合并SMARCA4缺失突变胸部肿瘤治疗的研究进展

交配型转换/蔗糖不发酵相关、基质相关、依赖细胞骨架调节剂的染色质亚家族A成员4(SMARCA4)基因位于染色体19q13,其编码的蛋白是腺苷三磷酸依赖的染色质重构复合物交配型转换(SWI)/蔗糖不发酵(SNF)的一部分。合并SMARCA4缺失突变的胸部肿瘤是近几年提出的一种起源于肺组织的恶性胸部肿瘤,占肺部恶性肿瘤的5%~8%,具有男性多发、吸烟相关、进展速度快、预后差等特点。对于晚期合并SMARCA4缺失突变的胸部肿瘤患者,虽然药物治疗是主要手段,但常规化疗药物疗效不理想,患者中位生存期仅6~7个月,目前尚无针对特异性驱动基因突变的药物,随着免疫检查点抑制剂在恶性肿瘤中的广泛应用,临床上可以观察到疗效改善的趋势。本文对合并SMARCA4缺失突变胸部肿瘤治疗的研究进展进行综述。

酵母海藻糖酶缺失突变株的构建及其耐性

【目的】构建酵母海藻糖酶缺失突变株,并进行耐性分析,进一步研究海藻糖与酵母耐性之间的关系,为商业生产打下一定的基础。【方法】利用同源重组的方法,敲除了编码酸性海藻糖酶的ATH1基因和中性海藻糖酶的NTH1基因,构建了酸性海藻糖酶缺失突变株(△ath1)、中性海藻糖酶缺失突变株(△nth1)和双缺失突变株(△ath1△nth1),并进行了耐性分析。【结果】结合PCR和Southernblot的结果,验证了突变株构建的正确。所有突变株的海藻糖积累量和细胞密度均高于亲本,冷冻、高温、高糖和酒精耐性提高了。【结论】说明海藻糖含量与酵母耐性有一定的相关性。突变株耐性的改善,表明它们在酿造和烘焙产业中具有潜在的商业价值。

维生素E和辅酶Q10对大鼠内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变的预防作用

目的 研究维生素E、辅酶Q10对大鼠线粒体DNA 4 834缺失突变的预防作用。方法Wistar大鼠 4 6只 ,采用抽笼法随机分为 3组 ,实验组 (A组 ,18只 )阿霉素 1mg/kg腹腔注射 ,每周 2次 ,共 3个月 ,同时给予维生素E 5 0mg/kg和辅酶Q10 10mg/kg灌胃 ,每天 1次 ;生理盐水对照组 (B组 ,18只 )在给予阿霉素的同时予以生理盐水灌胃 ;空白对照组 (C组 ,10只 )仅给予生理盐水灌胃。提取内耳组织总DNA ,利用巢氏聚合酶链反应技术检测内耳组织线粒体DNA 4 834bp缺失突变的发生情况 ,并检测血清中谷胱甘肽过氧化物酶活性的变化。结果 A组大鼠线粒体DNA 4 834bp缺失突变发生率为 2 3 0 8% (3/ 13) ,B组为 6 8 75 % (11/ 16 ) ,C组为 0 (0 / 8) ,经Fisher′s精确概率检验 ,单侧检验 ,A组和B组之间差异有显著性 (P =0 0 18) ,A组和C组之间差异无显著性 (P =0 2 15 )。A组血清谷胱甘肽过氧化物酶活性较B组高 ,差异有显著性 (校正t′检验 ,单侧检验 ,t′=6 4 74 ,P <0 0 1) ;A组和C组之间差异无显著性 (校正t′检验 ,双侧检验 ,t′ =1 92 0 ,P >0 0 5 )。结论 维生素E和辅酶Q10具有增加机体对自由基的清除能力 ,保护内耳组织线粒体DNA ,降低 4 834bp缺失突变发生率的作用。

