口咽拭子样品在小鼠肺炎病毒病原检测中的应用

目的评价分子病原学及血清学检测方法在小鼠肺炎病毒(PVM)检测中的适用性。方法3周龄BALB/c和C57BL/6J小鼠雌雄各半,滴鼻感染PVM,在感染后1、2、3周,1、2、3月采集各实验鼠口咽拭子及尾尖血,分别应用PCR和ELISA方法进行检测。结果两品系小鼠感染PVM病毒1周后,口咽拭子PVM核酸检出率为70%~100%,随后2周和3周检出率降低,CT值增高,1个月后无检出;外周血PVM抗体1周无检出,随后2、3周检出率为80%~100%,1至3月全部检出,且PVM抗体ELISA检测吸光度持续增高,2月和3月仍维持较高的抗体水平。结论小鼠口咽拭子样品的PCR检测结合血清学检测技术,可应用于小鼠PVM的质量控制。

甘草酸能减轻小鼠肺炎病毒引起的小鼠肺脏损伤

目的通过小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice,PVM)感染近交系BALB/c小鼠建立病毒感染肺炎动物模型,观察PVM感染过程中促炎症警报素分子高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)的变化,以及HMGB1抑制剂甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)对小鼠肺脏感染损伤的在体干预作用。方法将3周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为3组,每组6只。一组未经PVM感染,作为对照组(Control);另外两组先以1×10^(4)半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID_(50))/25μL剂量滴鼻接种PVM,然后分别给予GA生理盐水溶液灌胃(GA组)或单纯生理盐水灌胃(normal saline,NS组)处理,连续15 d。其间,观察并记录各组小鼠体重、外观等改变。在实验终点采集各组小鼠的肺脏组织样本,通过苏木精-伊红染色和免疫组织化学法检测小鼠肺脏组织内PVM和HMGB1蛋白的分布情况;通过实时荧光定量PCR法检测小鼠肺脏组织中HMGB1、Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR-4)、晚期糖基化终产物特异性受体(advanced glycosylation end-product-specific receptor,AGER),以及白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-2和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子的表达水平。结果与Control组相比,NS组小鼠6 d后体重显著下降(P<0.05),组织病理学结果显示其肺脏有明显的炎症病变,免疫组织化学结果显示HMGB1从细胞核释放至细胞质,实时荧光定量PCR结果显示HMGB1、IL-1β和IL-2的表达水平均显著上调(P<0.05);GA干预组的临床症状和体重无明显变化。而与NS组相比,GA干预组肺组织的病理损伤明显减轻,且肺组织中HMGB1、IL-1β、IL-2和干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)的表达水平显著下降(P<0.05),但AGER的表达水平显著增高(P<0.05)。结论PVM感染能引起明显的小鼠肺部炎症性病理损伤,而GA能有效减轻其损伤,其作用机制可能与激活HMGB1信号通路相关。

野马鼻肺炎病毒的分离鉴定

从新疆昌吉州吉木萨尔野马饲养繁殖中心送检的野马病料中分离到１株病毒，我们对其进行了鉴定。该病毒株在ＢＨＫ－２１细胞上连传６代出现典型的细胞病变，用适应ＢＨＫ－２１细胞的病毒接种鸡胚成纤维细胞、乳豚鼠肾原代细胞、豚鼠睾丸细胞均出现程度不同的细胞病变。在电镜下可见到典型的马鼻肺炎病毒粒子。病毒对５－碘脱氧尿核苷、氯仿、乙醚等敏感。在ｐＨ３．０下失活，５６℃３０ｍｉｎ灭活。病毒能被马鼻肺炎病毒标准阳性血清所中和。病毒接种乳豚鼠出现典型致死性肝炎。结果表明，所分离病毒为马鼻肺炎病毒，并将该毒株定名为ＰＨ９３－１。

山羊实验感染绵羊进行性肺炎病毒的抗体应答反应

用琼脂凝胶免疫扩散试验（ＡＧＩＤＴ）和免疫印迹试验（ＩＢＡ）对山羊实验感染绵羊进行性肺炎病毒（ＯＰＰＶ）的抗体应答反应进行了研究。结果，用ＡＧＩＤＴ和ＩＢＡ都可在接毒山羊的血清中检测到ＯＰＰＶ的抗体。ＡＧＩＤＴ最早于接毒后１５ｄ检测到抗体；ＩＢＡ最早于接毒后４ｄ检测到抗ＯＰＰＶ的ｇｐ４４和ｐ２８的抗体，以后又陆续检测到抗ｐ９４、ｐ１４和ｇｐ１２５的抗体。由此看出，ＩＢＡ比ＡＧＩＤＴ更为敏感。本研究结果表明，ＯＰ－ＰＶ可在山羊体内诱生较强的体液免疫应答反应，因此用ＯＰＰＶ通过山羊体传代的方法可能会得到具有良好抗原性的ＯＰＰＶ毒株。

