邻近标记技术在膜蛋白相互作用中的研究进展

膜蛋白是细胞多种生命活动的主要承担者,膜蛋白之间的相互作用参与调控细胞间的接触与信号传递,并与细胞的分化、成熟息息相关。因此,开发多种深入解析膜蛋白之间相互作用的方法具有重要的理论与现实意义。除了传统的免疫共沉淀方法之外,新开发的邻近标记技术已经逐渐成为了研究膜蛋白相互作用的重要手段。邻近标记技术主要利用生物工具酶标记与诱饵蛋白相互作用的邻近蛋白,并通过流式细胞术、质谱以及共聚焦显微成像技术等方法检测膜蛋白之间的相互作用。本文着重介绍了近些年来新开发的用于研究膜蛋白相互作用的多种邻近标记技术,并展望了该类技术在膜蛋白相互作用领域未来的发展前景。

跨膜蛋白TMEM家族在人类生殖系统中作用的研究进展

跨膜蛋白TMEM家族广泛分布于细胞质膜和细胞器膜,参与调控多种病理生理过程。目前研究发现,TMEM家族在人类生殖系统中也发挥着关键作用,能够参与调节精子发生、精卵融合、子宫内膜容受性、肿瘤侵袭和迁移等,参与多种疾病的发生发展。深入研究TMEM家族在人类生殖系统中的作用对于进一步理解TMEM家族的生物学功能具有重要的意义。

跨膜蛋白IRE1α参与系统性红斑狼疮发病的研究进展

系统性红斑狼疮(SLE)是一种复杂的全身性自身免疫疾病。目前已知该疾病是遗传、感染、环境等因素共同作用的集合体,各种免疫细胞、炎症细胞因子以及异常的信号通路参与其中。然而,现有的研究对其病因的认识仍存在很大程度的局限性。肌醇需要酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)是一种内质网(ER)I型跨膜蛋白,几乎表达于所有哺乳动物的细胞和组织,具有胞质激酶和核糖核酸酶活性,是ER应激的压力感受器,与造成免疫紊乱的多种生理和病理条件有关,多项研究已证明其在自身免疫性疾病中发挥着关键作用。本文主要围绕IRE1α如何参与SLE发生发展作一综述。

融合标签技术在膜蛋白结构研究中的应用

膜蛋白高级结构的研究包括不同的层次,即膜蛋白拓扑学结构的研究、利用核磁共振技术和蛋白质晶体衍射技术对三维结构的研究,以及膜蛋白复合体的研究。在研究过程中,如果能够基于膜蛋白的拓扑学结构预测,选择合适的蛋白质或多肽融合标签,利用基因融合技术在基因水平上对膜蛋白进行改造,可以产生含有融合标签的重组膜蛋白,不仅具有原有膜蛋白的功能活性,还具有融合标签所特有的生理生化特性,将会极大地促进膜蛋白结构和功能的研究。我们就目前膜蛋白结构研究中所涉及的融合标签技术及其应用策略和所取得的进展做一简述。

溶酶体相关膜蛋白3通过VEGF/AKT通路抑制PC-3细胞增殖、转移及血管生成

目的探索LAMP3对PC-3细胞增殖、迁移及血管生成的影响。方法Western blot(WB)及RT-PCR检测LAMP3在正常前列腺上皮细胞及前列腺癌骨转移细胞中的表达。构建稳定沉默LAMP3的PC-3细胞,分别使用CCK8、划痕试验、Transwell试验检测LAMP3对PC-3细胞增殖、迁移与侵袭的影响。通过ELISA及血管生成试验检测血管内皮生长因子VEGF、基质金属酶MMP9的表达及HUVEC细胞的血管生成,最后使用WB及RT-PCR检测VEGF、AKT/p-AKT的表达。结果LAMP3在前列腺癌细胞中的表达较正常前列腺上皮细胞明显升高,以PC-3细胞最明显(P<0.05)。沉默LAMP3能抑制PC-3细胞的增殖、迁移与侵袭能力,同时能抑制VEGF、MMP9的表达及PC-3细胞诱导的血管生成,差异有统计学意义(P<0.05)。此外,LAMP3能下调PC-3细胞中VEGF、AKT/p-AKT的表达。结论LAMP3能通过调控VEGF/AKT通路影响PC-3细胞的增殖、转移和血管生成,LAMP3可能是前列腺癌骨转移的潜在治疗靶点之一。

