黄芩茎叶葡萄糖醛酸水解酶提取工艺、酶学性质、实际应用研究

目的研究黄芩茎叶葡萄糖醛酸水解酶(sbslGUS)提取工艺、酶学性质、实际应用。方法在单因素试验基础上,以粒度、加水量、提取时间、提取次数为影响因素,酶活性为评价指标,正交试验优化提取工艺。分析底物(黄芩苷)浓度与酶解速度的关系,计算V_(max)、K_(m),考察pH值、温度、金属离子对酶活性的影响,评价pH稳定性、热稳定性。sbslGUS酶解黄芩苷以制备黄芩素,考察pH值、温度、反应时间、底物初始浓度、加酶量对转化率的影响。结果最优提取工艺为粒度40目,加水量10倍,提取时间15 min,提取次数3次。酶解符合酶促反应动力学,K_(m)为0.0063 mol/L,V_(max)为70.42μmol/h,在pH值6.0、温度45℃、金属离子100 mmol/L Cu2+下酶活性最强,sbslGUS在pH值4.0~7.0、温度4~30℃范围内稳定性良好。最优制备工艺为pH值6.0,温度45℃,反应时间12 h以上,底物初始浓度67.2 mmol/L,加酶量1 mL/0.269 mmol黄芩苷,转化率为97.83%。结论sbslGUS酶解效率高,条件温和,可为获取黄芩素提供简便的制备方法,并且拓展了黄芩茎叶应用途径。

β-葡萄糖醛酸酶(GUS)在原发性肝内胆管结石形成中的作用

原发性肝内胆管结石(PIS)是我国西南地区高发和难治性疾病,对患者的生活造成极大的影响。胆道系统慢性感染产生的β-葡萄糖醛酸酶等代谢产物,在色素性结石的形成中起着重要作用,除细菌产生的外源性β-葡萄糖醛酸酶,肝内胆管细胞产生的内源性β-葡萄糖醛酸酶在结石的形成中亦扮演重要角色。本文就PIS发病机制中β-葡萄糖醛酸酶的作用研究进展予以分析,以期为PIS的防治提供可能的方式。

生物催化肌醇生产葡萄糖醛酸转化体系的构建与优化

葡萄糖醛酸(D-glucuronic Acid),由于其良好的解毒性能,广泛应用于医药、保健、食品及医美领域。随着合成生物学的高速发展,利用工程菌生产葡醛酸的生物发酵法取代化学合成成为一种趋势。研究结果表明:最佳诱导条件为在OD_(600)为0.5时,培养基中加入0.2 mmol/L的IPTG,26℃诱导8 h,构建的重组菌株BL21/pETDuet-miox可以实现肌醇氧化酶(MIOX)的高效表达;然后将肌醇氧化酶载体质粒pETDuet-miox转化进不同的表达宿主中,根据转化产量最佳表达宿主为Escherichia coli Rosetta(DE3);以肌醇氧化酶作为催化剂催化肌醇生产葡萄糖醛酸的最佳催化形式为冷冻破壁后菌体;得出最佳催化条件为在pH值为7.5的MOPS缓冲体系中,催化温度30℃时,对菌体添加量选择100 g/L湿菌体,底物质量浓度选定2 g/L。在此条件下肌醇转化率80.3%,葡醛酸产量达到1.606 g/L。本项研究为葡萄糖醛酸生物合成提供新的方法,也为葡醛酸的低成本工业化生产奠定基础。

亲水性离子液体[EMIM]BF_4对固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化活性的影响

以壳聚糖为固定化载体,采用吸附交联法制备固定化β-葡萄糖醛酸苷酶;以1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM]BF4)/缓冲溶液均相体系为介质,研究了亲水性离子液体[EMIM]BF4对固定化酶生物催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的影响.实验结果表明,当均相体系中[EMIM]BF4的体积分数为16%,pH为5.4,反应温度为50℃及摇床转速为200 r/min时,酶活力达到最高,并且明显优于纯缓冲溶液体系中的最高酶活.重复利用性实验结果表明,与纯缓冲液介质体系相比,固定化酶在含亲水性离子液体[EMIM]BF4的均相介质中表现出较好的操作稳定性.表观动力学参数和活化能数据表明,亲水性离子液体[EMIM]BF4在催化体系中能够增强酶和底物GL的亲和力,有效稳定酶-底物的过渡态,并降低反应活化能,而使固定化β-葡萄糖醛酸苷酶表现出较高的催化活性.

