清肾颗粒对大鼠NRK-52E细胞转分化模型miR-23b和PINK1/Parkin通路的影响

目的 探讨TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型中miR-23b对PINK1/Parkin通路的靶向调节机制,并阐明清肾颗粒含药血清对NRK-52E细胞转分化的干预机理。方法 采用超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱法对清肾颗粒进行全指纹图谱分析。构建TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型,转染siRNA后分为模拟物空载对照组、miR-23b-5p模拟物组、抑制剂空载对照组、miR-23b-5p抑制剂组,观察miR-23b-5p对PINK1表达量的影响。再将NRK-52E细胞分组为正常组、TGF-β1组、清肾颗粒组、miR-23b-mimic-NC组、miR-23b-mimic组、miR-23b-mimic+清肾颗粒组,Western blot法检测NRK-52E细胞中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin-1、P62、α-SMA蛋白表达,RT-qPCR法检测NRK-52E细胞中miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、α-SMA mRNA的表达,双荧光素酶报告基因实验检测miR-23b-5p与PINK1的靶向关系。结果 UPLC指纹图谱法鉴定出清肾颗粒中11个活性成分。miR-23b-5p过表达后,PINK1 mRNA表达量也显著增加(P<0.05);而miR-23b-5p表达沉默后,PINK1 mRNA表达量也显著减少(P<0.05)。双荧光素酶报告显示,Rno-miR-23b-5p能显著下调Rno-PINK1-WT荧光素酶活性(P<0.05),但未能下调突变Rno-PINK1-mut荧光素酶活性(P>0.05)。清肾颗粒含药血清干预实验发现,TGF-β1组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显低于正常组,P62和α-SMA表达明显高于正常组(P<0.05)。清肾颗粒组和miR-23b-mimic组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显高于TGF-β1组,P62和α-SMA表达明显低于TGF-β1组(P<0.05)。miR-23b-mimic+清肾颗粒组的表现更优于miR-23b-mimic组(P<0.05)。结论 清肾颗粒能够上调NRK-52E细胞内miR-23b-5p表达,并通过增强PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬活性,抑制NRK-52E细胞转分化进程。

清肾颗粒含药血清通过miR-23b-5p靶向Nrf2通路减轻NRK-52E细胞转分化

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)诱导NRK-52E(大鼠肾小管上皮细胞)细胞转分化模型中miR-23b-5p是否能对Nrf2通路靶向调节,并阐明清肾颗粒含药血清减轻NRK-52E细胞转分化的机制。方法构建TGF-β1诱导的NRK-52E细胞转分化模型,分别使用miR-23b-5p mimic、inhibitor以及阴性对照(NC)siRNA转染细胞;采用清肾颗粒含药血清进行干预,分为正常组、TGF-β1组、清肾颗粒组、miR-23b-mimic-NC组、miR-23b-mimic组、miR-23b-mimic+清肾颗粒组。采用CCK8法测定NRK-52E细胞活性;双荧光素酶报告基因实验检测miR-23b-5p与Nrf2间的靶向关系;Westernblot法检测细胞中Nrf2、Keap1、α-SMA蛋白表达;RT-qPCR法检测细胞中miR-23b、Keap1、Nrf2、α-SMAmRNA表达;流式细胞术检测ROS。结果根据CCK8结果筛选得出清肾颗粒含药血清的最佳浓度和时间分别为20%和24h,TGF-β1刺激的最佳浓度和时间分别为10ng/mL和24h。转染miR-23b-5p mimic和inhibitor发现,当miR-23b-5p过表达后,Nrf2 mRNA表达量也增加;而miR-23b-5p表达沉默后,Nrf2 mRNA表达量也减少。双荧光素酶报告显示,Rno-miR-23b-5p能显著下调Rno-Nrf2-wt荧光素酶活性(P<0.05),但未能下调突变Rno-Nrf2-mu荧光素酶活性(P>0.05)。清肾颗粒含药血清的干预实验发现,与正常组比较,TGF-β1组的miR-23b-5p、Nrf2表达降低,Keap1、α-SMA和ROS表达升高(P<0.05)。与TGF-β1组比较,清肾颗粒组的miR-23b-5p、Nrf2表达升高,Keap1、α-SMA和ROS表达降低(P<0.05);miR-23b-mimic组miR-23b-5p、Nrf2表达升高,Keap1、α-SMA和ROS降低(P<0.05)。与miR-23b-mimic-NC组比较,miR-23b-mimic组miR-23b-5p、Nrf2表达升高,Keap1、α-SMA和ROS降低(P<0.05)。与miR-23b-mimic组比较,miR-23b-mimic+清肾颗粒组的miR-23b-5p、Nrf2表达升高,Keap1、α-SMA和ROS降低(P<0.05)。结论清肾颗粒含药血清能通过miR-23b-5p靶向Nrf2通路机制减轻NRK-52E细胞转分化。