乙型肝炎病毒前S基因区缺失突变发生机制的探讨

检测慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者和患者外周血内HBV前S区基因缺失突变的分子结构特点,探讨其发生机理。用聚合酶链反应方法从慢性乙肝患者和携带者血清中扩增出前S区基因片段,克隆、测序,分析缺失发生的结构特点,从而推测这些前S区基因缺失突变的产生机制。从262例慢性乙肝患者和103例无症状HBV携带者体内扩增出前S区片段,共在30例患者和携带者中检测出多种前S区基因缺失突变,主要集中于前S1区的3′端和前S2区的5′端。其中有9例患者和携带者体内存在完全一样的nt3019～nt3201183bp的缺失突变,该缺失突变符合真核细胞mRNA剪接机制,在此位置上各基因型的序列高度保守。同时有另外两种缺失突变,即nt3019～nt3147129bp缺失、nt3019～nt310991bp缺失也符合该剪接机制。有23种缺失突变部分于重复序列之间,符合逆转录过程中的模板转换机制所导致的缺失。根据前基因组RNA预测出二级结构,仅部分缺失突变在RNA二级结构中对应于局部的结构。此结果表明:HBV在外界因素mRNA的剪接机制和内在因素聚合酶蛋白的功能特点的共同作用下,产生各种突变,不同的机制将导致不同类型的缺失突变。除真核细胞mRNA剪接机制外,逆转录过程中的模板转换是主要机制之一。

极端嗜盐古生菌启动子序列缺失突变的微量热研究

用微量热方法和DNA缺失突变技术研究了来源于极端嗜盐古生菌R1上的一个推测的启动子片段(RM10)在大肠杆菌中的启动子功能.启动子片段融合到质粒pKK232-8上无启动子的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因前来检测它驱动基因表达的能力,缺失分析RM10启动子片段定位具有启动活性的重要功能区.实验结果从热动力学角度揭示,这个启动子片段上含有-35区和-10区特征的1382～1517bp(碱基对)区段是它在大肠杆菌中具有启动子功能的关键部分;在1～1382bp区段或1571～1848bp区段上还存在它的负调控区.该研究为基因启动子功能研究提供了一种新的、更加灵敏便捷的、化学与生物学相结合的方法.

郏县红牛SREBP-1c基因84 bp缺失突变的检测及其对6个生长性状的影响

旨在研究牛SREBP-1c基因内含子7区域84bp缺失的遗传多态性及其对生长性状的影响。本试验以中国地方品种郏县红牛共计441头个体为实验动物,通过DNA测序技术和琼脂糖凝胶电泳方法检测该区域缺失突变的多态性。结果发现,在该突变位点检测到2种基因型:WW和WD型,等位基因W和D频率分别为0.8651和0.1349。He、Ne和PIC值都很低,说明在本突变位点遗传多态性不够丰富。该突变位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。该位点的多态性与郏县红牛6个生长性状指标关联分析显示,郏县红牛WD基因型个体在12、18、24月龄的体质量和胸围显著高于WW基因型个体(P<0.01或P<0.05),基因型WD个体在18、24月龄的体斜长显著高于WW基因型个体(P<0.05),基因型WD个体在18月龄的平均日增体质量显著高于WW基因型个体(P<0.01)。初步认为WD型是提高黄牛体质量和体尺指标性状的有利基因型。本研究结果表明,黄牛SREBP-1c基因内含子7区域84bp缺失位点可作为郏县红牛生长性状的潜在分子育种标记,具有很大的研究价值。

空间环境诱变小麦叶绿素缺失突变体的主要农艺性状和光合特性

叶绿素缺失突变体对研究植物光合作用机制,揭示叶绿素生物合成与降解途径,发掘鉴定光合作用相关新基因以及了解基因间的相互作用有重要意义。空间诱变创制的小麦叶绿素缺失突变体Mt135的叶色表现为完全白化、条纹和绿3种类型,其中完全白化株叶片完全白化,于苗期死亡;条纹株叶片呈绿白相间的条纹,能够正常成穗结实,但其株高、穗长、株粒数、株粒重、千粒重都显著低于原始亲本,生育期比原始亲本延长5～7 d;绿株与原始亲本没有显著差异。初步遗传分析表明,Mt135是一个由核质基因共同作用的突变材料。对突变体及其原始亲本叶绿素荧光动力学参数的分析表明,当光照强度为110μmol m-2 s-1时,条纹株绿色组织光系统II的最大量子产量与原始亲本无显著差异,光系统II的潜在活性显著低于原始亲本,而光化学猝灭系数、非光化学猝灭系数、实际量子产量、调节性能量耗散的量子产量、非调节性能量耗散的量子产量在不同的生育期间变化不同。另外,不同的光照强度下,条纹株绿色组织的电子传递速率、光化学猝灭系数、实际量子产量的变化也不相同。条纹株白色组织和完全白化株则完全失去光合能力。上述结果证实,小麦叶绿素缺失突变体Mt135的光合作用受到很大的影响,光合特性发生了改变,较高的光照强度在拔节期对突变体影响较大,抽穗期影响相对较小。条纹株光合特性的改变与其株高、穗长和产量相关性状显著降低的结果相互印证。

