自杀基因系统HSV1-TK/GCV对MEC-1细胞的体外杀伤及诱导凋亡作用

目的 :探讨HSV TK/GCV系统对MEC 1细胞的体外作用。方法 :用脂质体介导将含有HSV 1 TK全长cDNA的真核表达质粒G1NATK转染人黏液表皮样癌细胞系MEC 1,经G418筛选 ,挑选阳性克隆 ,用PCR及RT PCR检测目的基因的整合及mRNA转录 ;分别用MTT及细胞记数法检测TK阳性细胞对GCV的体外敏感性及旁观者效应 ;用倒置显微镜、HE染色、活细胞荧光染色及TUNNEL染色观察GCV作用下MEC 1/TK的形态学变化。结果 :PCR及RT PCR分别从G418阳性克隆中成功扩增出 40 4bp的特异性基因片段 ,将此G418抗性克隆命名为MEC 1/TK ;IC50 MEC 1/TK为 0 .7μg/ml,而MEC 1为 10 0 0 μg/ml以上 ;当将TK阳性细胞和TK阴性细胞以不同比例混合 ,TK阳性细胞只占 10 %时 ,即有 90 %的细胞被杀死 ;形态学观察表明 ,经GCV作用 ,MEC 1/TK细胞变圆、脱壁、漂浮 ,部分细胞呈现核浓缩、核碎裂等特征 ,TUNNEL染色核阳性着色细胞明显增多。结论 :HSV TK/GCV系统在体外能明显杀伤MEC 1细胞 ,对GCV的敏感性比未转染的亲本细胞提高 10 0 0倍以上 ,并显示较强的旁观者效应 ;GCV可诱导部分MEC

癌胚抗原相关细胞黏附分子6-shRNA及双自杀基因yCDglyTK的联合基因载体构建

目的构建新型靶向联合双自杀基因载体pCDNA3.1-yCDglyTK-CEACAM6-shRNA。方法根据已知的癌胚抗原相关细胞黏附分子6(Carcinoembryonic antigen associated cell adhesion molecule 6,CEACAM6)序列构建含有hU6启动子和CEACAM6-shRNA表达框的重组质粒,并将CEACAM6-shRNA表达框(含hU6启动子)通过双酶切方式亚克隆至双自杀基因载体pCDNA3.1-yCDglyTK,构建新型靶向联合双自杀基因载体pCDNA3.1-yCDglyTK-CEACAM6-shRNA。通过酶切、测序等鉴定重组质粒。结果实验所构建的最终载体酶切产物所得的片段大小为7.5 kb,与预期片段一致。测序证实最终载体与pCDNA3.1-yCDg-lyTK-CEACAM6-shRNA序列一致。结论成功构建新型靶向联合双自杀基因载体pCDNA3.1-yCDg-lyTK-CEACAM6-shRNA。

新型纳米转染试剂转染PNP自杀基因体外杀伤实验

将壳聚糖纳米粒包裹的报告基因pEGFP-N1质粒转染至HEK293细胞,并在HEK293细胞中成功表达荧光蛋白的基础上,进一步将本室自行构建的PNP基因的真核高效表达载体质粒pcDNA3-PNP转染至HEK293细胞。转染72h后,对转染的HEK293细胞给予前体药6-MPDR至终浓度40μg/ml,一天后,采用MTT比色法测定药物对细胞增值的影响,并进行统计学处理。实验结果表明采用壳聚糖纳米粒转染试剂转染并给予前体药6-MPDR的实验组活细胞数,与用壳聚糖转染但不给前体药6-MPDR的对照组活细胞数相比,有显著差异(P<0.05),说明新筛选出的壳聚糖纳米粒转染试剂可以将PNP自杀基因递送至靶细胞中,并在细胞中进行表达,从而使PNP/6-MPDR自杀基因系统发挥杀伤细胞的作用。分别采用相同工作浓度的脂质体与壳聚糖纳米粒转染试剂转染相同浓度的基因质粒,壳聚糖纳米粒对靶细胞生长数量影响很小,说明的壳聚糖纳米粒细胞毒性大大低于阳离子脂质体的细胞毒性。

脑胶质瘤自杀基因疗法研究进展

自杀基因疗法是近年来备受关注的一种治疗胶质瘤的方法 ,可分为单自杀基因疗法和融合基因疗法 .本文对这两种自杀基因疗法的原理及其在治疗胶质瘤中的运用进行综述 ,并介绍了其临床运用和进一步发展方向 .胶质瘤 (glioma)是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤 ,其传统治疗以手术为主 ,辅以放疗、化疗等辅助治疗 ,疗效欠佳 .基因治疗 (genetherapy)作为治疗胶质瘤的一种新的辅助手段 ,逐渐受到人们的重视和关注 .自杀基因疗法 (suicidegenetherapy)是众多基因治疗策略中疗效最明显的一种 ,也是最有前途的治疗策略之一 .

