过表达PAX6抑制肝癌细胞生长和促进自然杀伤细胞杀伤能力的机制

目的:配对盒基因6(paired box gene 6,PAX6)主要在胚胎发育中发挥调控作用,其异常表达与多种肿瘤的发生、发展有关,在不同肿瘤中可发挥促癌或抑癌的作用。本研究旨在观察过表达PAX6对肝癌细胞生长及自然杀伤(natural killer,NK)细胞对肝癌细胞杀伤能力的影响及其分子机制。方法:采用ELISA技术检测68例肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者和10例健康人外周血的PAX6、可溶性主要组织相容性复合体I类样蛋白A(soluble major histocompatibility complex class I-like protein A,sMICA)和可溶性UL16结合蛋白2(soluble UL16 binding protein 2,sULBP2)的表达水平;体外培养肝癌细胞HepG2和LM3及人正常肝细胞LO2,将PAX6过表达质粒(PAX6-OE)和空载体(NC)转入HepG2和LM3细胞中构建稳定细胞株,分别采用real-time PCR、蛋白质印迹法、免疫荧光等方法检测HepG2和LM3细胞中PAX6的表达水平;在HepG2和LM3细胞中过表达PAX6,采用CCK-8法和细胞划痕实验检测细胞生长和迁移能力,ELISA法检测其上清液中sMICA和sULBP2的分泌水平,蛋白质印迹法检测基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)、去整合素样金属蛋白酶10(disintegrin and metalloproteinase 10,ADAM10)的蛋白质表达水平;采用流式细胞术检测NK细胞对2种肝癌细胞的杀伤能力。结果:与健康人相比较,HCC患者血清中PAX6表达水平显著降低(P=0.002),而sMICA和sULBP2的表达水平显著增高(P=0.004和P<0.001)。Real-time PCR、蛋白质印迹法结果显示:与正常肝细胞LO2相比,HepG2和LM3细胞PAX6的mRNA和蛋白质表达水平均显著降低(均P<0.05)。免疫荧光结果亦可见肝癌细胞HepG2和LM3中PAX6的表达均低于正常肝细胞LO2。与NC组比较,PAX6-OE组肝癌细胞HepG2和LM3的增殖及迁移能力下降(均P<0.05);PAX6-OE组的HepG2和LM3细胞中MMP2、MMP9、ADAM10的蛋白质表达水平均显著降低(均P<0.05),且PAX6-OE组的HepG2和LM3细胞上清液中sMICA和sULBP2的分泌水平均显著低于NC组(均P<0.05)。流式细胞术显示:与NC组比较,PAX6-OE组NK细胞对HepG2和LM3细胞的杀伤率显著增高(均P<0.05)。结论:PAX6在HCC患者血清及肝癌细胞系中表达降低,过表达PAX6可抑制肝癌细胞生长,增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤效率,其机制与PAX6抑制金属蛋白酶的表达、降低sMICA和sULBP2的分泌水平有关。

肺鳞状细胞癌中解聚素-金属蛋白酶17下调对自然杀伤细胞杀伤作用的影响

目的:探讨肺鳞状细胞癌中解聚素-金属蛋白酶17(Human A disintegrin and metalloprotease 17,ADAM17)下调对自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)杀伤作用的影响。方法:体外培养人NCI-H520细胞株,分为正常对照组(未转染)、阴性对照组(转染nonsense siRNA)和ADAM17下调组(转染ADAM17 siRNA)。qRT-PCR和Western blotting检测各组细胞ADAM17 mRNA和蛋白表达。制备NK细胞,加入各组NCI-H520细胞中,Western blotting检测各组细胞γ干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)、颗粒酶B(Granzyme B,GraB)、穿孔素(Pore-forming protein,PFP)蛋白表达。结果:与正常对照组相比,阴性对照组ADAM17 mRNA和蛋白表达无明显差异,ADAM17下调组ADAM17 mRNA和蛋白表达减少(P<0.01);与正常对照组相比,阴性对照组NCI-H520细胞生存率无明显差异,ADAM17下调组NCI-H520细胞生存率降低(P<0.01);与正常对照组相比,阴性对照组IFN-γ、GraB、PFP蛋白表达均无明显差异,ADAM17下调组IFN-γ、GraB、PFP蛋白表达上调(P<0.01)。结论:肺鳞状细胞癌NCI-H520细胞中ADAM17下调能增强NK细胞的杀伤作用。