一个新的水稻叶绿素缺失突变基因的遗传分析和分子标记定位

从正常绿色水稻品种824B中发现1个黄化突变体824ys。该突变体具有叶绿素缺失突变特性,表现为植株黄绿色,分蘖数减少,生育期延长,总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b的含量以及净光合速率比野生型亲本824B明显下降,每穗着粒数、结实率、千粒重等降低。对824ys与3个正常绿色品种杂交F1、F2的遗传分析表明,控制824ys的叶绿素缺失突变性状为1对隐性核基因。以495R/824ysF2作为定位群体,应用微卫星标记将824ys的叶绿素缺失突变基因定位于水稻第3染色体短臂,与RM218、RM282和RM6959等标记之间的遗传距离分别为25.6、5.2和21.8cM。认为该基因为一个新的水稻叶绿素缺失突变基因,暂命名为chl11(t)。

Epstein-Barr病毒潜伏性膜蛋白1 CTAR3缺失突变体的构建与功能分析

【目的】探讨Epstein-Barr病毒潜伏性膜蛋白1(LMP1)促细胞转化的主要活性部位及其作用机制。【方法】采用PCR方法重组LMP1羧基末端活化域3(aa232-aa351)对应密码子缺失突变体(LMP1△232-351),将突变型LMP1△232-351和野生型LMP1(LMP1WT)分别导入永生化的鼻咽上皮细胞NP69中,比较二者对细胞的转化作用。同时,构建含JAK3启动子序列的荧光素酶表达质粒(pGL-2/JAK3-LUC),将LMP1△232-351与LMP1WT分别与含有JAK3启动子序列或NF-κB结合序列启动子的荧光酶表达质粒共转染293细胞(用pLNSX质粒作对照),比较二者活化JAK3启动子或转录因子NF-κB的功能。【结果】(1)LMP1△232-351促NP69细胞转化的能力较LMP1WT显著降低(n=3,p<0.01)。(2)LMP1WT能明显呈浓度依赖性活化JAK3启动子,而LMP1△232-351上调能力几乎丧失。【结论】LMP1羧基末端活化域3(aa232-aa351)是LMP1的重要活性部位之一,其促细胞转化的作用与JAK3蛋白表达调节有关。

农杆菌介导的CMV侵染性克隆及2b缺失突变体构建

【目的】构建农杆菌介导的黄瓜花叶病毒(CMV)侵染性克隆,测试缺失CMV 2b基因后的侵染表型。【方法】首先将pHST40上的1x35S-MCS-HDVRZ-NOS转移到中间载体pBluescript SK Ⅱ上,用pRTL2上的2x35S替换中间载体上的1x35S增强子序列,然后将2x35S-MCS-HDVRZ-NOS转移到微型植物表达载体pCB301,构建适用于病毒侵染性克隆和农杆菌浸润的植物表达载体,在此基础上将CMV Fny株系的全长cDNA基因组构建到该植物表达载体的2x35S启动子和HDV核酶之间,通过农杆菌浸润在本氏烟中瞬时表达产生具有侵染活性的CMV基因组RNA,进一步缺失2b来测试该缺失突变体侵染植物的表型。【结果】构建了一个用于构建RNA病毒侵染性克隆的植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS,将CMV Fny的3条基因组分别构建在这个植物表达载体上后,通过农杆菌浸润本氏烟可诱导产生曲叶、花叶和矮化等症状,进一步对2b进行缺失,表明该缺失突变体接种本氏烟早期具有微弱曲叶症状,中后期表现无症,RT-PCR检测表明CMV Fny 2b缺失突变体能够系统侵染本氏烟。【结论】在改造的微型植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS上构建了CMV的侵染性克隆,构建的侵染性克隆通过农杆菌介导可快速高效侵染植物。2b对CMV Fny在本氏烟中的症状发展具有重要作用,但2b对其在本氏烟上的复制和系统侵染并不是必需。

大豆叶绿素缺失突变体HS 821的农艺性状和生化特性

经NaN3诱变获得的大豆叶绿素缺失突变体HS 821,其植株高度约为原品种的1/2,节位数、叶片大小、叶柄长度、单株荚数、粒数、粒重都较原品种低,但结荚密集,表现出一定的田间抗虫性;成熟期比原品种提早约10d。突变体表现为叶片黄化,叶片叶绿素平均含量是原品种的71%,但叶绿素a/b比值不变,为2∶1,表明该突变体是总叶绿素缺陷型。突变体的SOD活性和脯氨酸含量都比其原品种高,但MDA含量则较原品种含量低,表明突变体具有较强的抗氧化能力。