跨膜蛋白家族基因在肝癌患者中的预后模型构建评估

目的探讨跨膜蛋白(TMEM)家族基因对肝癌患者的预后价值,构建肝癌患者生存预后预测模型。方法筛选与肝癌患者预后相关的TMEM家族基因,采用LASSO回归模型构建预后预测模型,外部队列予以验证;基于风险评分和临床特征构建Nomogram图并验证其预测效能。结果纳入7个TMEM家族基因构建风险预测模型,低风险组肝癌患者预后显著优于高风险组。Cox回归分析结果显示该风险评分是肝癌患者预后的独立危险因素。基于风险评分构建的Nomogram图预测结果具有良好的契合度和应用价值。结论基于TMEM家族基因的预测模型可以很好地预测肝癌患者预后,为临床早期识别预后不良的肝癌患者提供一定理论依据。

培养时间对小鼠树突状细胞及其外泌体免疫相关膜蛋白的影响

目的明确培养时间对树突状细胞及其外泌体免疫相关膜蛋白(CD80、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ)的影响,为今后相关研究提供实验依据。方法小鼠骨髓细胞经重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)诱导分化成树突状细胞,再加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导为成熟树突状细胞;超速离心法提取外泌体;蛋白印迹法和Amnis量化成像流式细胞仪对外泌体进行鉴定;Amnis量化成像流式细胞仪检测小鼠树突状细胞以及树突状细胞外泌体膜上免疫相关蛋白CD80、CD11c、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达情况。结果体外培养第5天后,约50%以上的树突状细胞表达CD80、CD11c、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ,第13天达最高水平,其中CD80阳性率为(97.29±0.63)%,CD11c阳性率为(92.31±1.18)%,MHC-Ⅰ阳性率为(97.91±0.49)%,MHC-Ⅱ阳性率为(97.91±0.49)%,差异具有统计学意义(P<0.001)。第13天后逐渐减少,至第30天,仍有约80%的树突状细胞表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ免疫分子。外泌体膜上CD80、CD11c、和MHC-Ⅱ表达水平以第5天最高,然后随培养时间延长,总体呈下降趋势,除外MHC-Ⅰ分子,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论体外培养的小鼠树突状细胞表达较高的免疫相关膜蛋白,在合适的培养条件下可长时间稳定维持。其分泌的外泌体表面也携带有丰富的免疫相关膜蛋白,但树突状细胞与外泌体膜表面的免疫相关蛋白未发现明显相关性。

跨膜蛋白VRAC的结构及生物学功能研究进展

跨膜蛋白是一类位于细胞膜上的重要蛋白质,对于维持细胞稳态和调节细胞的生长发育具有关键作用,因此一直受到广泛研究。本文将介绍一种重要的跨膜蛋白——体积调节阴离子通道(Volume Regulated Anion Channel,VRAC),并全面综述其分子结构特征和多个生理功能,旨在为后续研究工作提供参考。

枯草芽孢杆菌YQ-1降解玉米赤霉烯酮膜蛋白酶的提取及性质分析

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一类常见于发霉谷物、饲料中的真菌毒素,具有生殖、遗传和致癌性等危害,在世界各地的谷物中常超标检出。本课题组前期筛选得到一株高效降解ZEN的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis YQ-1,全细胞催化12 h后ZEN(20μg/mL)的降解率达98.36%。根据降解酶的细胞定位,推测ZEN降解酶定位于细胞膜表面。本实验以ZEN降解率为指标,提取YQ-1细胞膜表面ZEN降解酶蛋白,结合氨基酸序列分析,推测可能的降解酶。结果显示,以辛基-β-葡萄糖苷(OG)、十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)、Triton X-100和Triton X-114作为膜蛋白提取剂比NaCl和尿素提取的蛋白量显著增加,但提取的膜蛋白酶ZEN降解活性较差,以丁醇为提取剂提取得到的水相蛋白粗酶液在12h内对20μg/mLZEN的降解率为64.09%,粗酶液蛋白含量为9.86μg/mL,酶活为0.43 U。该降解酶的提取为后续的ZEN降解酶挖掘奠定了实验基础,枯草芽孢杆菌及其ZEN降解酶的研究为霉菌毒素的体外脱毒提供支撑。