绵羊进行性肺炎病毒与山羊关节炎一脑炎病毒的血清学交叉反应的研究

本实验用琼脂凝胶免疫扩散试验（ＡＧＩＤＴ）和免疫印迹试验（ＩＢＡ）对实验感染绵羊进行性肺炎病毒（ＯＰＰＶ）的山羊血清与山羊关节炎—脑炎病毒（ＣＡＥＶ）抗原以及实验感染ＣＡＥＶ的绵羊血清与ＯＰＰＶ抗原的交叉反应进行了研究。４只接种ＯＰＰＶ的山羊中有一只山羊的血清可与ＣＡＥＶ琼扩抗原发生交叉反应，并在免疫印迹试验中可识别ＣＡＥＶ的ｇｐ４４、ｐ３５和ｐ２８。２只接种ＣＡＥＶ的绵羊中有一只绵羊的血清可与ＯＰＰＶ琼扩抗原发生交叉反应，并在免疫印迹试验中可识别ＯＰＰＶ的ｇｐ４４和ｐ２８。以上的交叉反应结果表明ＯＰＰＶ与ＣＡＥＶ的抗原之间具有密切的相关性，这对于ＯＰＰＶ通过山羊和ＣＡＥＶ通过绵羊的传代研究是非常重要的，并对将来的免疫预防策略具有重要的指导意义。

传染性非典型肺炎病毒核蛋白的表达与活性检测

用PCR方法,人工合成传染性非典型肺炎病毒(SARS-CoV)核蛋白(N)全编码基因,并构建原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达。结果重组N蛋白表达产量占菌体总蛋白的40％以上,主要以可溶形式存在。用SARS患者急性期血清进行蛋白印迹检测,表明可溶形式和包含体形式均有明显活性。包含体形式的重组蛋白经纯化后纯度可达90％以上,活性与纯化前相当,可作为SARS抗体诊断试剂盒的抗原原料。

鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一次性可同时扩增鉴别鸡新城疫病毒(NDV)和禽肺炎病毒(APV)的二重RT-PCR,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持。【方法】根据Gen Bank已发表NDV的F基因序列(Gen Bank登录号JX840454)和APV的F基因序列(Gene Bank登录号AF187154)分别设计2对特异性引物,应用这2对引物建立可同时检测鉴别NDV和APV的二重RT-PCR,对扩增条件进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验和临床样品检测等验证其实用性。【结果】优化后的二重RT-PCR可特异性扩增出参试NDV毒株(La Sota株、F48E9株、I株)及APV/MN-10毒株的目的条带,其大小分别为247和424 bp,而其他对照参试毒株在247和424 bp处均无特异条带出现。二重RT-PCR针对NDV和APV的最低检出限均为10 pg的RNA。应用建立的二重RT-PCR对132份从广西采集的病鸡样品进行检测,结果得到NDV阳性样品26份、APV阳性样品2份,与血清学方法的鉴定结果一致。随机选取的2份NDV阳性PCR产物与NDV(Gen Bank登录号JX840454)的F基因序列一致,同源性达100%;2份APV阳性PCR产物与APV(Gen Bank登录号AF187154)的F基因序列也完全一致,同源性达100%。【结论】针对NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、简便快速的特点,可用于临床快速鉴别诊断,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供了技术支持。

小鼠肺炎病毒在严重呼吸道病毒感染中的研究进展

小鼠肺炎病毒(PVM)是天然的小鼠病原体,它和人类呼吸道合胞病毒(hRSV)紧密相关。接种最小量的病毒后支气管上皮细胞就会有大量的PVM复制,病毒复制的结果是在局部产生大量的促炎性因子(如巨噬细胞炎性蛋白1α、巨噬细胞炎性蛋白2、单核细胞趋化蛋白1和γ干扰素)以及肺部产生粒细胞,如果病毒复制未得到控制,PVM感染和继发炎性应答最终会导致肺水肿、呼吸衰竭和死亡。许多免疫调节方法已成功用于减少PVM感染率、小鼠的患病率和死亡率,为人的严重呼吸道病毒感染提供现实可行的治疗方案。