趋磁螺菌遗传操作体系的建立及磁小体缺失突变株的筛选

由于MagnetospirillumgryphiswaldenseMSR 1缺少简便有效的遗传操作体系和对常见抗生素的抗性 ,致使对该菌磁小体生物合成的机制等研究工作进展缓慢。为此建立了一套比较简便有效的遗传操作体系 ,其中包括 :以平板封膜培养技术获得单菌落、在选择性培养液中进行接合转移遗传因子 ,以液体培养和磁铁吸附技术筛选突变子。利用此体系 ,通过接合转座诱变技术 ,获得了 2个磁小体缺失突变株 。

人凋亡相关基因TFAR19缺失突变体的原核表达、产物纯化及鉴定

构建TF 1细胞凋亡相关基因 19(TF 1cellapoptosisrelatedgene 19,TFAR19)缺失突变体的原核表达载体 ,获取缺失突变体蛋白 ,用于TFAR19促凋亡分子机理的研究 .从真核表达载体pcDI TFAR19扩增出野生型TFAR19和 4个缺失突变体 ,重组到原核表达载体pGEX 4T 2 .经亲和层析方法对缺失体蛋白进行纯化后 ,再利用凝胶过滤的方法进一步纯化 .利用抗GST和抗TFAR19的单克隆抗体对蛋白进行免疫学鉴定 .用白血病细胞株HL 6 0检测蛋白活性 .成功地克隆并重组了野生型TFAR19及缺失突变体 pGEX 4T 2表达载体 ,对融合蛋白的表达条件进行了优化 .SDS PAGE结果显示 ,各个缺失突变体融合蛋白均有较高水平的表达 .免疫学检测证实获得了正确的表达产物 .活性检测证实 ,野生型TFAR19和缺失突变体 4可以明显促进去血清诱导的HL 6 0细胞凋亡 ,第

大肠杆菌PGDH末端缺失突变体的构建及抗反馈抑制效应分析

为了获得具有抗反馈抑制性质的大肠杆菌磷酸甘油酸脱氢酶（PGDH,d-3-phosphoglycerate dehydrogenase,EC 1.1.1.95）,通过对其碱基序列和蛋白质结构分析,用PCR突变法构建突变酶M1（缺失第410位氨基酸）、M2（缺失407～410位氨基酸）、M3（缺失337～410位氨基酸）.M0（野生型）及各突变型基因与pET22b（＋）载体连接后,表达融合蛋白.在非变性条件下,由NTA-Ni镍离子螯合亲和层析柱纯化野生型和突变体的酶蛋白.酶活性测定结果表明,M1、M2蛋白酶均保持了原有的野生型磷酸甘油酸脱氢酶活性,且部分解除了终产物L-丝氨酸的反馈抑制作用;M3蛋白酶完全解除了终产物的反馈抑制作用,但酶本身的催化活性略有降低（为野生型的83%）.M0、M1、M2菌株PGDH与L-丝氨酸结合的Ki值分别约为7μmol/L、20μmol/L、50μmol/L,说明该酶C末端1～4个氨基酸残基对L-丝氨酸和调控区的结合有重要影响.

小麦黄色花叶病毒RNA2自然缺失突变体的筛选和定位分析

许多真菌介体传播的病毒在机械接种过程中易于发生自然缺失。利用在小麦上连续机械接种WYMV的方法，自第27代起，利用RT-PCR和Northern blot方法在感病小麦中检测到一个WYMV RNA2的缺失突变株，序列分析发现缺失区域位于RNA2的214～2808nt，共计2595nt，并在缺失区域的两端存在7个碱基的反向互补序列。缺失区域上游紧邻这7个碱基双链区存在一富含AU的短序列，并据此对此D-RNA2的缺失机制进行了讨论。

一种快速简便的缺失突变方法

为了构建能表达稳定的、不易降解的ＴＭ－ＴＮＦ突变体（ＴＭ－ＴＮＦｍ）的基因，本文用改良的Ｓ－ＰＣＲ和ＯＥ－ＰＣＲ两种定位突变技术，成功地构建了缺失３６个碱基的ｐＢＳＫ－ＴＭ－ＴＮＦ突变重组体。与ＯＥ－ＰＣＲ技术（用两对引物进行两次ＰＣＲ反应）相比较，Ｓ－ＰＣＲ技术（用一对引物做一次ＰＣＲ反应）具有快速、经济、简便等优点，但其突变率较ＯＥ－ＰＣＲ低。