过氧化物酶体膜蛋白4通过细胞外信号调节激酶1/2信号通路促进肝细胞癌细胞的上皮间质转化

目的:探讨过氧化物酶体膜蛋白4(PXMP4)对肝细胞癌(HCC)细胞迁移和侵袭及上皮间质转化(EMT)进程的影响。方法:采用生物信息学和免疫组织化学方法分析HCC组织中PXMP4的表达,分析其与患者临床病理特征的相关性。在HCCLM3和MHCC97H细胞中干扰PXMP4,在Huh7和MHCC97L细胞中过表达PXMP4,利用WB和qPCR法验证干扰/过表达效率。利用CCK-8、划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测干扰/过表达PXMP4对HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,采用WB法检测干扰/过表达PXMP4或0、5、10和20μmol/L U0126处理对HCC细胞中N-cadherin、E-cadherin、vimentin、细胞外信号调节激酶(ERK)、p-ERK表达的影响。结果:生物信息学和免疫组织化学分析显示,HCC组织中PXMP4呈高表达(P<0.05)。临床病理分析发现,PXMP4的表达与肿瘤分化程度有关联(P<0.05)。在HCC细胞中,干扰PXMP4后抑制细胞增殖、侵袭和EMT进程(P<0.05);反之,过表达PXMP4后促进HCC细胞增殖、侵袭及EMT进程(P<0.05)。此外,PXMP4通过激活ERK1/2信号通路促进HCC细胞EMT进程,U0126处理同样能够抑制HCC细胞EMT进程。结论:PXMP4在HCC组织中呈高表达且与HCC细胞分化有关联,PXMP4通过激活ERK1/2信号通路促进HCC细胞EMT进程。

小鼠抗寨卡病毒包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体的制备

目的制备小鼠抗寨卡病毒(ZIKV)包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体。方法首先构建ZIKV Eecto的原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,将其转化至大肠杆菌感受态BL21后,利用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。重组Eecto蛋白以包涵体形式表达,经过变性、复性和超滤获得纯化的蛋白。将Eecto蛋白3次免疫后,获得多克隆抗体血清,进行效价测定,并利用ZIKV prME真核表达质粒转染的HEK293T细胞进行Western blot法和免疫荧光法分析。取效价较高的小鼠脾脏制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法获取分泌抗体的杂交瘤细胞,并进一步制备腹水。对腹水进行抗体效价测定、亚类分析。以ZIKV同属病毒日本脑炎病毒(JEV)、黄热病病毒(YFV)、登革病毒1-4(DENV1-4)、蜱传脑炎病毒(TBEV)的Eecto为包被抗原,利用ELISA分析ZIKV单克隆抗体的交叉反应性,进一步对效价高、特异性强的抗体进行特异性分析。结果成功构建了原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,并获得纯化的Eecto蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性;制备筛选得到1D6、4F11、4H7、4F8四株单克隆抗体,其中三株(1D6、4H7、4F8)为IgGκ型抗体,一株(4F11)为IgMκ,1D6腹水效价大于1∶108;其中1D6和4H7为ZIKV特异性抗体,与其他黄病毒无交叉反应。结论成功制备了小鼠抗ZIKV Eecto单克隆抗体,为后续建立ZIKV检测方法及致病机制研究提供了实验材料。

尼氟灭酸抑制跨膜蛋白16A参与高肺血流量诱导的肺动脉高压的机制研究

目的:探讨钙激活的氯离子通道(CaCCs)抑制剂尼氟灭酸(NFA)和跨膜蛋白16A(TMEM16A)在高肺血流量诱导的肺动脉高压(PAH)中的作用及机制。方法:将40只SD大鼠随机分为normal组、sham组、model组及model+NFA组,sham组使用血管夹夹闭腹主动脉15 min,model组采用腹主动脉—下腔静脉造瘘术建立左向右分流型PAH模型,model+NFA组在造瘘术后予NFA进行每日灌胃;饲养12周后,检测大鼠平均肺动脉压、肺动脉血管张力,并采用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法(western blotting)检测各组肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)TMEM16A的表达。结果:model组和model+NFA组大鼠肺动脉环收缩率及TMEM16A m RNA和蛋白表达水平显著高于normal组(P<0.05)。与model组比较,model+NFA组大鼠TMEM16A mRNA和蛋白表达水平降低,肺动脉环收缩率下降(P<0.05)。结论:高肺血流量诱导的PAH与TMEM16A高表达有关,NFA可以降低肺动脉血管张力,抑制TMEM16A的过表达。