MEK/ERK1/2在LPS抑制NRK-52E肾小管上皮细胞增殖中的作用

目的探讨脂多糖(LPS)对大鼠NRK-52E肾小管上皮细胞增殖的影响及MEK/ERK1/2信号途径的调节作用。方法不同剂量LPS按不同时间刺激NRK-52E细胞,并以MEK特异性抑制剂U0126干预。使用cell counting kit-8(cck-8)试剂检测细胞增殖,Western blot检测NRK-52E细胞ERK1/2、Akt蛋白磷酸化水平。结果LPS在0.001、0.01 mg·L-1作用72 h对NRK-52E细胞增殖无明显影响,在0.1、1.0 mg·L-1抑制NRK-52E细胞增殖;MEK特异性抑制剂U0126显著抑制NRK-52E细胞增殖,其作用在2.5、5、10、20μM浓度之间无显著差异。U0126预处理加强LPS对NRK-52E细胞增殖的抑制作用。LPS诱导NRK-52E细胞ERK1/2和Akt磷酸化;U0126单独或联合LPS处理NRK-52E细胞72 h阻断ERK1/2蛋白磷酸化,伴有pAkt蛋白水平上调。结论MEK/ERK1/2可能在LPS抑制NRK-52E细胞增殖的过程中起保护作用。

补肾活血中药复方含药血清通过调节NCC和CLC-5对高盐诱导的体外NRK-52E细胞发挥保护作用

目的:探讨补肾活血中药复方含药血清(NKABRS)通过钠氯同向转运体(NCC)和电压门控性氯离子通道5(CLC-5)对高盐诱导的体外大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E损伤、凋亡和骨代谢相关因子表达的影响及作用机制。方法:取SPF级2月龄雌性SD大鼠30只,随机分为对照组与补肾活血中药复方组,分别灌胃给药后制备对照血清和补肾活血中药复方含药血清并作用于体外培养的NRK-52E细胞,CCK-8法检测NKABRS对细胞活力的影响。体外培养的NRK-52E细胞,分为对照组、NKABRS(3%)组、NaCl(0.25 mol/L)组和NaCl+NKABRS组,CCK-8法检测各组细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot和RT-qPCR法检测细胞内骨桥蛋白(OPN)、NCC、CLC-5、骨形态发生蛋白7(BMP-7)和1α-羟化酶(CYP27B1)的表达,免疫荧光法检测细胞内CLC-5和NCC的蛋白含量及分布。通过RNA干扰技术敲减NRK-52E细胞NCC和CLC-5的表达,RT-qPCR检测敲减后各组细胞内BMP-7、1α-羟化酶和OPN的表达。结果:NaCl(0.25 mol/L)可抑制体外NRK-52E细胞的活力并增加其细胞凋亡率(P<0.01),同时增加细胞NCC和OPN表达,并减少CLC-5、BMP-7和1α-羟化酶表达(P<0.01);NKABRS可增加NaCl诱导的细胞活力并降低细胞凋亡率(P<0.01),降低NCC和OPN表达,并提高CLC-5、BMP-7和1α-羟化酶的表达(P<0.01)。沉默体外培养的NRK-52E细胞内NCC基因可下调OPN表达并增加BMP-7和1α-羟化酶表达(P<0.01),NKABRS可进一步提高BMP-7和1α-羟化酶表达(P<0.05);沉默细胞内CLC-5基因可增加OPN表达并减少BMP-7和1α-羟化酶表达(P<0.01),NKABRS可抑制OPN表达并上调BMP-7和1α-羟化酶表达(P<0.01)。结论:NKABRS可减轻高浓度NaCl引起的体外NRK-52E细胞的损伤和凋亡,其机制可能与减少NCC表达并增加CLC-5及细胞内骨代谢正向调节因子1α-羟化酶和BMP-7的表达有关。