miR-124靶向调控CMTM6增强CIK对胶质瘤细胞杀伤效应机制研究

目的研究细胞因子诱导杀伤(cytokine induced killer,CIK)细胞对胶质瘤细胞杀伤效应的影响以及微小核糖核酸(miRNA,miR)-124在此过程中的调节作用及可能机制。方法收集2017年3月~2019年10月鄂州市中心医院神经外科收治的30例脑胶质瘤患者的癌组织及癌旁组织标本,通过qRT-PCR法检测脑胶质瘤及癌旁组织中miR-124,含MARVEL跨膜结构域的趋化素样因子家族基因6(chemokine-like factor-like MARVEL transmembrane domaincontaining family member 6,CMTM6)mRNA表达量及相关性。诱导培养CIK细胞后,分别与胶质瘤细胞C6和U87共培养,另转染miR-124 mimic,inhibitor及阴性对照序列,通过CCK-8实验检测CIK细胞及转染对胶质瘤细胞的杀伤效应;双荧光素酶报告实验分析miR-124与CMTM6基因的靶向关系,qRT-PCR和Western blot检测胶质瘤细胞中mi R-124,CMTM6 mRNA及蛋白表达。结果与癌旁组织比较,脑胶质瘤组织中miR-124表达(0.325±0.031 vs1.004±0.086)显著降低,CMTM6 mRNA表达(3.167±0.324 vs 0.981±0.089)显著升高,差异有统计学意义(t=39.051,26.337,均P<0.001),二者呈负相关(r^(2)=0.262)。与转染阴性对照比较,miR-124 mimic转染及其与CIK细胞共培养对C6(72.84%±3.81%vs 99.67%±3.45%,51.46%±3.18%vs 74.59%±3.47%),U87细胞(71.93%±3.94%vs98.26%±3.59%,52.67%±3.24%vs 76.28%±3.64%)增殖均有显著抑制作用,差异有统计学意义(q=16.340,15.486,14.087,13.886,均P<0.001)。双荧光素酶报告实验显示,miR-124和CMTM6具有明显的靶向关系。Western blot结果显示,与转染阴性对照+CIK组比较miR-124 mimic与CIK细胞共培养的C6,U87细胞CMTM6蛋白表达(0.435±0.042vs 0.897±0.061,0.354±0.029 vs 0.725±0.068)显著降低,转染miR-124 inhibitor与CIK细胞共培养的C6,U87细胞CMTM6蛋白表达(1.142±0.121 vs 0.897±0.061,1.326±0.125 vs 0.725±0.068)显著增加,差异均有统计学意义(q=13.817,10.839,7.327,17.558,均P<0.001)。结论CIK细胞可有效杀伤胶质瘤细胞,miR-124可通过靶向抑制CMTM6增强CIK细胞对胶质瘤细胞的杀伤效应。

急性淋巴细胞白血病患者外周血中KIR2DL4的表达及其对NK细胞杀伤功能的影响

目的:探究杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL4(killer cell Ig-like receptor 2DL4,KIR2DL4)在急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患者外周血中的表达,及其对自然杀伤细胞(nature killer,NK)杀伤功能的影响。方法:从ALL患者及健康志愿者的外周血中分离出单个核细胞,采用实时荧光定量PCR检测单个核细胞中KIR2DL4的表达差异;从单个核细胞中分选NK细胞,通过流式细胞仪检测CD3-CD56+标记的NK细胞比例,并分析NK细胞表面KIR2DL4与Molt-4细胞表面人白细胞抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G)的表达水平。分别以NK细胞、KIR2DL4阻断抗体作用的NK细胞、IgG1抗体作用的NK细胞作效应细胞,Molt-4细胞为靶细胞,在不同效靶比(5:1、10:1、20:1)下,利用ELISA检测细胞上清液中干扰素(interferon-gamma,IFN-γ)与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放法检测不同处理的NK细胞对Molt-4细胞的杀伤作用;并在20∶1的效靶比下,通过激光共聚焦显微镜观察各处理下Molt-4细胞形态学改变,流式细胞术检测不同处理的NK细胞脱颗粒情况。结果:ALL患者外周血中KIR2DL4 mRNA相对表达量显著高于健康志愿者(P<0.05);分选后CD3-CD56+标记的NK细胞纯度达到90%以上;与NK细胞和Molt-4细胞共培养相比,阻断KIR2DL4能够提高细胞上清液中NK细胞分泌因子IFN-γ与TNF-α水平(P<0.05),提高NK细胞对Molt-4细胞的杀伤率(P<0.05),使Molt-4细胞形变与核固缩更明显,并提高NK细胞中CD107α表达水平(P<0.05)。结论:KIR2DL4在ALL患者外周血中高表达,而阻断KIR2DL4能够促进NK细胞分泌IFN-γ、TNF-α及脱颗粒,提高其对Molt-4细胞的杀伤功能。

