一个承载分子的设计与肽抗生素hPAB-β的高效表达

目的 通过设计一个承载蛋白分子高效表达肽抗生素hPAB β ,为大量制备hPAB β奠定基础。 方法 根据肽抗生素的特性 ,确立 4条设计原则 ,并据此设计一 489bp的承载蛋白编码序列 ,用化学合成法获得该序列并将之克隆到pQE 3 2中构建成表达载体 ,进一步将肽抗生素hPAB β基因插入上述表达载体 ,肽抗生素基因位于承载蛋白编码序列 3’ 端 ,两者构成融合基因。将含融合基因的表达载体转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性重组子 ,并用阳性重组子表达融合蛋白。结果 设计的承载蛋白为 163个氨基酸 ,分子量 17668.80 ,等电点 5 .62 1。用承载分子与肽抗生素hPAB β构建的融合蛋白表达载体转化细菌后 ,筛选到 4个阳性重组子 ,均能高效表达肽抗生素融合蛋白 ,融合蛋白的产量占细菌总蛋白的 40 %～ 45 %。结论 设计的承载蛋白分子能够实现肽抗生素的高效表达。

多肽抗生素apidaecin基因在乳酸乳球菌中的融合表达

利用乳链菌肽 (nisin)诱导表达系统 ,以泛素 (ubiquitin)融合蛋白的形式在乳酸乳球菌 (Lactococcuslactis)中表达了多肽抗生素apidaecin。利用Tricine SDS PAGE和Westernblotting均可在诱导后的宿主菌中检测到特异蛋白带。表达产物的最高产量可达宿主菌可溶性蛋白的 7 2 %左右。在体外用泛素特异性蛋白酶UBPI从融合蛋白中切除泛素后 ,产物具有明显的抗菌活性。

生防芽胞杆菌脂肽抗生素研究进展

本文对生防芽胞杆菌脂肽抗生素的类群、特性,脂肽抗生素合成相关基因的基因工程研究以及脂肽抗生素的分离纯化、鉴定进行了概述。最后对该类抗生素的研究前景进行了展望。

肽抗生素hPAB-β在毕赤酵母中的表达与活性鉴定

目的构建表达人源肽抗生素hPAB-β的重组毕赤酵母,为大量制备hPAB-β奠定基础。方法用PCR及引物延伸法得到天然及优化的hPAB-β序列,克隆入pPIC9K质粒,转化DH5α大肠埃希菌,用酶切和核苷酸测序鉴定。重组质粒经SalⅠ酶线性化,整合入毕赤酵母GS115中,在DNA,mRNA及蛋白水平鉴定阳性重组子。结果构建的含天然及优化序列的重组质粒酶切均可得到相应大小的插入片段,与预期相符,测序结果表明序列和阅读框均正确。线性化的重组质粒转入GS115后,得到7个不同的高拷贝阳性转化子,均能表达重组肽并具有良好的抑菌活性。结论本研究成功构建含天然及优化hPAB-β序列的重组毕赤酵母工程菌,能够用于肽抗生素hPAB-β的制备。

多肽抗生素研究进展

多肽抗生素是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽 ,一般具有抗细菌或真菌的作用 ,有些还具有抗原虫、病毒或癌细胞的功能。按照化学结构的不同 ,多肽抗生素可分为5类 :①具有螺旋结构的线性多肽 ;②富含某种氨基酸的线性多肽 ;③含有一个二硫键的多肽 ;④含有两个或两个以上二硫键的多肽 ;⑤羊毛硫抗生素。根据作用机理的不同 ,多肽抗生素又可分为裂解细胞膜的裂解肽和非裂解肽。多肽抗生素已经开始用于医药、食品和植物抗病基因工程等方面 ,并且有着很大的发展潜力。