非均相催化氧化甲苷制备葡萄糖醛酸及其内酯

研究了非均相催化氧化合成葡萄糖醛酸及内酯的新工艺。以甲基葡萄糖苷为对象,考察了负载型Pd/ La_(0.5)Pb_(0.5)MnO_3催化剂的催化氧化性能,采用XRD、XPS等手段对载体和催化剂的结构进行了表征。结果表明:掺杂钙钛矿型载体具有较好的助氧化还原能力,在钯负载量为1%时,葡萄糖醛酸及内酯的总收率可达50%,反应选择性较好。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶基因多态性的研究进展

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)是生物体内进行第Ⅱ相生物转化时最重要的一种酶。UGT广泛分布于人体的肝、肾和肠等不同组织,代谢大量的外源性毒性物质和内源性物质。研究发现,UGT1A基因多态性是个体间葡萄糖醛酸化活性差异的重要原因之一。本文就UGT1A基因多态性的研究现状予以综述。

水／离子液体[BMIM]PF6两相体系中全细胞催化生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸

研究了水/离子液体两相体系中重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115(r-PGUS-P)全细胞转化甘草酸(GL)生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的反应。确定最适反应体系为离子液体[BMIM]PF6/水(2∶8,体积比),最适缓冲液pH、反应温度、底物浓度和细胞加入量分别为5.4、45℃、6.0mmol.L-1和8.0g.L-1。在此条件下反应58h,产物GAMG得率和化学键选择性分别为69.6%和67.2%,与纯水相反应体系相比,分别提高了12.4%和12.61%。离子液体循环使用7次后,回收利用率为93.47%。产物GAMG和副产物甘草次酸(GA)在此两相体系中得到有效分离,为后续产物分离带来便利。

β-葡萄糖醛酸苷酶荧光底物试卤灵葡萄糖醛酸苷的高效制备

以猴肝微粒体(Cy LM)为酶源,采用生物制备法实现了荧光底物试卤灵(Resorufin)向试卤灵葡萄糖醛酸苷(Resorufinβ-D-glucuronide)的高效转化,同时借助新型色谱分离材料C18WAX及固相萃取技术实现了Resorufinβ-D-glucuronide的高效富集及选择性洗脱,最终获得纯度大于98%的目标产物.所得产物结构经LC-MS,1H NMR和13C NMR等手段进行了表征.在此基础上,以该葡萄糖醛酸产物为探针底物建立了β-葡萄糖醛酸苷酶活性检测及抑制剂高通量筛选的方法.

Pd/CuO-Ce_(0.5)Mn_(0.5)O_2催化氧化合成葡萄糖醛酸及其内酯

用柠檬酸络合法制备了掺杂铈锰复合金属氧化物载体,采用沉淀法负载活性组分钯得到催化剂Pd/CuO-Ce0.5Mn0.5O2,用XRD、SEM和XPS对催化剂结构进行了表征分析,考察了不同CuO掺入量对葡甲苷的伯羟基选择氧化合成葡萄糖醛酸及其内酯的催化活性的影响。结果表明,CuO的掺入对载体的孔结构及活性组分在载体表面的分散都得到了不同程度的改善;Ce-Cu-Mn的协同作用有利于提高Pd的氧化还原性能。当CuO添加量为9%及Pd负载量为0.5%时,葡萄糖醛酸及其内酯的总收率可达70%。