内毒素对NRK52E细胞生长及细胞间缝隙连接功能的影响

【目的】研究不同浓度内毒素(LPS)对NRK52E细胞生长和细胞间缝隙连接功能的影响。【方法】体外培养NRK52E细胞,随机分为对照组及LPS处理组,LPS处理组分别用5个不同浓度的LPS(10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL)作用24h。采用四甲基偶氮唑盐法检测NRK52E细胞的生长;细胞荧光免疫示踪法测定NRK52E细胞间缝隙连接传递的功能;WesternBlotting测定对照组、LPS10ng/mL组和LPS100ng/mL组Cx43蛋白的表达。【结果】①与对照组和LPS10ng/mL组相比,LPS50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL及1000ng/mL组细胞生长明显降低(P<0.01)。②与对照组相比,LPS100ng/mL、500ng/mL及1000ng/mL组细胞间缝隙连接功能明显降低(P<0.01)。③内毒素浓度与NRK52E细胞生长和细胞间缝隙连接传递数目呈负相关(r=-0.941,-0.872,P<0.01)。④与对照组比较,LPS10ng/mL组和LPS100ng/mL组的Cx43蛋白表达明显降低(P<0.05)。【结论】LPS对NRK52E细胞的生长呈浓度相关性的抑制,这种作用与细胞间缝隙连接功能有关。

高糖对肾小管上皮细胞泛素-核糖体蛋白52与TGF-β/Smad信号通路mRNA表达的影响

目的探讨高糖对肾小管上皮细胞泛素-核糖体蛋白(ubiquitin-ribosomal protein 52,UBA52)与TGF-β/Smad信号通路mRNA表达的影响及其UBA52在肾小管上皮细胞转分化中的作用与可能机制。方法根据培养基葡萄糖浓度不同分成葡萄糖低浓度组(5.6 mmol/L葡萄糖)、葡萄糖+甘露醇组(5.6 mmol/L葡萄糖+24.6 mmol/L甘露醇)、葡萄糖中浓度组(20 mmol/L葡萄糖)、葡萄糖高浓度组(30 mmol/L葡萄糖),分别干预48 h。观察不同糖浓度对鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)形态的影响;实时荧光定量PCR检测并比较不同葡萄糖浓度下UBA52、Smad7、转化生长因子β1(TGF-β1)与α-SMA mRNA水平。结果高糖可致NRK-52E向成纤维细胞转分化;葡萄糖低浓度组、葡萄糖+甘露醇组、葡萄糖中浓度组、葡萄糖高浓度组肾小管上皮细胞UBA52 mRNA的表达分别为(1.002±0.075)、(0.092±0.083)、(1.994±0.146)、(2.160±0.210),差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1的表达分别为(1.003±0.089)、(1.180±0.060)、(1.214±0.169)、(2.158±0.266),差异有统计学意义(P<0.05);Smad7mRNA表达分别为(1.002±0.078)、(1.106±0.049)、(0.952±0.044)、(0.332±0.110),差异有统计学意义(P<0.05);α-SMA mRNA表达分别为(1.002±0.007)、(1.046±0.091)、(1.720±0.032)、(2.885±0.254),差异有统计学意义(P<0.05);伴随着葡萄糖浓度的升高,UBA52、TGF-β1、α-SMA mRNA表达逐渐增加,而Smad7 mRNA的表达逐渐下降。UBA52与TGF-β1 mRNA表达量呈正相关(r=0.58,P<0.05),与Smad7mRNA表达量呈负相关(r=-0.61,P<0.05)。结论肾小管上皮细胞泛素前体UBA52、TGF-β1、α-SMA mRNA表达呈葡萄糖浓度依赖性增加,而Smad7基因表达呈葡萄糖浓度依赖性下降,UBA52可能参与了高糖环境下肾小管上皮细胞TGF-β/Smad信号通路的调控,实现肾小管上皮细胞转分化。