CDglyTK自杀基因系统治疗小鼠慢性粒细胞白血病皮下移植瘤的研究

为了探讨逆转录病毒介导的CDglyTK自杀基因系统对K562细胞的体内外杀伤作用,将逆转录病毒介导的CDglyTK自杀基因转染入K562细胞,体外实验用MTT法观察5-氟胞嘧啶/丙氧鸟苷(5-fluorocytosine/ganciclovir,5-FC/GCV)对K562/CDglyTK细胞的生长抑制率。体内实验时将K562/CDglyTK细胞和K562细胞接种于裸鼠皮下,使用GCV和5-FC后,观察裸鼠肿瘤体积的变化及裸鼠的生存率。体外实验表明,GCV联合5-FC对K562/CDglyTK细胞具有明显的杀伤作用;体内实验结果显示,皮下注射K562细胞和K562/CDglyTK细胞后小鼠成瘤率无明显区别;使用5-FC/GCV可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成;经5-FC/GCV治疗后K562/CDglyTK组的肿瘤体积较对照组明显缩小,裸鼠生存率也较对照组明显提高。结论:双自杀基因在体内外对K562细胞均有杀伤作用。

腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌

目的探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌治疗作用并与单基因系统作比较。方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒作载体,PCR检测CD、TK及E1基因。建立C57BL/6同系膀胱癌Mb49皮下移植瘤模型,观察肿瘤注射腺病毒联合丙氧鸟苷(GCV)或/和5-氟胞嘧啶(5-FC)治疗后肿瘤体积及组织学变化。结果PCR可检测到腺病毒DNA中含CD及TK基因、无E1基因。腺病毒注射联合GCV、5-FC、GCV+5-FC治疗后,肿瘤体积与对照组相比明显缩小(P=0.00),腺病毒注射联合GCV+5-FC有协同作用(P=0.04),优于腺病毒注射联合GCV以及腺病毒注射5-FC。基因治疗后肿瘤细胞大片坏死,对照组细胞形态无变化。结论腺病毒介导CD-TK融合双自杀基因联合GCV或/和5-FC能有效治疗膀胱癌,融合双自杀基因CD-TK/(GCV+5-FC)系统对膀胱癌治疗有协同作用,其效果优于CD-TK/GCV或CD-TK/5-FC系统。

逆转录病毒载体介导HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建

[目的]探讨自杀基因抗肿瘤系统构建的方法.[方法]用DNA重组技术将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1 tk)定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN,并用限制性内切酶进行酶切及测序鉴定;用PolyFect Transfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67,通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将病毒感染人胃癌细胞,检测HSV1 tk自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应.[结果]经酶切鉴定和DNA序列测定,证明HSV1 tk基因成功定向插入到pLXSN载体中;重组病毒DNA转染包装细胞,筛选出对G418具稳定抗性的克隆PT67/tk,扩大培养,获取病毒滴度为4×104cfu/mL的重组逆转录病毒培养液;感染胃癌细胞SGC 7901后再筛选出G418抗性克隆株SGC 7901/tk.丙氧鸟苷(GCV)对SGC 7901/tk有明显杀伤作用,对SGC 7901无明显毒性,证明该病毒表达HSV1 tk基因,表达产物具有生物活性.[结论]将HSV1 tk定向克隆入逆转录病毒载体的方法可成功获取表达HSV1 tk基因的逆转录病毒,成功建立了肿瘤自杀基因治疗系统,这将为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础.