拟南芥膜蛋白与AtGSL5互作筛选研究

通过构建拟南芥膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,筛选ATGSL5互作蛋白,为探究压力胁迫下植物调控胼胝质合成的信号途径提供参考.通过提取整株拟南芥RNA,分离出mRNA.以mRNA为模板,利用SMART技术成功合成双链cDNA,将双链cDNA和pPR3-N载体用T4 DNA连接酶进行连接.连接产物电转化到HST08感受态细胞,构建拟南芥膜蛋白酵母双杂交cDNA文库并进行质量检测.结果表明,总库容量达到3×10^(7)cfu,重组率为100%,符合膜蛋白酵母双杂交实验要求.利用该文库筛选到了ATGSL5互作蛋白AT5G43460.

基于生物信息学分析跨膜蛋白132A在肝癌中的表达及其临床意义

目的:基于公共数据库探究跨膜蛋白132A(TMEM132A)在肝癌中的表达模式及临床意义。方法:利用肿瘤基因组图谱并基于基因表达数据库优选其中的GSE14520、GSE60502数据集分析TMEM132A在肝癌与癌旁组织中的m RNA表达水平,及与临床因素的相关性。通过HPA数据库获取TMEM132A在组织中的免疫组织化学结果。利用Kaplan-Meier法探讨TMEM132A与患者预后的相关性。运用受试者操作特征曲线探究TMEM132A是否可以作为诊断指标。通过癌症药物敏感基因组学预测TMEM132A对化疗药物的药物敏感性。通过单样本GSEA、TIMER、STORMAL SCORE和免疫检查点热图,对TEME132A进行免疫分析。linkedomics网站用于对TMEM132A差异基因进行基因集富集分析。利用STRING数据库预测TMEM132A的互作蛋白。结果:TMEM132A在肝癌组织表达显著高于癌旁组织(P<0.05),定位于胞浆、胞膜。TMEM132A高表达与肿瘤分期、分级、甲胎蛋白水平和体重显著正相关。TMEM132A高表达提示患者预后不良,可作为准确的诊断指标。TMEM132A对多种化疗药物敏感,且被多种免疫细胞浸润,可以作为药物治疗及免疫治疗的研究靶点。癌组织中TMEM132的启动子甲基化水平显著降低。TMEM132A影响细胞黏附,脂肪酸代谢等信号通路。结论:TMEM132A在肝癌中高表达,与患者预后不良正相关。

膜蛋白原位成像研究进展

膜蛋白是细胞膜的重要组成成分,在信号传导、物质运输、能量交换等细胞基本生理活动中发挥着至关重要的作用。膜蛋白表达量、结构、功能等的异常与恶性肿瘤等多种疾病密切相关,膜蛋白一直是化学、生物学、医学等领域的重点研究对象。发展原位的膜蛋白表达量、空间分布和组织结构成像技术是深入了解膜蛋白作用机制及细胞生理活动分子基础的重要前提。近年来,研究人员发展了系列膜蛋白原位成像技术,包括荧光成像、电化学发光成像、表面增强拉曼散射成像等,这些成像技术在膜蛋白的结构和功能研究中发挥了重要作用。该文对近年来膜蛋白原位成像领域的研究进展进行综述,总结了代表性的膜蛋白原位成像技术,并对该领域存在的挑战及发展方向进行了讨论。

跨膜蛋白16A及其抑制剂的研究进展

跨膜蛋白16A(TMEM16A)是一种具有电压依赖性的钙激活氯离子通道,广泛表达于癌细胞中。在多种癌症中,TMEM16A不仅可以调控癌细胞的增殖、侵袭和转移,还与癌症治疗的预后相关。近年来,TMEM16A以及TMEM16A抑制剂在癌症领域的相关研究不断深入。本文总结了近10年来的相关研究,旨在为今后TMEM16A抑制剂在癌症治疗中的临床应用提供新的治疗策略。