miR-30e*在顺铂诱导的肾近端小管上皮细胞凋亡和线粒体损伤中的作用

目的:观察顺铂诱导肾近端小管细胞损伤过程中mi R-30e*的表达变化,并探讨其在顺铂诱导的小管细胞凋亡和线粒体损伤中的作用。方法:实时定量PCR(q RT-PCR)检测顺铂处理后的小管细胞mi R-30e*的表达水平;使用重组慢病毒载体感染细胞,稳定高表达或低表达mi R-30e*;使用流式细胞仪检测细胞凋亡,观察mi R-30e*在顺铂诱导的小管细胞凋亡中的作用;q RT-PCR检测线粒体DNA(mt DNA)拷贝数,JC-1检测线粒体膜电位变化,探究mi R-30e*在顺铂引起的线粒体损伤中的作用。结果:1顺铂处理肾小管上皮细胞后,mi R-30e*的表达呈时间依赖性和剂量依赖性下调;2使用q RT-PCR检测重组慢病毒载体制备的稳定高表达或低表达mi R-30e*的小管细胞株中mi R-30e*的表达,过表达组增高了7倍,敲低表达组降低了近50%;3加入顺铂后,与对照组相比小管细胞凋亡增加,过表达mi R-30e*对凋亡起保护作用,敲低mi R-30e*则加重凋亡;4通过检测mt DNA的拷贝数发现顺铂诱导的线粒体损伤在48 h时有意义,迟于mi R-30e*表达的下调,线粒体膜电位检测JC-1提示过表达mi R-30e*对线粒体有保护作用。结论:顺铂处理小管细胞可降低其mi R-30e*的表达;体外过表达mi R-30e*对顺铂引起的小管细胞的凋亡和线粒体损伤具有保护作用,敲低mi R-30e*会加重顺铂诱导的肾近端小管细胞凋亡和线粒体损伤。

利格列汀对体外高糖诱导后人肾小管上皮细胞E-cadherin、α-SMA表达的影响及机制

目的探讨利格列汀对体外高糖诱导后人肾小管上皮细胞钙黏附蛋白E(E-cadherin)、肌动蛋白α(α-SMA)表达的影响及机制。方法将体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)随机分为正常对照组、高糖组、高糖+Wnt4 siRNA组、高糖+β-catenin siRNA组、高糖+利格列汀组,高糖+Wnt4 siRNA组、高糖+β-catenin siRNA组分别转染siRNA沉默Wnt4、β-catenin,12 h后与高糖组、高糖+利格列汀组同时加入D-葡萄糖(葡萄糖终浓度为30 mmol/L),高糖+利格列汀组同时加入利格列汀(终浓度10μmol/L),继续培养48 h。采用Western blotting法检测各组E-cadherin、α-SMA、Wnt4、β-catenin蛋白表达,倒置显微镜观察细胞形态学改变,测定细胞长与宽比值。结果与正常对照组比较,高糖组E-cadherin表达下调、α-SMA、Wnt4、β-catenin表达上调(P均<0.05);与高糖组比较,高糖+Wnt4 siRNA组、高糖+β-catenin siRNA组、高糖+利格列汀组E-cadherin表达上调、α-SMA表达下调(P均<0.05)。高糖组细胞由卵圆形伸长呈梭形,高糖+利格列汀组细胞由卵圆形向梭形改变程度减轻。高糖组细胞长/宽较正常对照组、高糖+利格列汀组升高(P均<0.05)。结论利格列汀可部分抑制体外高糖诱导的人肾小管上皮细胞E-cadherin表达下调、α-SMA表达上调,其机制可能与Wnt4/β-catenin通路有关。

化合物21(C21)抑制晚期糖基化终产物刺激引起的大鼠肾小管上皮细胞的细胞因子分泌

目的研究2型血管紧张素Ⅱ受体(AT2R)激动剂化合物21(C21)对晚期糖基化终产物(AGE)刺激的NRK-52E大鼠近端肾小管上皮细胞分泌的细胞因子的影响及潜在机制。方法培养NRK-52E细胞,分为正常对照组和(25、50、100、200)mg/L AGE-牛血清白蛋白(BSA)刺激组。培养48 h后收集细胞,采用实时定量PCR检测NRK-52E细胞白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的表达。间接ELISA检测细胞培养上清液中的IL-6、TNF-α蛋白水平。然后先用25 mg/L AGE-BSA刺激NRK-52E细胞48 h后分别给予(0.01、0.05、0.1)mmol/L C21分别处理24 h,采用实时定量PCR检测细胞蛋白激酶C(PKC)、核因子κB p65(NF-κB p65)及转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA的表达,Western blot法检测细胞中PKC、NF-κB p65、TGF-β1蛋白表达。结果不同剂量的AGE-BSA刺激NRK-52E细胞均可明显增加IL-6、TNF-α的mRNA表达,而以25 mg/L AGE-BSA刺激NRK-52E细胞时,其IL-6、TNF-α的蛋白分泌增加更明显。以25 mg/L AGE-BSA刺激NRK-52E细胞48 h后,(0.01、0.05、0.1)mmol/L C21分别处理24 h,均可显著抑制AGE-BSA所诱导的NRK-52E细胞PKC、NF-κB p65及TGF-β1 mRNA和蛋白的表达。结论AGE-BSA促进NRK-52E细胞IL-6、TNF-α、PKC、NF-κB p65及TGF-β1表达,C21则抑制其作用。