植物多肽抗生素研究进展

植物多肽抗生素是一类对细菌、真菌等微生物及某些昆虫和动植物细胞具有抑制或杀灭作用的小分子多肽 .根据多肽抗生素的氨基酸序列及二级结构 ,可将植物多肽抗生素分为 9类 ,包括硫素 (thionins)、植物防御素 (plantdefensins)、转脂蛋白 (lipidtransferproteins,LTPs)、橡胶素 (heveins)、打结素 (knottins)、凤仙花素(1b AMPs)和新近发现的荠菜素 (shepherdins)、蜕皮素 (snakins)、环肽 (cyclotides) .对近年来植物多肽抗生素的分类、抗菌机理、生物活性及基因工程等方面的研究情况作一介绍 。

毕赤酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化

目的在成功构建肽抗生素hPAB-β重组毕赤酵母的基础上,深入探讨酵母表达hPAB-β的规模化纯化方法。方法采用高密度发酵法在3.7L发酵罐中对pPIC9K-hPAB-β/GS115优5重组菌株进行发酵,收集发酵液,依次采用W-UF-Ⅱ过滤系统超滤、反相层析、阳离子交换、分子筛层析等纯化技术对目标表达产物逐级进行纯化,目的蛋白用15%的Tricine-SDS-PAGE电泳进行跟踪分析。最终纯化产物的生物学活性用平板琼脂扩散法进行测定。结果在培养至工程菌菌体湿重约200～250g/L时,以甲醇诱导培养基诱导目的蛋白表达,48h后菌体湿重达280g/L,目标产物表达量约75mg/L。发酵液经Mr10000膜超滤,达到去除大部分酵母色素和浓缩样品的目的(体积浓缩约2/3)。再经反相层析、离子交换、分子筛层析纯化,最终目的产物的纯度达98%以上,得率达32.5%。且纯化的目的蛋白具有良好的杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性。结论酵母表达肽抗生素hPAB-β经膜超滤、反相层析、离子交换和分子筛层析四步纯化,实现了去除非目的蛋白、酵母色素及脱盐的目的,为规模化制备hPAB-β创造了前提。

肽抗生素hPAB-β基因串联体的构建及原核细胞表达初探

目的 : 构建肽抗生素hPAB β基因多拷贝串联体重组质粒 ,实现目的基因串联产物在大肠杆菌中的高效表达。 方法 :以表达质粒pQE 32为载体 ,利用同裂酶PstⅠ与AvaⅢ能产生相同粘端的特性 ,通过PCR扩增、酶切、连接、转化等操作 ,构建含不同数目hPAB β基因的串联体。对获得的重组菌用异丙基巯基半乳糖 (IPTG)诱导表达 ,Tricine SDS PAGE观察串联体融合蛋白的表达情况。 结果 :构建了一至八拷贝的串联体重组质粒 ,经酶切、DNA测序分析表明 ,各串联体的DNA序列及阅读框完全正确。Tricine蛋白电泳显示 ,各串联体的阳性转化菌株经IPTG诱导后均能表达出目的融合蛋白 ,相对分子质量与预期结果相符 ,表达量占细菌总蛋白的 1 0 %～2 2 %。但八拷贝较其他串联体表达率有所降低。 结论 :hPAB β基因串联体重组表达质粒的成功构建 ,为大量制备目的肽抗生素奠定了基础 ,并为其他小分子生物活性肽的制备提供了参考。

表达多肽抗生素apidaecin的转基因烟草及其抗病性的初步分析

将多肽抗生素apidaecin基因与病程相关蛋白的信号肽序列融合 ,构建了apidaecin的分泌型植物表达载体、apidaecin与另一多肽抗生素Shiva I的双价分泌型植物表达载体 ,以本实验室原来构建的Shiva I分泌型植物表达载体做对照 ,转化了模式植物烟草。对 3种转基因植物进行了分子检测 ,转化再生苗 95 %为PCR阳性 ,Southern杂交结果进一步证明外源基因已经整合到了烟草基因组中 ,RT PCR检测表明外源基因可以在转基因烟草内正常转录。对T0 代转基因烟草进行烟草野火病的抗病性实验 ,从 3种转基因烟草中都得到了抗病植株 ,病情指数分析的初步结果显示 ,双价转基因烟草抗病性最好 ,apidaecin的次之 ,Shiva I的最差。