三氧化二砷对胃癌细胞杀伤作用的初步研究

三氧化二砷对胃癌细胞杀伤作用的初步研究顾琴龙１纪玉宝１陈雪华１沈佰华２朱正纲１尹浩然１林言箴关键词三氧化二砷胃癌细胞作者单位：１．上海第二医科大学附属瑞金医院外科（上海２０００２５）２．上海市免疫研究所近几年来，继全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）诱导分化治疗...

川芎嗪及联用化疗药物对胃癌细胞杀伤作用的研究

川芎嗪是从中药川芎中提取的生物碱———四甲基吡嗪（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ，ＴＭＰ），它具有降压、扩张血管、溶栓作用而广泛用于心脑血管病变。近年发现川芎嗪具有钙离子阻滞作用，而钙离子阻滞剂多有化疗增敏，逆转肿瘤细胞多药耐药作用。基于此我...

胃癌细胞树突状细胞融合疫苗肿瘤细胞杀伤活性研究

目的对胃癌细胞树突状细胞(dendtiticcells,DCs)融合疫苗激活杀伤性T淋巴细胞体内外肿瘤细胞杀伤活性进行研究,为胃癌DC疫苗免疫治疗提供实验依据。方法胃癌患者外周血单个核细胞经GMCSF,IL4,TNFα定向诱导获取DC。DC与SGC7901胃癌细胞经PEG诱导融合、HAT/HT筛选培养获得纯净融合细胞。MTT比色法检测融合疫苗体外杀伤胃癌细胞的细胞毒作用。观察融合疫苗对胃癌裸鼠种植瘤模型肿瘤生长的影响,流式细胞术AnnexinV/PI双标法检测瘤细胞凋亡,观察融合疫苗对肿瘤组织病理学改变的影响。结果①胃癌患者外周血单个核细胞体外定向诱导分化,可获得具备典型形态特征及表型的DC。②DC与SGC7901细胞经PEG诱导融合,HAT/HT筛选培养,可获得纯净融合细胞。③体外MTT比色检测,融合疫苗胃癌细胞杀伤率为(81.47±5.25)%,与混合培养DC组(70.53±2.46)%差异显著(P<0.05),与单纯T细胞组(21.67±2.55)%差异非常显著(P<0.01)。④融合疫苗组荷瘤裸鼠终末肿瘤体积平均(1.298±0.021)cm3,与对照组差异非常显著(P<0.01),抑瘤率为57.8%。⑤融合疫苗组肿瘤细胞凋亡率(54.9±1.38)%,坏死率为(21.04±1.47)%;与对照组瘤细胞凋亡百分率(20.02±0.39)%,坏死百分率(1.23±0.03)%比较差异非常显著(P<0.01)。⑥融合疫苗组肿瘤组织与对照组比较显著出血、坏死,瘤组织内大量淋巴细胞浸润。结论融合细胞疫苗激活T淋巴细胞体内外均可诱导显著胃癌细胞杀伤细胞毒活性;其应用于荷瘤动物体内,可以明显减慢肿瘤生长速度,诱导更多肿瘤细胞凋亡。

MTT法检测鸡脾脏和外周血NK细胞杀伤活性的条件优化

选取不同日龄的SPF鸡和肉鸡，用贴壁法从血液和脾脏分离出NK细胞作为效应细胞，选择瘤细胞MDCCMSB1和MDCC-MSBCU147分别作为靶细胞，二者按比例混合，孵育，利用MTT法检测靶细胞的活力反映效应细胞对靶细胞的杀伤活性，并对效靶比、作用时间进行比较。结果显示，MSB-1和CU147均可作为NK细胞良好的靶细胞，但CU147更稳定；效靶比为20：1-50：1，作用时间8-16h杀伤效果稳定；50％DMF20％SDS混合物作为裂解液能够对结晶彻底溶解，优于其他溶解试剂。