胆红素和内毒素联合作用对NRK52E细胞缝隙连接功能的影响

目的:观察胆红素(BR)和内毒素(LPS)联合作用对肾小管上皮细胞(NRK52E)生长及细胞间缝隙连接(GJ)的影响。方法:体外培养NRK52E细胞,不同浓度的BR和LPS联合干预,用MTT测量细胞生长;观察它们对生长融合细胞(有GJ形成)和生长未融合细胞(无GJ形成)集落形成的影响;采用细胞荧光免疫示踪法分析细胞间GJ的功能。结果:BR从17.1μmol/L增加至513μmol/L,可浓度依赖性地增加细胞生长;当BR浓度继续增加时,细胞生长逐渐降低。LPS(10-1 000μg/L)能浓度依赖性地降低NRK52E细胞生长。BR和LPS联合作用下,513μmol/L BR增加100μg/L LPS作用下的细胞生长(P<0.05),而684μmol/L BR降低100μg/L LPS的细胞生长(P<0.05);513μmol/L BR能增加100μg/L LPS作用下GJ传递数目(P<0.05),684μmol/L BR降低100μg/L LPS作用下的GJ传递数目。结论:BR和LPS联合作用时,513μmol/L BR降低LPS的细胞毒性,684μmol/LBR增加LPS的细胞毒性,其改变可能是通过细胞间缝隙连接发挥作用的。

miR-204-3p靶向CYP2E1介导脂多糖诱导的肾小管上皮细胞损伤

目的探讨miR-204-3p靶向细胞色素P450家族2亚家族E成员1(CYP2E1)介导脂多糖(LPS)诱导的肾小管上皮细胞炎症反应及细胞凋亡的分子机制。方法体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,qRT-PCR与Western blot分别检测miR-204-3p、CYP2E1的表达量;实验分组:Con组、LPS组、LPS+miR-NC组、LPS+miR-204-3p组、LPS+si-NC组、LPS+si-CYP2E1组、LPS+miR-204-3p+pcDNA组、LPS+miR-204-3p+pcDNA-CYP2E1组;ELISA检测IL-6、TNF-α的水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告实验验证miR-204-3p与CYP2E1的靶向结合关系;Western blot检测Bcl-2、Bax的表达量。结果与Con组比较,LPS组细胞中miR-204-3p的表达水平降低,CYP2E1的表达量升高,IL-6、TNF-α的水平升高,凋亡率和Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与LPS+miR-NC组比较,LPS+miR-204-3p组IL-6、TNF-α水平降低,凋亡率和Bax蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与LPS+si-NC组比较,LPS+si-CYP2E1组IL-6、TNF-α的水平降低,凋亡率和Bax蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-204-3p能够靶向结合CYP2E1;与LPS+miR-204-3p+pcDNA组比较,LPS+miR-204-3p+pcDNA-CYP2E1组IL-6、TNF-α的水平升高,凋亡率和Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-204-3p过表达可靶向调控CYP2E1的表达从而抑制LPS诱导的肾小管上皮细胞炎症反应及细胞凋亡。

前列腺素E1脂微球载体制剂对5／6肾切除大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的观察前列腺素E1脂微球载体制剂（Lipo-PGE1）对5／6肾切除大鼠肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化（EMT）的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、5／6肾切除模型组（模型组）和Lipo-POE1治疗组。使用Lipo-PGE1干预后第8周处死大鼠测定大鼠尿蛋白及肾功能，光镜观察肾组织病理改变，免疫组织化学法检测肾组织α-平滑肌肌动蛋白（mSMA）的表达。结果模型组大鼠24h尿蛋白排泄量、血尿素氮和血肌酐水平显著高于假手术组，肾小球和肾小管-间质病变显著，肾组织α-SMA表达明显增加；经过Lipo-PGE1治疗后，大鼠24h尿蛋白排泄量较模型组显著减少，肾功能明显改善，肾小球和肾小管-间质病变减轻，肾组织α-SMA表达较模型组显著下调。结论Lipo-PGE1能够显著下调5／6肾切除大鼠肾组织α-SMA表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，这可能是其肾脏保护作用机制之一。