三阴性乳腺癌组织中微RNA-331-3p和跨膜蛋白119水平变化与临床预后的相关性

目的探究三阴性乳腺癌(TNBC)组织中微RNA-331-3p(miR-331-3p)和跨膜蛋白119(TMEM119)水平变化与临床预后的相关性。方法选取2017年1月至2019年1月在信阳市中心医院行手术治疗的98例TNBC病人的癌组织以及癌旁组织,分别作为TNBC组和癌旁组。在术后3年对所有病人进行随访,分为预后良好组为23例,预后不良组为75例。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-331-3p和TMEM119的表达水平;采用Pearson法分析TNBC组织中miR-331-3p和TMEM119表达水平的相关性;分析miR-331-3p和TMEM119水平与TNBC病人预后的关系;影响TNBC病人预后的影响因素采用Cox回归的方法进行分析。结果TNBC组TMEM119(1.53±0.24)的表达水平与癌旁组相比(1.01±0.13)显著上升,miR-331-3p(0.74±0.13)的表达水平与癌旁组(1.02±0.11)相比显著下降(t=41.53、41.53,P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,miR-331-3p和TMEM119表达水平呈负相关关系(r=−0.49,P<0.001)。miR-331-3p和TMEM119表达水平与肿瘤长径、TNM分期、腋窝淋巴结转移有关(P<0.05)。miR-331-3p高表达组病人3年内生存率16/49(32.65%)高于低表达组7/49(14.29%);TMEM119高表达组病人3年内生存率4/49(8.16%)低于低表达组19/49(38.78%)(Z=4.60,P=0.032;Z=12.78,P<0.001)。预后不良组miR-331-3p(0.65±0.13)表达水平与预后良好组(1.03±0.12)相比显著降低,TMEM119(1.69±0.27)表达水平与预后良好组(1.02±0.14)相比显著升高(t=38.74、33.30,P<0.05)。结果显示,TNM分期(HR=5.88)、miR-331-3p(HR=2.45)和TMEM119(HR=2.86)表达水平是影响TNBC病人预后的危险因素(P<0.05)。结论TNBC病人癌组织中miR-331-3p低表达,TMEM119高表达,二者水平与预后评估密切相关。

胎盘绒毛跨膜蛋白CD81、Ang与复发性流产女性早孕期复发流产的关系

目的:探究胎盘绒毛跨膜蛋白CD81、血管生成素(Ang)与复发性流产(RSA)女性早孕期复发流产的关系。方法:选择126例RSA患者为研究对象(RSA组),另选取94例正常早孕行人工流产术者为对照组。采用RT-qPCR、Western blot法检测胎盘绒毛组织CD81、Ang-1、Ang-2 mRNA及蛋白表达水平,采用电化学发光法检测血清人绒毛膜促性腺激素(HCG)水平,计算Ang-1/Ang-2 mRNA及蛋白比值,比较两组患者检测结果。结果:RSA组CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA及蛋白表达和Ang-1/Ang-2 mRNA及蛋白表达比值均高于对照组,血清HCG水平低于对照组(P<0.05)。RSA组CD81 mRNA与Ang-1、Ang-2 mRNA呈正相关(P<0.05);RSA组CD81蛋白表达量与Ang-1、Ang-2蛋白表达量呈正相关(P<0.05),血清HCG水平与其他指标无相关性(P>0.05)。CD81、Ang-1/Ang-2的mRNA及蛋白和血清HCG均可用于预测RSA女性早孕期复发流产。结论:RSA女性早孕期复发流产与胎盘绒毛CD81、Ang-1、Ang-2 mRNA及蛋白表达量异常高表达有关,CD81、Ang-1、Ang-2可能影响胎盘血管形成而致流产。

膜蛋白三维结构研究的新突破——线粒体呼吸链膜蛋白复合物Ⅱ结构解析

由清华大学-中科院生物物理所结构生物学联合研究小组完成的“线粒体呼吸链膜蛋白复合物II的晶体结构”研究成果以Article的方式发表在2005年7月1日出版的Cell上。本文介绍了该项成果的研究背景、意义、主要创新点及方法。

膜蛋白与膜蛋白组学

膜蛋白是指能够结合或整合到细胞或细胞器的膜上的蛋白质的总称。现在市场上销售的药物80%以上都是作用在膜蛋白上的,膜蛋白是理想的药物靶点,因此,对膜蛋白的研究具有十分重要意义。但由于膜蛋白的溶解、分离、鉴定十分困难,造成膜蛋白组学研究的滞后。本文就膜蛋白的结构,膜蛋白在细胞生理和人类疾病中扮演的重要角色,膜蛋白作为药物靶点的潜力以及膜蛋白组学研究技术作一综述。