肽抗生素hPAB-β的化学合成及其杀菌活性的初步证实

目的 化学合成、纯化并初步测定肽抗生素hPAB β的活性 ,为后续研究奠定基础。 方法 采用固相合成法合成肽抗生素hPAB β ,经RP HPLC纯化 ,用质谱进行分子量鉴定 ,谷胱甘肽氧化 还原法复性合成产物 ,进一步用阳离子交换柱纯化复性产物 ,收集主峰 ,药敏法初步测定合成肽的抗菌活性。结果 合成肽抗生素hPAB β的纯度为 86 5 2 % ,经质谱分析 ,合成肽的分子量测定值与理论值相符。用谷胱甘肽氧化 还原法复性合成肽取得了较好的效果。复性产物对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌具有杀灭作用。结论 化学合成的肽抗生素hPAB β具有良好的杀菌活性。

多肽抗生素apidaecin对一些植物致病细菌的抗菌活性及对烟草原生质体毒性的研究

以多肽抗生素 Shiva- I为对照 ,利用平板抑菌圈法测定了多肽抗生素 apidaecin对我国一些重要植物致病细菌的抗菌活性。发现 apidaecin对供试棒状杆菌属、黄单胞菌属的菌株没有活性 ,但是对供试假单胞菌属、欧文氏菌属和土壤杆菌属菌株的抗菌活性比 Shiva- I强 2～ 5倍 ,其最小抑菌浓度一般在 0 .4～ 5 .9μmol/L之间。apidaecin C-末端酰胺化后 ,抗菌活性略有升高。Shiva- I对烟草原生质体的最小抑制浓度为 86 .2μmol/L ,2 0 mmol/L浓度的 apidaecin对烟草原生质体依然没有毒性。

基因工程技术在肽抗生素制备中的应用进展

肽抗生素是由生物体基因编码的肽类物质 ,广泛存在于自然界中 ,是生物体非特异性免疫的重要组成部分 ,具有抗菌活性强、抗菌谱广、不易产生耐药性等优点。在未来抗感染治疗中有广阔的应用前景。肽抗生素的制备是制约其开发应用的关键环节。作者对肽抗生素工程制备的有关进展进行综述 ,包括酵母、杆状病毒、大肠杆菌等表达技术在肽抗生素制备中的应用 ,以及转基因动。

重组毕赤酵母高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β及其抑菌活性初步鉴定

目的探讨hPAB-β工程菌的高密度发酵方法,鉴定发酵产物中目的肽的活性。方法采用补料分批培养方法,在3.7 L发酵罐中对重组酵母菌进行高密度发酵,温度控制在30℃,pH值范围为4.95～5.05,在菌体湿重达到200～250 g/L后开始诱导,经过约50 h甲醇诱导后结束发酵。对发酵上清进行反相层析、分子筛层析以及反相高效液相色谱纯化,通过抑菌实验对纯化产物进行活性鉴定。结果3次高密度发酵在菌体湿重分别达到235.0 g/L、210 g/L和264.8g/L时进行诱导表达,发酵上清中目标肽的表达量分别达73.7 mg/L、76.6 mg/L和74.3 mg/L。发酵上清通过反相层析、分子筛层析以及反相高效液相色谱纯化,获得重组肽抗生素hPAB-β,该重组蛋白经抑菌实验显示了较好的抑菌活性。结论成功实现了酵母工程菌的高密度发酵,为下一步规模化制备hPAB-β奠定了基础。

人源肽抗生素hBD-2表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

为了构建人源肽抗生素hBD 2的表达质粒并在大肠杆菌中表达 ,将化学合成的hBD 2全基因插入原核融合蛋白表达质粒 pinpointXa 3的多克隆位点构建成表达质粒 ,按常规方法转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性重组子并诱导融合蛋白的表达。结果经酶切鉴定获得 7个阳性克隆 ,序列分析表明其中 4个克隆的插入序列与hBD 2基因完全一致 ,另 3个克隆插入序列的 39位由C突变为T ,89位多了一个G。正确的阳性克隆子在大肠杆菌中产生了约 18kD的特异性诱导蛋白。hBD 2的成功表达为进一步研究hBD 2的抗菌活性、抗菌机理打下了一定的基础。