维生素E对抗环磷酰胺对肾小管上皮细胞的毒性作用

目的研究维生素E抑制环磷酰胺所致肾小管上皮细胞毒性作用的影响。方法通过MTT和中性彗星实验,分别观察环磷酰胺单独或与维生素E联合应用时对肾小管上皮细胞生存率及DNA损伤的作用。结果与对照组相比,1、3mol/L环磷酰胺处理肾小管上皮细胞12h后可显著降低细胞生存率,并可造成细胞的DNA损伤(P<0.05);与环磷酰胺处理组相比,1mmol/L维生素E显著降低了环磷酰胺致肾小管上皮细胞DNA损伤的作用(P<0.05),但对环磷酰胺降低肾小管上皮细胞生存率的作用无明显影响(P>0.05)。结论维生素E对抗环磷酰胺致肾小管上皮细胞DNA损伤的作用。

前列腺素E1对尿酸所致人肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的观察前列腺素E1(PGE1)对尿酸所致人肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法取处于对数生长期的HK-2细胞随机分为5组:正常对照组、尿酸组(200、400、800μmol·L-1 UA)、尿酸+PGE1组。不同浓度的尿酸刺激HK-2细胞24、48、72 h,用MTT比色法检测细胞活性抑制率;不同浓度尿酸培养HK-2细胞24 h,用Annexin V FITC/PI流式细胞仪检测细胞凋亡率并检测细胞培养液NAG酶的活性,观察尿酸对HK-2细胞的毒性作用;并加入PGE1干预,探讨其对HK-2细胞的保护作用。结果尿酸作用HK-2细胞24 h后,与对照组比较,细胞凋亡率增加至(56.06±4.937)%(P<0.01),NAG酶释放量增加至(15.23±0.617)U·L-1(P<0.01)。加PGE1组,与同浓度单纯尿酸组比较,在不同时间点细胞活性抑制率均明显降低,凋亡率减少至(41.61±4.149)%(P<0.01);NAG酶释放量减至(11.24±0.468)U·L-1(P<0.01)。结论 1尿酸抑制HK-2细胞增殖和促进凋亡,增加其NAG酶的释放;2 PGE1对尿酸损害HK-2细胞有一定的保护作用。

ATP缺失时大鼠近端肾小管上皮细胞骨架重组与ERM蛋白的重分布相关

目的:探讨ATP缺失时大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E细胞)肌动蛋白细胞骨架重组情况及其可能机制。方法:用含0.1 μmol/L antimycin A的ATP缺失缓冲液处理培养的NRK52E细胞,建立细胞的体外ATP缺失模型;采用FITC标记的鬼笔环肽标记纤维型肌动蛋白(F-actin),用流式细胞仪检测技术分析肌动蛋白细胞骨架的重组情况;用Westernblot及免疫印迹技术检测ATP缺失后NRK52E细胞内骨架组分(Triton不溶组分)及上清组分(Triton可溶组分)中ERM(Ezrin/Radixin/Moesin)蛋白的分布改变。结果:体外ATP缺失模型建立,各实验组细胞内ATP浓度呈时间依赖性的下降(P<0.05);ATP缺失后,NRK52E细胞内纤维型肌动蛋白的量渐增,且肌动蛋白的聚合程度随ATP缺失时间延长而增加(P<0.05);ATP缺失后,ERM蛋白从细胞骨架解离进入胞浆,且ERM蛋白从细胞骨架的解离程度随ATP缺失的程度的增加而增加(P<0.05)。结论:ATP缺失后NRK52E细胞骨架重组可能与ERM蛋白的重分布相关。