慢病毒携带的双自杀基因对淋巴瘤细胞杀伤作用的实验研究

背景与目的:慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫原性低等优点,适于体内基因治疗。本研究探讨慢病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞Raji的杀伤作用。方法:将表达慢病毒的3种质粒,即包装结构基因质粒pCMVΔ8.2、包膜基因质粒pCMV.VSVG、目的基因质粒pHR'CS.GFP或pHR'CS.CDglytk分两组(pHR'CS.Cdglytk为实验组、pHR'CS.GFP为对照组),经脂质体导入病毒包装细胞293T,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩后转染Raji细胞,用荧光显微镜及RT-PCR检测基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或无环鸟苷(GCV),用MTT法测定Raji细胞的生长抑制率,检测CD和HSV-tk双自杀基因对Raji细胞的作用。结果:表达慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞。荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光,透射电镜下观察可见富集的病毒颗粒。慢病毒介导的双自杀基因在Raji细胞中高效、稳定表达。单独使用GCV或5-FC对细胞的生长抑制率分别为51%、50%,与未转染组Raji细胞比较,差异有显著性(P<0.01);联合使用5-FC和GCV对细胞的生长抑制率为73%,明显高于单独使用5-FC或GCV(P<0.01)。结论:慢病毒介导的双自杀基因可高效稳定转染淋巴瘤细胞;双自杀基因系统较单一自杀基因系统(CD/5-FC或HSVtk/GCV)对淋巴瘤细?

6B11抗独特型微抗体负载树突状细胞对卵巢癌细胞系细胞杀伤作用的体外研究

目的 用 6B1 1抗独特型微抗体体外负载树突状细胞 (DC) ,以期诱导出抗原特异性的抗肿瘤免疫反应。方法 分离培养HLA -A2 +健康人外周血树突状细胞 ,培养过程中用 6B1 1微抗体负载 ,无关抗原F (ab)’2负载及未负载组为对照。光镜、电镜下观察树突的形态 ;流式细胞仪检测DC表面分子表达 ;3 H -TdR掺入法测DC刺激自体T细胞增殖 ;51 Cr 6h释放试验测激活的T细胞对卵巢癌细胞系的杀伤。结果 培养的树突细胞有典型形态 ,CD80、CD86、HLA -DR等表面分子呈高表达 (分别为 6 5 %、 86 2 %、 93 7% ) ;6B1 1微抗体负载的DC不仅能刺激自体T细胞的增殖 ,而且其诱导的CTL细胞对HLA -A2 +、OC1 6 6 - 9+卵巢癌细胞系HOC1A有特异性的杀伤 ,结论 6B1 1抗独特型微抗体模拟卵巢癌抗原OC1 6 6 - 9负载树突状细胞在体外可以诱导出抗原特异性的细胞毒T细胞 ,为进一步研究 6B1

HSV-tk/GCV自杀基因系统对喉癌细胞杀伤作用的体外研究

目的 研究逆转录病毒介导的HSV tk/GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤作用。方法 构建携带HSV tk基因的逆转录病毒载体 ,并以该重组逆转录病毒感染人喉癌细胞Hep 2。以G4 18筛选的抗性克隆 (命名为Hep 2 /tk) ,用MTT比色法观察GCV在体外对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。结果 Hep 2 /tk细胞与未转染tk基因的Hep 2 /0、Hep 2细胞相比较 ,三者的生长速度无明显差别。Hep 2 /tk细胞对GCV高度敏感 ,即低浓度GCV(0～ 1mg/L)处理Hep 2 /tk细胞 7d,可将其大部分细胞杀死 ,增加GCV的浓度 (>1mg/L)不能显著增强其对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。 结论 人喉癌细胞Hep 2对HSV tk/GCV系统高度敏感 。

NDV对体外培养的肿瘤细胞杀伤性研究

目的：探讨ＮＤＶ病毒体外对肿瘤细胞的杀伤性。方法：人的ＳＧＣ－９７０１和ＳＭＭＣ－７７２１肿瘤细胞为靶细胞，观察了ＮＤＶ对其直接杀伤作用。结果：ＮＤＶ病毒能作用于瘤细胞，并最终使肿瘤细胞死亡。结论：ＮＤＶ病毒是一种有效的肿瘤细胞溶解剂，在体外具有明显的直接杀伤瘤细胞作用。