用蛋白A胶体金免疫电镜技术观察绵羊进行性肺炎病毒

本实验应用蛋白A胶体金免疫电镜技术与IEM、DEM、SPA-SPIEM比较观察了OPP-CMV_(40)-1株和CMV-33AN株。蛋白A胶体金方法所制备的样品在透射电镜下可观察到抗原—抗体复合物形成的抗体桥,在抗体桥上可看到病毒粒子。胶体金通过抗体桥分布在病毒颗粒的周围,胶体金周围还有多量病毒粒子。病毒颗粒呈球形,直径为80～100nm、外有一层囊膜,囊膜上有长约8nm的纤突。

小鼠肺炎病毒RT-PCR方法的建立及在实验动物感染和国际比对样本检测中的应用

目的建立小鼠肺炎病毒RT-PCR检测方法,用于实验动物及实验动物相关样本的检测。方法选择小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice,PVM)G基因保守序列设计合成引物,建立RT-PCR方法,并进行方法的特异性、敏感性、重复性和稳定性验证。应用建立的方法对日常送检的27只小鼠、9只大鼠、5只沙鼠肺组织样本和19只PVM感染小鼠肺组织样本,及8份国际实验动物理事会(the International Council for Laboratory Animal Science,ICLAS)国际比对样本进行检测。结果建立的方法与仙台病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、汉坦病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒无交叉反应。能够检测PVM DNA最小模板浓度为8.77×10拷贝/μL,可检测病毒最小滴度为10/mL。用放置-30℃冰箱保存12个月的引物和PVM质粒进行PCR检测,仍能扩增到约249 bp的目的条带。用建立的方法检测日常送检的27只小鼠、9只大鼠、5只沙鼠肺组织样本,结果均为阴性;检测19只PVM感染小鼠肺组织样本,有7只小鼠肺组织样本结果阳性;检测8份ICLAS国际比对样本,有1份样本小鼠肺炎病毒核酸阳性,均符合预期结果。结论建立的PVM RT-PCR方法特异、敏感,重复性、稳定性好,能够用于小鼠、大鼠、沙鼠等实验动物的监测及其相关样本的检测。

用绵羊进行性肺炎病毒实验感染山羊的研究

用绵羊进行性肺炎病毒（ＯＰＰＶ）接种４只山羊３～４个月后，可观察到接毒山羊都出现了发育迟缓和消瘦现象，并有１只山羊出现了明显的临床病症。而未接毒的对照山羊则发育正常。接毒２８ｄ后，可以从接毒山羊的外周血单核细胞中分离到病毒。病理剖检发现４只接毒山羊中有１只山羊的多种器官出现了较为严重的病变，组织学检查则可看到典型的间质性肺炎、中度的脑炎和较为严重的脾炎的病变。以上的结果表明ＯＰＰＶ可以感染山羊，并对山羊有较强的致病性。因此将来用山羊培育ＯＰＰＶ强毒是可能的，并且这是研制ＯＰＰＶ减毒疫苗最为关键的一步。

小鼠肺炎病毒的分离和鉴定

本文采用SPF小鼠滴鼻分离到一株鼠肺炎病毒,经鸡胚试验、组织培养、间接免疫荧光试验(IFA),抗体产生实验,同时用美国鼠肺炎(PVM)药盒的验证试验均证实了该分离物为鼠肺炎病毒(简称PVM-Bj)。1986年PVM抗体检测按季度统计,其阳性率分别为51％,15％,7.7％,0％。

抗绵羊进行性肺炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用提纯的OPPV细胞抗原免疫BALB/c小鼠脾脏与SP2/0小鼠骨髓细胞融合,融合率为70%,以ELISA双抗体夹心法进行检测,阳性率为20%,经过有限稀释法克隆出1A_6、2B_8、1G_3、2G_44株分泌抗OPPV抗原的单克隆体杂交瘤细胞株。选择抗体分泌滴度高的1A_6细胞进行了较详细的研究,结果表明,其核内染色体数为96～110条,抗体属性为IgG1,轻链为K链,IFA试验表明产生的McAb对OPPV有特异性,细胞传30代并在液氮中保存半年后复苏仍能稳定地分泌抗OPPV McAb,细胞分泌抗体的ELISA滴度腹水为6.4×10~4,上清为640,McAb经硫基乙醇还原后在SDS-PAG上呈现2条区带,一条为重链部分,MW50000,另一条为轻链部分,MW为25000。