离子排斥色谱法同时测定葡萄糖醛酸和内酯及葡萄糖醛酸稳定性

建立了同时检测葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸内酯的离子排斥色谱法。采用Boston HC-B75H^＋色谱柱进行分离，以5mmol／L H2SO4水溶液为流动相，流速0.6ml/min，柱温25℃，紫外检测波长220nm；根据外标法定量，葡萄糖醛酸和内酯分别在10～1200mg／L和5～600mg／L范围内线性良好（r〉0.9999）；葡萄糖醛酸、葡萄糖醛酸内酯的最低检测限及定量限均分别为0.1和0.3mg／L，精密度实验RSD分别为1.00％和0.35％，平均回收率分别为99.69％和98.21％。该检测方法简便、快速、灵敏，可用于葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸内酯的同时测定。温度、pH值和溶剂对葡萄糖醛酸稳定性有影响，可为葡萄糖醛酸的分析与制备研究提供参考依据。

纳米红色元素硒与葡萄糖醛酸内酯联用对大鼠肝纤维化形成过程的干预及其定量分析

目的 将纳米红色元素硒 (nanoredelementalseleni um ,Nse)与葡萄糖醛酸内酯 μglucurolactone ,Glu)联用 ,观察对大鼠肝纤维化形成过程的干预作用 ,试图通过药物间的相互作用 ,增效减毒 ,从而降低硒用量。方法 根据权重配方法设计 ,设立两药不同组合的 6个用药组和 2个对照组。用CCl4 造成大鼠急性肝损伤后开始用药 ,于用药 3wk和 6wk ,观察与急慢性肝损伤的相关指标 ,包括ALT ,MDA和PCIII。结果 急性肝损伤阶段的短期用药 (3wk) ,宜用大剂量Nse ,权重配方法的理论计算提示 ,Nse 2 0 0 μg·kg-1单用即可 ;两药联合长期使用 (6wk) ,在小剂量就可获效 ,尤以Nse 10 0 μg·kg-1+Glu 5 0mg·kg-1为好 ,对大鼠实验性肝纤维化已呈现明显的防治作用 ,联用Nse和Glu作用强于单用Nse。理论计算认为 ,Nse和Glu间产生协同作用 ,优化的组合剂量为Nse 10 0 μg·kg-1+Glu 6 0mg·kg-1(ig)。 结论 Nse和Glu联合用药 ,对大鼠CCl4 所致的肝纤维化有防治作用 ,可降低Nse用量。

茵陈蒿汤对β-葡萄糖醛酸酶UDPGT影响的实验研究

目的:建立中医阳黄证黄疸动物模型,同时探讨清热利湿、利胆退黄中药茵陈蒿汤对阳黄证黄疸动物模型肝细胞摄取、转化、排泄胆红素的影响,揭示其利胆退黄的机制。方法:在采用异硫氰酸-1-萘酯(ANIT)灌胃诱导大鼠肝损伤的基础上,结合中医高脂高糖饮食加湿热环境因素,建立中医阳黄证黄疸动物模型。观察大鼠β—葡萄糖醛酸酶含量、UDPGT活性、D-木糖吸收率的变化,并予中药复健方茵陈蒿汤治疗。探讨其对肝细胞摄取、转化、排泄胆红素的影响。结果:中医阳黄证黄疸动物模型符合黄疸证疾病特点;同时模型大鼠出现明显湿热证主证及湿热证客观指标变化。经中药复健方治疗后,黄疸证和湿热证主证及指标明显改善。结论:茵陈蒿汤有保肝利胆退黄的作用,其机理可能与降低肝细胞β-葡萄糖醛酸酶含量、诱导UDPGT活性、促进胆红素排泄,从而改善胆红素代谢有关。

Pd／La0.5Pb0．5MnO3催化氧化甲苷合成葡萄糖醛酸

采用沉淀法制备了以钙钛矿型复合金属氧化物为载体的催化剂Pd/La0.5Pb0.5MnO3,催化氧化甲基葡萄糖苷合成甲苷酸钠,进一步水解反应生成葡萄糖醛酸.利用XRD和SEM对催化剂进行了表征,考察了催化剂制备和氧化工艺条件对葡萄糖醛酸收率的影响.结果表明,在Pd负载量为1%、原料与催化剂质量比为6:1、温度70℃、压力为常压、pH值9、时间5h的条件下,葡萄糖醛酸的收率达到29.5%,反应选择性较好.