miR-126-5p通过靶向Peli2影响糖尿病肾病肾小管上皮细胞上皮-间质转化发生

目的探讨微小RNA-126-5p(miR-126-5p)通过靶向pellino E3泛素蛋白连接酶家族成员2(Peli2)影响糖尿病肾病肾小管上皮细胞上皮-间质转化(EMT)发生的分子机制。方法本研究起止时间为2018年12月至2019年12月。体外培养人肾小管上皮细胞HK-2(美国ATCC),分别使用5 mmol/L、30 mmol/L的D-葡萄糖处理细胞48 h,分别记作对照组、模型组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测miR-126-5p、Peli2的表达水平。利用脂质体转染法分别将miR-126-5p寡核苷酸模拟物(miR-126-5p mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、Peli2小分子干扰RNA(si-Peli2)及其阴性对照(si-NC)转染至HK-2细胞,使用30 mmol/L的D-葡萄糖处理细胞48 h。Western blot检测上皮型钙黏蛋白(E-Cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、锌指蛋白(Snail)表达量;双荧光素酶报告实验验证miR-126-5p与Peli2的靶向关系。结果与对照组相比,模型组miR-126-5p[(1.00±0.10)比(0.32±0.03)]、E-Cadherin[(0.86±0.09)比(0.35±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05),Peli2[(0.42±0.04)比(1.05±0.11)]、N-Cadherin[(0.45±0.05)比(0.99±0.10)]、Vimentin[(0.32±0.03)比(0.92±0.09)]、Snail[(0.22±0.02)比(0.75±0.08)]的表达水平显著升高(P<0.05);转染miR-126-5p mimics,与转染miR-NC相比,E-Cadherin[(0.34±0.03)比(0.75±0.08)]的表达水平显著升高(P<0.05),N-Cadherin[(1.02±0.11)比(0.53±0.05)]、Vimentin[(0.95±0.10)比(0.48±0.05)]、Snail[(0.72±0.07)比(0.36±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05);转染si-Peli2后,与转染si-NC相比,E-Cadherin[(0.24±0.03)比(0.70±0.07)]的表达水平显著升高(P<0.05),N-Cadherin[(1.05±0.12)比(0.50±0.05)]、Vimentin[(0.96±0.10)比(0.38±0.04)]、Snail[(0.74±0.07)比(0.40±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05);miR-126-5p能够特异性结合Peli2,Peli2是miR-126-5p的靶基因;Peli2过表达后可明显逆转miR-126-5p过表达对高糖诱导的HK-2细胞EMT的影响。结论miR-126-5p通过靶向Peli2抑制糖尿病肾病肾小管上皮细胞EMT发生。

miR-27 a调控Sfrp1对肾小管上皮细胞EMT的影响

目的探讨高糖培养肾小管上皮细胞中miR-27 a调控分泌型卷曲相关蛋白1(Sfrp1)对细胞向间质细胞转分化(EMT)的影响。方法将NRK-52E细胞分为正常糖(NG组)和高糖(HG组)两组,利用RT-qPCR检测NRK-52E细胞中miR-27 a、Sfrp 1的表达情况,Western blot检测NRK-52E细胞中Sfrp1、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅳ型胶原(col-Ⅳ)的蛋白表达;将NRK-52E细胞分为野生型Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a mimics阴性对照组(wt Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a mnc组)、野生型Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a mimics组(wt Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a m组)、突变型Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a mimics阴性对照组(mt Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a mnc组)以及突变型Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a mimics组(mt Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a m),通过双荧光素酶报告基因检测系统检测萤火虫荧光值与海肾荧光值的比值,验证miR-27 a对Sfrp1表达的影响;在高糖诱导下,利用细胞转染实验将NRK-52E细胞设miR-27 a mimics阴性对照组(miR-27 a mnc组)、miR-27 a mimics组(miR-27 a m组)、miR-27 a inhibitor阴性对照组(miR-27 a inc组)以及miR-27 a inhibitor组(miR-27 a i组),通过RT-qPCR检测各组细胞中miR-27 a、Sfrp 1 mRNA的表达,Western blot检测各组细胞中Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白的表达水平。结果RT-qPCR结果显示,与NG组比较,HG组miR-27 a表达水平增高(P<0.05),Sfrp 1 mRNA表达水平降低(P<0.05);Western blot结果显示,与NG组比较,HG组α-SMA、col-Ⅳ蛋白水平增高(P<0.05),Sfrp1、E-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.05);荧光素酶报告基因显示,wt Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a m组荧光素酶活性明显低于wt Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a mnc组(P<0.05),而mt Sfrp 1-3′UTR+miR-27a mnc组与mt Sfrp 1-3′UTR+miR-27 a m组荧光素酶活性未见明显变化(P>0.05);细胞转染RT-qPCR结果显示,与miR-27 a mnc组比较,miR-27 a m组miR-27 a表达增加(P<0.05),而Sfrp 1 mRNA表达降低(P<0.05);与miR-27 a inc组比较,miR-27 a i组miR-27 a表达降低(P<0.05),而Sfrp 1 mRNA表达增加(P<0.05);Western blot结果显示,与miR-27 a mnc组比较,miR-27 a m组α-SMA、col-Ⅳ蛋白表达增加(P<0.05),Sfrp1、E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05);与miR-27a inc组比较,miR-27 a i组α-SMA、col-Ⅳ蛋白表达降低(P<0.05),Sfrp1、E-cadherin蛋白表达增加(P<0.05)。结论miR-27 a可以通过抑制Sfrp1的表达促进肾小管EMT,参与糖尿病肾病肾纤维化的发生。