肽抗生素hPAB-β制备工艺中基因工程菌的改建

目的通过重新构建新的3拷贝串联体基因工程菌phPAB-β(3)/M15,在原有肽抗生素hPAB-β制备工艺路线基础上,使发酵后目的肽的最终产量得到提高。方法重新构建含有重组质粒pQE31-hPAB-β(3)的基因工程菌M15,然后筛选出能够稳定而且高效表达目标蛋白的最佳工程菌株,进行传代稳定性分析,并明确新建工程菌中目标融合蛋白的表达形式和亲和层析的效果,最后通过相同条件下,在逐步放大的发酵规模(1L摇瓶,3.7L和10L发酵罐),与以往的3拷贝串联体工程菌phPAB-β(3)/JM109进行对比研究(湿菌产量、目标蛋白表达率),同时观察新建工程菌在10L发酵中目标蛋白的表达和遗传稳定性。结果筛选出的最佳工程菌株的目标蛋白的表达效率为34.8%,经LB培养传代10次后,点种LB(AMP、KAN)平板,生长率为100%,质粒保存率达100%。在1L摇瓶,3.7L和10L发酵罐的发酵规模下,phPAB-β(3)/M15与phPAB-β(3)/JM109一样,目标融合蛋白都以包涵体形式表达,亲和层析效果相近,目标蛋白表达率无显著性差异(P>0·05),但发酵产量大于后者,有非常显著性差异(P<0·01)。且新建工程菌在10L发酵中发酵产量达到55.15g/L,诱导表达后的第5小时,蛋白表达达到高峰,蛋白表达率为30.2%,重组质粒保存率为100%。结论新构建工程菌phPAB-β(3)/M15比起原来基因工程菌phPAB-β(3)/JM109,是更为理想且利于肽抗生素hPAB-β工业生产的基因工程菌。

肽抗生素LL-37的研究进展

肽抗生素LL 37是一种内源性抗生素 ,为人体内发现的cathelicidin家族的惟一成员。其前体hCAP18经蛋白酶加工去除N端高度保守的cathelin后 ,才能形成具有生物活性、相对分子质量约为 5 0 0 0的LL 37。LL 37对革兰阴性和阳性菌均有广谱抗菌作用 ,其抗菌活性依赖于α 螺旋结构的形成。血浆中的apoA Ⅰ可结合LL 37并抑制其细胞毒性作用 ,从而使机体免受LL 37的损伤。除抗微生物活性外 ,LL 37还具有结合与中和内毒素、趋化及促进血管生成等作用。

肽抗生素及其基因工程研究

抗生素的滥用带来严重的病菌抗药性问题。肽抗生素能杀死多种微生物及特异性杀死癌细胞 ,通过穿膜打洞的方式使细胞死亡 ,不会导致抗药菌株的产生。从昆虫及高等动物中分离纯化了许多种类的肽抗生素 ,寻找到一些杀菌和杀癌细胞能力强的种类。由于分离天然产物产量极微 ,采用人工合成则成本太高 ,科研人员致力于用基因克隆与表达的技术研究与开发肽抗生素。

蛙皮多肽抗生素的研究进展

蛙皮多肽抗生素(peptide antibiotics)是由两栖动物皮肤分泌的,有抗菌、抗癌作用的多肽,广泛存在于两栖动物的皮肤分泌物中.由于具有抗菌谱广、种类多、不易产生耐药性等优点,其应用已涉及到医药工业、食品工业等领域,应用前景广阔.从蛙皮多肽抗生素的分类、分子结构与功能、作用机制、生物学活性、化学修饰和基因工程方面概述了其研究现状与进展.