六味地黄丸含药血清对自杀基因治疗黑色素瘤增效作用的缝隙连接机制初探

目的探讨六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞增效作用的缝隙连接机制。方法制备六味地黄丸含药血清(分别为2.5%、5.0%、10.0%六味血清)及10.0%对照血清。采用RT-PCR法检测六味地黄丸含药血清对B16细胞株的缝隙链接蛋白(Cx)26和Cx43 mRNA的影响,Western blot法和间接免疫荧光法检测其对B16细胞Cx26和Cx43蛋白表达的影响;RT-PCR检测Cx26-309、Cx26-337、Cx26-367、Cx26-2098 SiRNA对Cx26的干扰效率,选用干扰效率最高的Cx26-2098 SiRNA干扰Cx26基因后观察六味地黄丸联合HSV-tk/GCV的旁观者效应;MTT法检测细胞间缝隙连接通讯功能(gap junctional intercellular communication,GJIC)抑制剂甘草次酸(GA)对六味地黄丸联合tk/GCV系统对B16细胞杀伤作用的影响,实验设为对照血清组,2.5%、5.0%、10.0%六味血清组(简称低、中、高剂量组)及对照血清联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV加GA组。GCV终浓度为20mol/L,GA终浓度为50mol/L。结果六味地黄丸含药血清能提高B16细胞中Cx43mRNA及蛋白的表达,且具有量效依赖关系;对Cx26 mRNA与蛋白的表达具有双向调节作用,低剂量时具有抑制作用而高剂量是能上调其表达;SiRNA干扰Cx26基因表达后,六味地黄丸联合自杀基因治疗的旁观者效应与没有干扰前比较无明显的变化;低、中、高剂量联合GCV组在GA阻断前细胞抑制率(48.75%、59.39%、69.28%)与阻断后细胞抑制率(29.14%、38.71%、58.13%)比较,显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤恶性黑色素瘤B16细胞的增效作用与缝隙连接机制有关,可能是通过提高Cx26和Cx43等缝隙连接蛋白表达而达到协同增效作用。

全反式维甲酸提高激素非依赖性前列腺癌自杀基因治疗的旁观者效应

目的:观察全反式维甲酸(ATRA)提高单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鸟苷(GCV)系统体内外抗激素非依赖性前列腺癌的旁观者效应。方法:应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞存活率来反映ATRA处理前后HSV-TK/GCV系统治疗PC-3细胞的旁观者效应;荷前列腺癌裸鼠模型随机分为4组,观察各组移植瘤生长状态和组织病理学改变。结果:在达到明显旁观者效应时,HSV-TK/GCV需要TK+PC-3细胞数为50%,而ATRA联合HSV-TK/GCV需要TK+PC-3细胞数仅为30%,两者比较差异显著(P<0.05)。HSV-TK可以抑制移植瘤生长,但ATRA+HSV-TK抗前列腺癌发生显效可提前1周,而且效果更显著(P<0.05)。结论:ATRA可增强HSV-TK/GCV系统治疗激素非依赖性前列腺癌的旁观者效应。

丹参注射液对自杀基因tk/GCV系统的协同增效作用

目的 探讨丹参注射液联合自杀基因系统对大鼠肝癌细胞和小鼠移植瘤的作用。方法 ①丹参注射液以不同浓度与GCV分别或共同作用于大鼠肝癌CBRH7919的tk^-细胞，以及含5％tk^＋的tk^＋、tk^-混合细胞，MTT法检测各组存活率，用Q值（实测药效与理论药效的比值）分析中药与自杀基因系统联合的相互作用是否有协同性，0．85≤Q〈1．15为相加；Q≥1．15为协同。②把小鼠肝癌细胞H22／tk（tk^＋）与H22（tk^-）细胞按1：4混合，再按2×10^6细胞/只接种到Balb／c纯系小鼠腋下皮下组织内，随机分为模型组、丹参（注射液）组、tk／GCV组、tk／GCV联合丹参注射液治疗的联合组，n=9～11；中药治疗从d2起共15d，自杀基因系统治疗从长出肿瘤后开始共10d，进行疗效观察。结果 ①各组存活率tk／GCV组为63．10％±2．17％，GCV组为67．03％±2．81％，5ml·L^-1丹参联合tk／GCV组为26．67％±4．23％（Q=1．22），5ml·L^-1丹参＋GCV组为42．17％±5．36％（Q=1．04）；10ml·L^-1丹参联合tk／GCV组为18．10％±5．56％（Q=1．26），10ml·L^-1丹参＋GCV组为33．84％±9．84％（Q=1．06）。②接种后各组均在d7触摸到肿瘤，成瘤率100％。联合组在治疗后肿瘤生长呈现明显抑制，最终肿瘤体积（1．53±0．88）cm^3，比模型组（3．19±1．76）cm^3减少52．01％（P〈0．05）；肿留质量（1．32±0．80）g，比模型组（2．28±1．20）g减少42．11％（P〈0．05），差异有统计学意义。丹参组、tk／GCV组肿瘤体积、瘤块质量与模型组比较差异均无统计学意义。结论 丹参注射液能提高自杀基因系统对大鼠肝癌细胞的杀伤力和对小鼠肝癌细胞移植瘤的抑制作用，两者联合作用的协同性提示丹参注射液能增强自杀基因旁观者效应。