野生型及羧基端缺失突变HBx对肝癌细胞增殖的影响

目的明确氨基端或羧基端缺失突变50个氨基酸的HBx对肝癌细胞增殖的影响及可能机制。方法 PCR法分别扩增氨基端、羧基端缺失50个氨基酸的HBx基因片段(HBxn、HBxc),并定向插入绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pEGFP-C1以构建重组体pGFP-HBxn及pGFP-HBxc。脂质体转染法将重组体转染Hep G2细胞,用G418筛选,荧光显微镜下观察。RT-PCR鉴定稳定表达GFP-HBxn、GFP-HBxc融合蛋白的HepG2细胞系。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,Western blot法检测p16的表达。结果 RTPCR检测示HepG2/GFP-HBxn、Hep G2/GFP-HBxc细胞分别有HBxn、HBxc的转录和表达。MTT法检测示Hep G2/GFP-HBx、HepG2/GFP-HBxc细胞的增殖速度明显快于HepG2、HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBxn细胞(P<0.05)。流式细胞术检测示HepG2/GFP-HBx、HepG2/GFP-HBxc细胞的G0/G1期百分比较HepG2、HepG2/GFP细胞明显减少(P<0.05),而HepG2/GFP-HBxn细胞与HepG2、HepG2/GFP细胞比较差异无统计学意义。Western blots显示HepG2/GFP-HBx、HepG2/GFP-HBxc细胞的P16表达量明显低于HepG2、HepG2/GFP细胞,HepG2/GFP-HBxn细胞P16的表达水平与HepG2、HepG2/GFP细胞无明显差异。结论 HBx及羧基端缺失突变50个氨基酸的HBx能促进肝癌细胞的增殖,其作用可能是通过抑制抑癌基因p16表达而调控细胞周期进而促进肝癌细胞的增殖所致;HBx氨基端可能是HBx调控细胞周期及促进肝癌增殖的重要功能区域。

血浆EGFR19外显子缺失突变高灵敏度检测技术的建立

目的探讨结合酶切及片段分析技术建立稳定的高灵敏度EGFR19外显子缺失突变检测技术检测血浆EGFR19外显子缺失突变的价值。方法设计针对野生型片段的限制性内切酶予以降低野生型DNA背景。通过野生型和突变型序列的分析,以野生型序列为酶切底物,选择工具内切酶Tru1Ⅰ,设计内外两个PCR反应引物,且内侧引物一端予以标记绿色荧光。采用PCR-酶切-PCR-片段分析步骤,优化各反应条件,得到稳定的技术。以野生型DNA稀释突变型DNA检测该方法的灵敏度。采用上述方法检测42例肺癌患者外周血浆中EGFR19外显子突变情况。结果采用野生型DNA稀释突变型DNA模拟检测本方法的灵敏度,能够检测出1∶1000(Mt∶Wt)突变型DNA。42例肺癌患者中5例血浆EGFR19外显子存在缺失,其中4例为15bp的缺失,1例为24bp的缺失。结论本研究建立了一种联合酶切与片段分析的高灵敏度血浆EGFR 19外显子缺失突变检测技术,能够有效从外周血中检测出EGFR19外显子缺失突变。

两种油菜花瓣缺失突变体无花瓣性状的遗传分析

以两种不同类型油菜花瓣缺失突变体为实验材料,通过与正常有花瓣油菜杂交并回交构建F2和BC1群体,分析两种油菜无花瓣突变体的无花瓣性状的遗传规律。根据田间各遗传群体花瓣度(PDgr)的观察和统计表明,甘蓝型油菜突变体APT02无花瓣性状由两对主效隐性基因和一对隐性修饰基因控制;白菜型油菜突变体AM032无花瓣性状由一对隐性基因控制。两种油菜无花瓣突变体无花瓣性状的遗传都不存在母体细胞质效应。

用一种新型的PCR方法快速制备人TNF-α缺失突变体

人肿瘤坏死因子 α(hTNF α)的 2个Loop区 2 9～ 36、141～ 146是受体的主要结合部位 .应用一种新型的PCR方法 ,快速制备了这 2个Loop区的缺失突变体 ,并对其活性进行了研究 .结果表明 :这种新型的PCR方法在制备缺失突变体中具有快速、简便、经济等优点 ,值得推广 ;缺失蛋白对L92 9细胞的毒性作用明显降低 ,表明这 2个区域为hTNF