4种因素对NK细胞杀伤活性的影响

为了探讨效应细胞与靶细胞的比例(效靶比)、孵育时间、显色时间以及小牛血清浓度对NK细胞杀伤活性的影响,采用乳酸脱氢酶释放法来测定不同因素对NK细胞杀伤活性的影响,结果表明,最佳效靶比和孵育时间分别为50∶1和2 h。在最优效靶比及孵育时间的基础上,显色0.5 h,小牛血清浓度为50 mL/L时NK细胞活性最高,证明4种因素对NK细胞杀伤活性均有不同程序的影响。

肺癌患者肺泡巨噬细胞细胞因子及其细胞杀伤活性的研究

目的:了解肺癌患者肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophage,AM)产生细胞因子的情况及其细胞因子的细胞杀伤活性,同时观察γ干扰素(γinterferon,γ-INF)和脂多糖(lipoplysaccharide,LPS)对AM活性的影响。方法:经肺泡灌洗获AM,分离,γ-INF和/或LPS刺激培养,分别检测AM产生NO、IL-1和TNF-α的量以及其细胞杀伤活性。结果:肺癌患者的部分AM,即使未经刺激,亦分泌细胞因子并具有细胞杀伤活性;经γ-INF和LPS刺激后,两者均使AM分泌细胞因子增多和增强其细胞杀伤活性,且联合刺激较单独刺激对AM的作用影响大。结论:肺癌患者临近肿瘤组织的部分AM活性增强;γ-INF和LPS能刺激AM产生细胞因子并提高其细胞杀伤活性,且两者具有协同作用。

陡脉冲电场对荷瘤BALB/c小鼠癌细胞杀伤效应的实验研究

观测陡脉冲电场对荷瘤BALB/c小鼠癌细胞的杀伤效应。处理后的癌细胞在光镜下表现为细胞核固缩、核碎裂、核溶解;在电镜下表现为异染色质增加,边集,呈团块样改变,细胞质肿胀,脂滴数量增加,质膜破裂;核固缩,碎裂,线粒体肿胀。实验揭示了陡脉冲电场能有效地杀伤癌细胞,明显抑制了荷瘤小鼠恶性肿瘤的生长、增殖,有着良好的应用前景。

肿瘤细胞不同程度表达HLA-G对NK细胞杀伤活性影响研究

目的探讨肿瘤细胞不同程度表达HLA-G对NK细胞杀伤活性的影响。方法基因克隆建立稳定表达HLA-G抗原的肿瘤细胞株,以及通过基于CD107a标记的流式细胞术检测肿瘤细胞表达HLA-G前后对NK细胞杀伤功能的影响。结果HLA-G抗原在细胞表面获得不同程度的表达且能显著抑制NK对肿瘤细胞的杀伤活性(P<0.05)。HLA-G特异性抗体87G阻断或其受体KIR2DL4特异性抗体#33阻断后,均能明显恢复NK细胞对转染HLA-G肿瘤细胞的杀伤功能。结论肿瘤细胞HLA-G表达量不同,均能抑制NK细胞的杀伤活性,提示HLA-G分子表达在恶性肿瘤细胞的免疫逃逸中起重要作用。

MTT法在抗肿瘤药物对细胞杀伤力测定中的应用

通过MTT法对不同浓度抗肿瘤药物对肿瘤细胞杀伤力的影响的研究,建立了MTT法测不同浓度抗肿瘤药物对细胞杀伤程度的方法,此方法在新抗肿瘤药物的研究和开发中将有很重要的应用价值,同时为基因芯片对中药有效成分的筛选打下了良好的基础.

半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒体对外肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的研究半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒在体外对人肝癌细胞系HepG2的杀伤作用。方法应用电镜下的形态学观察,DNA电泳以及MTT法检测杀瘤活性。结果形态出现明显改变,电镜证实出现细胞凋亡;白蛋白磁性阿霉素纳米粒联合磁场(MADM-NP+M)组和半乳糖化白蛋白阿霉素纳米粒(Gal-ADM-NP)组抑制率及半数抑制率剂量相似(P>0.05),半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒(Gal-MADM-NP+M)组抑制率明显提高,半数抑制剂量明显降低(P<0.01)。结论实验结果表明,白蛋白磁性阿霉素纳米粒联合磁场、半乳糖化白蛋白阿霉素纳米粒、半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒都具有明显抑制体外培养肝癌细胞生长增殖的作用。半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒对人肝癌细胞杀伤作用较白蛋白磁性阿霉素纳米粒及半乳糖化白蛋白阿霉素纳米粒组为强,作用机制可能与半乳糖配体的特异性介导和人肝癌细胞上半乳糖受体的识别内吞作用及联合外磁场有关。