自杀基因联合中医药疗法治疗肿瘤的设想

自杀基因疗法是一种具有良好应用前景的肿瘤治疗新措施。但如何有效地提高疗效是目前仍须解决的关键问题。由于免疫机制在自杀基因疗法旁杀伤效应中的重要作用,激活荷瘤机体的免疫功能,改善自杀基因抗肿瘤作用的炎症免疫微环境,是提高肿瘤自杀基因疗法疗效的主要策略。中医中药在调节机体免疫状态方面具有肯定的作用,与其他方法比较具有明显优势。因而,将自杀基因疗法与中医中药联合应用,有可能起到提高肿瘤自杀基因疗法疗效,防止肿瘤复发的作用。提出了自杀基因联合中医药疗法治疗肿瘤的新设想,为肿瘤基因治疗提供了一种新的思路和模式。

CD-TK和HSV-TK两种自杀基因体系对前列腺癌细胞的杀伤作用

背景与目的:自杀基因治疗是一种有前景的基因治疗方法,本实验通过观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase,HSV-TK)和CD-TK两种自杀基因体系对前列腺癌细胞PC-3m的杀伤效果,探讨该基因治疗在前列腺癌治疗中的应用价值。方法:应用逆转录病毒载体将HSV-TK基因和CD-TK融合基因分别转染PC-3m细胞,经RT-PCR鉴定后,MTT法检测丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)、5-氟胞嘧啶(5-flucytosine,5-FC)前体药物单一或联合应用对转染后PC-3m细胞的杀伤作用,以未转染的PC-3m细胞作对照。结果:GCV对转染后PC-3m细胞有较强的细胞毒作用,半数抑制浓度为8.34μg/ml,但旁观者效应不明显;5-Fc则有显著旁观者效应,当混育细胞中转染细胞比例是5%时即可出现;联合用药具有协同作用,两药相互作用指数小于1.0。结论:CD-TK自杀基因体系对前列腺癌细胞具有显著杀伤作用,明显优于单用HSV-TK基因体系,深入研究意义较大。

自杀基因系统联合六味地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用

【目的】观察六味地黄丸含药血清协同HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞的作用,探讨建立自杀基因联合中药方药的肿瘤基因治疗联合方案的可行性。【方法】构建HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统,确定丙氧鸟苷(GCV)工作浓度(39.2μmol/L);选用SD大鼠灌胃制备六味地黄丸含药血清和空白血清,并观察含药血清和空白血清对肿瘤细胞生长的影响。设空白对照组、GCV对照组、自杀基因治疗对照组,以上3组均为无大鼠血清的对照组。空白血清组、GCV加空白血清组、自杀基因系统加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组、自杀基因系统联合含药血清组中,所有大鼠的空白血清和含药血清再分为体积分数5%和7.5%2种浓度,每组设6个复孔。将大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk+和CBRH7919/tk-混合,使tk+细胞的比例分别占0%、5%、10%,按3×103个/孔细胞分别接种到96孔板,用完全培养基培养细胞24h后,相应加入体积分数5%或7.5%的大鼠空白血清和含药血清,孵育12h,加入GCV,培养60h,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,用Q值(实测药效与理论药效的比值)分析自杀基因系统与含药血清联合的相互作用是否具有协同性(0.85≤Q<1.15为相加作用,Q≥1.15为协同作用)。【结果】空白血清和含药血清浓度在体积分数20%以下时未显示明显细胞毒性;血清浓度为体积分数5%和7.5%时,自杀基因系统联合含药血清组与单独含药血清组及自杀基因系统加空白血清组比较,联合组对肿瘤细胞的杀伤作用均强于其他非联合组,细胞存活率均有显著性差异(P<0.01),而且自杀基因系统联合含药血清的作用具有明显的协同性(Q>1.15)。【结论】HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统联合六味地黄丸对杀伤肿瘤细胞具有协同增效作用。