绵羊进行性肺炎病毒对驴胎皮肤细胞的感染试验

绵羊进行性肺炎病毒(OPPv)在驴胎皮肤细胞(D细胞)上连续传代培养至60代。随着代次的增加,以多核巨细胞为特征的细胞病变可提前至接毒后2～3天出现.至5～6天时大部分贴壁细胞脱落,病毒滴度达到高峰(7.25TC1D_(59)/0.1ml)。高代次的传代细胞毒经电镜超薄切片观察,病毒粒子呈球形.直径80～120nm,大多散在或以聚堆的形式分布在细胞外,环境在胞浆膜可以见到出芽增殖的病毒粒子.以绵羊进行性肺炎驴胎皮肤细胞毒(OPPDV)接种绵羊,可产生沉淀抗体。

大型综合性医院外出复工体检筛查新冠肺炎病毒管理实践

目的:探索对新冠肺炎病毒筛查复工体检采用上门服务新模式工作方法的研究。方法:外出复工体检单位28个,体检总人数8367人,体检项目为新型冠状病毒核酸检测、新型冠状病毒抗体检测(IgG+IgM)、血常规、放射肺部CT检测,该项目单位可自由组合。通过对医务人员个人防护级别要求、受检者准备要求、体检环境的要求、各标本采集注意事项及运送、医疗垃圾回收等严格按标准预防执行,以达到疫情期间保质保量的完成外出复工体检。结果:所检者8367人中,核酸阳性3例,双阳即IgM+和IgG+为31例,单阳即IgM+为2例,单阳即IgG+为23例,CT提示病毒肺或不排除为3例,标本零丢失零污染。结论:疫情防控工作仍一刻也不得松懈,需慎终如始,体检服务人群来源广,数量大,为了保证安全,复工体检条件始终宜严不宜松,要做好充分的准备,严格执行各项诊疗标准,才能把这项利国利民的工作做好。

非典型性肺炎病毒S蛋白受体结合域的可溶性表达

试验目的是获得S蛋白受体结合域基因,并获得其高效表达,为SARS病毒受体的进一步研究奠定一定的基础。首先通过PCR方法获得了S蛋白起始密码和SalⅠ限制性内切酶之间包含受体结合区的片段,然后将该基因定向克隆到pET-22b原核表达载体,构建了pET-22b-S1重组质粒,转化大肠杆菌并诱导目的蛋白的表达,经SDS-PAGE没有发现明显的目的蛋白带。利用载体和S1基因上的NcoⅠ酶切位点,将S1基因的信号肽序列和部分疏水序列切掉后,构建pET-22b-SNS重组质粒。pET-22b-SNS重组质粒仍然包含受体结合域序列,并且阅读框没有改变。将pET-22b-SNS转化大肠杆菌,发现明显的目的蛋白带。Western blot结果表明表达蛋白为SARS病毒S1蛋白的一部分。

人中间肺炎病毒及其感染的临床诊断

人中间肺炎病毒(human metapneumovirus,hMPV),又译成偏肺病毒肺炎,是过去20年来感染儿童中分离到,其临床症状类似呼吸道合胞病毒感染.2001年荷兰学者Van DenHoogen报道自28名小儿中分离出一种新的副黏病毒[1].副黏病毒科中的肺炎病毒亚类分为两属:肺炎病毒属(pneumovirus)和人中间肺炎病毒属(metapneumovirus).人呼吸道合胞病毒(HRSV)是属于前一属的亚型代表病毒.中间肺炎病毒末发现可致哺乳动物感染或发病的病毒.二属的主要区别是其基因的结构不同,中间肺炎病毒属缺少NS1和NS2.病毒在猴肾细胞(tMK)中缓慢复制.血清学结果显示病毒主要侵犯5岁儿童.人中间肺炎病毒至少在人类存在50年.

马鼻肺炎病毒(EHV-1)三种诊断方法的比较研究

用从德国引进的马鼻肺炎(EHV-1)标准毒株建立了琼脂免疫扩散(AGID)、对流免疫电泳(CIE)及血清中和实验(SNT)三种方法,用于对马鼻肺炎的诊断.

用Dot-ELISA检测马鼻肺炎病毒抗体的研究

用从德国引进的马鼻肺炎 ( EHV-1 )标准毒株经 BHK-2 1细胞传代增殖 ,免疫家兔 ,制备高免血清 ,提取Ig G并用辣根过氧化物酶 ( HRP)进行标记 ,建立了能够大量、快速、特异地检测马鼻肺炎的斑点 -酶联免疫吸附实验 ( Dot-ELISA)方法 ,并应用此方法对 1 0 0份马血、2份野马流产胎儿病料及从野马流产胎儿病料中分离的毒株 PH93 -1进行了检测 ,结果证明 ,本方法具有较好的特异性和敏感性 ,而且操作简便、快速 ,是一种适用于马鼻肺炎的诊断、流行病学调查。