacillussubtilis液体发酵生产纳豆激酶的培养条件进行了优化。首先用Plackett Burman方法对相关影响因素的效应进行评价并筛选出了有显著正效应的胰蛋白胨和有显著负效应的种龄、发酵温度和Na2 HPO4浓度等 4个因素 ,其他因素对纳豆激酶产量无显著影响。第 2步用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域。最后由中心组合实验及响应面分析确定了主要影响因素的最佳条件。在优化培养条件下 ,液体发酵液中纳豆激酶浓度从10 0 5 73IU/mL提高到 13 14 48IU/mL。