KDR启动子驱动的双自杀基因对人肝癌细胞及脐静脉内皮细胞的特异性杀伤作用

目的探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的双自杀基因系统CDglyTK对人肝癌细胞及脐静脉内皮细胞的特异性杀伤作用。方法用腺病毒AdKDR-CDglyTK感染表达KDR的BEL-7402、HUVEC细胞和不表达KDR的HepG2细胞,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测重组腺病毒及转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,MTT法检测该系统对不同细胞株的杀伤效应和旁观者效应。结果以感染复数MOI为100的腺病毒AdKDR-CDglyTK分别感染各细胞株,重组腺病毒对三种细胞具有相似的感染效率。RT-PCR检测发现,重组腺病毒及感染AdKDR-CDglyT的三种细胞均有目的基因CDglyTK的表达。感染腺病毒的BEL-7402、HUVEC细胞对前药具有较高的敏感性,而HepG2细胞对前药不敏感(P<0.001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该系统有明显的旁观者效应。结论KDR启动子驱动的双自杀基因系统CDglyTK对肝癌细胞及人脐静脉内皮细胞具有特异性的杀伤作用。

AFP启动子驱动的yCD／TK双自杀基因靶向杀伤肝癌细胞的体内外研究

目的:研究携带甲胎蛋白(AFP)启动子的酵母菌胞嘧啶脱氨酶/胸苷激酶(yCDglyTK)双自杀基因体内外靶向性杀伤肝癌细胞的效果和机制。方法:构建携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因表达质粒。通过阳离子脂质体将携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因转染HepG2和SMMC7721细胞,用MTT法测定不同浓度氟胞嘧啶(5-FC)、更昔洛韦(GCV)及联合治疗的杀伤作用,用流式细胞仪检测细胞周期。建立裸鼠肝癌皮下种植瘤模型,观察自杀基因体内杀瘤效果以及细胞凋亡的情况。结果:成功构建的携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因靶向性地在AFP阳性的HepG2细胞上表达,而AFP阴性的SMMC7721细胞无表达,GCV、5-FC及两者联合可有效抑制HepG2细胞生长,随药物浓度的增高而杀伤作用增强,药物间抑瘤效果比较是GCV+5-FC>5-FC>GCV,而SMMC7721细胞的生长未受影响。体内实验可见GCV、5-FC及两药联合对转染后的HepG2细胞种植瘤有明显的抑制效果,并检测到明显的细胞凋亡,而对SMMC7721细胞种植瘤的生长无影响,种植瘤内极少凋亡细胞。结论:携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因能有效地靶向性地杀伤AFP阳性的肝癌细胞,细胞凋亡可能是其杀伤的重要机制之一。

缝隙连接与自杀基因旁观者效应研究进展

在自杀基因治疗中 ,旁观者效应表现为转染细胞对临近未转染细胞的毒性作用 ,是决定自杀基因疗效的关键因素。研究证实 ,细胞缝隙连接 (gap junctions ,GJs)是旁观者效应的主要机制 ;检测这种连接的基本组成元件—接合素 ,可供筛选肿瘤细胞对自杀基因的敏感性 ;通过生化或基因转移的方法诱导细胞GJs,可增强GJs功能缺陷细胞自杀基因的旁观者效应。

腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对乳腺癌治疗作用。方法用重组VEGFP-CD/TK-GFP基因的腺病毒体外感染表达VEGF的乳腺癌MCF-7细胞和对照组不表达VEGF的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,以RT-PCR检测受感染细胞CD/TK的表达,然后给予前药环氧鸟苷(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响;用流式细胞术观察细胞周期变化。建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,采用瘤内注射腺病毒载体联合腹腔内注射前药GCV和/或5-FC治疗后,观察肿瘤生长情况。结果腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。RT-PCR检测发现转染Ad-VEGFP-CD/TK的MCF-7细胞有目的基因的表达,而乳腺上皮细胞无表达。MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,CD/TK融合基因对MCF-7的疗效优于任一单自杀基因(P<0.01)。在感染复数为100时,用流式细胞仪分析细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少。在MCF-7裸鼠移植瘤模型中,该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的生长,其疗效优于任一单自杀基因(P<0.01)。结论腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因联合GCV和5-FC能有效治疗乳腺癌,其效果优于单自杀基因系统。