温莪术对TGF-β_1诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响

目的探讨温莪术对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞转分化(epithelial-myofibroblast transdifferentiation,EMT)拮抗作用。方法将体外培养的正常肾小管上皮细胞随机分为6组:正常对照组(C组)、TGF-β1诱导模型组(T组)、温莪术低浓度组(E1组)、温莪术中浓度组(E2组)、温莪术高浓度组(E3组)、盐酸贝那普利组(Y组),除C组外,各组TGF-β1诱导24h后,温莪术各剂量组及Y组加入药物作用48h。运用倒置显微镜观察细胞形态的改变,细胞免疫荧光法、RT-PCR法及ELISA法检测各组NRK-52E细胞EMT过程中细胞骨架成分β-肌动蛋白(β-actin)的分布,α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmus-cleactin,α-SMA)mRNA、E钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)mRNA表达,纤维粘连蛋白(fibro nectin,FN)浓度。结果 TGF-β1诱导3天后,T组细胞出现肥大、拉长,呈梭形,细胞骨架结构β-actin表达增多(P<0.05),胞浆内出现束状纤维样结构,细胞内α-SMA mRNA表达显著上调(P<0.05),E-cadmRNA表达降低(P<0.05),细胞上清液中FN浓度升高(P<0.05)。与T组比较,E1-3组细胞仅见部分呈成纤维样改变,伴随胞浆内β-actin表达及FN浓度的降低(P<0.05),E2-3组细胞内α-SMA mRNA表达升高(P<0.05),E-cadmRNA表达减少(P<0.05),但E1组E-cad及α-SMA mRNA表达量与之比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与E1组比较,E2-3组胞浆内β-actin蛋白表达及FN浓度降低(P<0.05),E3组细胞内E-cadmRNA表达升高伴α-SMA mRNA表达降低(P<0.05)。与Y组比较,E1组细胞浆内β-actin mRNA及细胞上清液中FN浓度均升高(P<0.05),E3组β-actin表达升高(P<0.05),E-cad mRNA表达降低(P<0.05),E1-3α-SMA mRNA表达量则差异无统计学意义(P>0.05)。结论温莪术可抑制TGF-β1诱导的EMT发生,可作为临床治疗慢性肾功能不全的有效药物之一。

姜黄素减轻泛影葡胺引起的大鼠肾小管上皮细胞损伤作用的研究

目的探讨姜黄素(CMN)对泛影葡胺所致的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)损伤的保护作用及其机制。方法将培养的NRK52E细胞分组,分别与泛影葡胺/CMN/锌原卟啉Ⅸ(ZnppⅨ)等进行孵育,测定各组细胞活力、培养液中丙二醛(MDA)含量、细胞凋亡率及HO-1表达量。结果泛影葡胺呈时间依赖性和剂量依赖性抑制NRK52E细胞活力(P<0.05),并显著增加细胞氧化应激损伤和细胞凋亡率(P<0.05);CMN能呈剂量依赖性诱导NRK52E表达HO-1(P<0.05),并能显著减轻泛影葡胺对NRK52E的损伤,降低细胞凋亡率(P<0.05)。加用ZnppⅨ可抑制CMN所诱导的HO-1表达并消除CMN对NRK52E的保护作用(P<0.05)。结论泛影葡胺可导致NRK52E氧化应激损伤,促进细胞凋亡。CMN能通过上调HO-1表达,显著减轻泛影葡胺所致的NRK52E氧化应激损伤,抑制细胞凋亡。

萝卜硫素对肾小管上皮细胞氧化应激及Nrf2/HO-1信号通路的影响

目的:探讨萝卜硫素(SFN)对肾小管上皮细胞(HK-2)的氧化应激及核转录因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶(HO)-1信号通路的影响。方法:体外培养HK-2细胞,将细胞分为空白对照组、H_2O_2处理组、H_2O_2+10μmol·L^(-1)SFN组、H_2O_2+20μmol·L^(-1)SFN组和H_2O_2+40μmol·L^(-1)SFN组;测定HK-2细胞中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、谷胱甘肽(GSH)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活性;RT-PCR和Western Blot法分别检测Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表达水平。结果:与空白对照组相比,H_2O_2处理组中MDA、NO含量明显升高,GSH水平和SOD酶活性显著降低(P<0.05);经高、中、低3种浓度的萝卜硫素处理后MDA、NO含量显著降低,GSH水平显著升高,SOD酶活性也显著升高,Nrf2和HO-1mRNA及蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论:萝卜硫素有抗HK-2细胞氧化应激损伤的作用,其作用机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路有关。