枸杞多糖联合自杀基因tk/GCV系统对小鼠肝癌移植瘤的影响

目的探讨枸杞多糖联合自杀基因tk/GCV系统对移植性小鼠肝癌的治疗效果。方法实验分为模型组、枸杞多糖组、单纯自杀基因系统治疗的tk/GCV组、自杀基因系统联合枸杞多糖治疗的联合组;把小鼠肝癌细胞H22的tk+和tk-细胞按1∶4比例混合,按2×106个细胞/只接种昆明小鼠腋下皮下组织内,次日随机分组;第2天开始中药治疗15d,长出肿瘤后tk/GCV系统治疗11d,进行疗效观察。结果从肿瘤体积看,联合组生长抑制程度最大,第10天起与模型组比较差异明显,差异随治疗时间增加而逐渐增大且有统计学意义,第14天抑瘤率达40.9%(P=0.018<0.05)。而tk/GCV组在第12天、枸杞多糖组第10￣12天也有明显抑瘤作用(P<0.05),但第14天起与模型组比较差异减少,差异无统计学意义。结论枸杞多糖联合自杀基因系统能抑制小鼠肝癌移植瘤生长,减少瘤块体积。枸杞多糖能提高自杀基因系统对小鼠移植瘤的杀伤力。

六味地黄丸入血成分增效自杀基因杀伤肝癌细胞的缝隙连接机制

【目的】探讨六味地黄丸主要入血成分处理的淋巴上清对大鼠肝癌细胞CBRH7919缝隙连接功能的影响,以期阐明其增强自杀基因疗法杀伤肝癌细胞效应的作用机制。【方法】取大鼠脾淋巴细胞,加入六味地黄丸的5种主要入血成分,体外培养后取含药淋巴上清,采用流式细胞术结合荧光示踪法分析其对细胞缝隙连接通讯功能(GJIC)的影响;利用Western blot法检测含药淋巴上清对大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白表达的影响;利用GJ阻滞剂甘草次酸(GA)观察阻滞GJIC后,含药淋巴细胞上清联合tk/GCV系统对细胞杀伤作用的影响。【结果】流式细胞术结合荧光示踪法结果表明,占培养液15%(体积分数)的含药淋巴上清能促进大鼠肝癌CBRH7919细胞的GJIC功能;Western blot法结果显示,含药淋巴细胞上清能提高大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白的表达水平;GA阻断GJIC功能后,含药淋巴细胞上清联合tk/GCV系统对细胞杀伤作用降低。【结论】六味地黄丸入血成分处理的淋巴上清可通过缝隙连接机制发挥对自杀基因杀伤大鼠肝癌细胞的增效作用。

缺氧促进5HRE和AFPp调控的NTR/CB1954自杀基因系统特异杀伤HepG2细胞

目的:研究5拷贝缺氧反应元件(5HRE)和甲胎蛋白启动子(AFPp)联合调控的自杀基因系统硝基还原酶/CB1954(nitro-reductase/CB1954,NTR/CB1954)在缺氧环境下对人肝癌细胞株HepG2生长的抑制作用。方法:利用5HRE作为增强子和AFPp构成联合调控元件,与自杀基因NTR构成真核表达载体。将载体转染AFP阳性的人肝癌细胞株HepG2及AFP阴性的人胃癌细胞株MKN45,利用G418筛选稳定转染的细胞。用RT-PCR和Westernblotting检测NTR的表达。将前体药物CB1954加入稳定表达NTR基因的细胞,用MTT法观察其毒性代谢产物4-羟胺还原产物对肿瘤细胞生长的抑制作用。结果:成功筛选出稳定表达NTR的单克隆HepG2细胞和MKN45细胞。RT-PCR和Westernblotting证实单克隆HepG2细胞中NTR在mRNA和蛋白水平的表达,且缺氧环境中的表达量更高;单克隆MKN45细胞在常氧和缺氧环境中均无NTR表达。MTT法检测发现,缺氧环境下NTR基因能有效地活化前体药物CB1954,剂量依赖性地抑制NTR阳性的HepG2细胞的生长(P<0.05);但对MKN45细胞和野生型HepG2细胞无抑制作用。结论:5HRE和AFPp双重调控的NTR/CB1954自杀基因系统在体外缺氧环境下可促进对人肝癌细胞株HepG2靶向性杀伤作用。