高胆红素血症新生儿肠道菌群特点及与β-葡萄糖醛酸苷酶活性的相关性

目的探讨高胆红素血症新生儿肠道菌群特点及与β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase,β-GD)活性的关系。方法选取2018年1~12月入院治疗的高胆红素血症新生儿50例为高胆红素血症组,选取非高胆红素血症新生儿30例为对照组。通过16S rRNA高通量测序方法分析两组新生儿肠道菌群的差异。通过酚酞-葡萄糖醛酸底物法测定高胆红素血症新生儿治疗前后肠道内的β-GD活性。结果对治疗前高胆红素血症组和对照组肠道菌群分布属水平进行比较,发现两组间有52种细菌的丰度差异有统计学意义(P<0.05)。对治疗后第3天高胆红素血症组和对照组入组3 d后肠道菌群分布属水平进行比较,发现两组间有42种细菌的丰度差异有统计学意义(P<0.05)。高胆红素血症组新生儿治疗后,埃希氏菌属和葡萄球菌属在肠道内的含量明显低于治疗前(P<0.05),粪便中β-GD活性较治疗前明显降低(P<0.05)。高胆红素血症新生儿治疗前后粪便β-GD活性与葡萄球菌属和埃希氏菌属丰度均呈正相关(rs=0.5948~0.7245,均P<0.01)。结论高胆红素血症新生儿和非高胆红素血症新生儿肠道菌群存在差异。高胆红素血症新生儿粪便中β-GD活性与差异菌葡萄球菌属和埃希氏菌属丰度呈正相关。肠道菌群可能通过调节β-GD活性影响新生儿高胆红素血症的发生,通过对新生儿肠道菌群和β-GD活性进行测定和分析,可能对早期评估新生儿高胆红素血症的发生有一定的临床意义。

电喷雾-串联四极杆-飞行时间质谱法测定药物的葡萄糖醛酸结合物

本文采用电喷雾 -串联四极杆 -飞行时间 ( ESI-QQ-TOF)质谱对生物样品中的乙氧苯柳胺、3 H-1 ,2 -二氢 -2 -( 4-甲基苯胺基 )甲基 -1 -吡咯里嗪酮 ( SFZ-4 7)和利胆酚的β-D-葡萄糖醛酸结合物进行了质谱分析。在负离子条件下均有响应 ,而且 MS2均产生碎片 m/ z1 75 .0 2 4 1与葡萄糖醛酸的负离子质量数吻合 ,MS3分析均产生 m/ z 1 1 3 .0 2 3 8即葡萄糖醛酸去掉一分子 H2 O和 CO2 。

[BMIM]PF_6/缓冲液两相体系中固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化特性研究

利用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)/缓冲液两相体系为介质,固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG),以期改善酶催化效能.实验表明,当反应条件固定化酶为0.25g,两相体系中[BMIM]PF6的体积分数为35%,pH为5.0,反应温度为40℃时,酶活力最高达1 000U,远大于纯缓冲液单相体系中的最高酶活力450U.离子液体重复利用实验表明,[BMIM]PF6回收率高于85%,在含有重复回收的[BMIM]PF6介质中,固定化酶相对活力大于93%.

胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1基因突变与新生儿黄疸易感性的关系

目的探讨胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1基因(UGT1A1)第1外显子A1及启动子区TATA盒基因突变与广西新生儿黄疸的关系。方法 152例广西籍新生儿分为高胆红素血症组(病例组)102例及健康对照组50例,采用PCR和DNA直接测序法检测两组UGT1A1第1外显子及启动子区TATA盒基因型,比较两组UGT1A1 G71R基因型分布及等位基因频率差异,观察病例组UGT1A1基因突变类型及其不同基因型患儿出生后72 h后血清总胆红素水平。结果两组UGT1A1 G71R基因型分布及等位基因频率比较差异有统计学意义(P均<0.01)。病例组检出G71R错义突变40例,启动子A(TA)7突变2例,715C→T杂合无义突变1例。病例组G71R纯合子患儿血清总胆红素水平高于野生型及杂合子患儿(P均<0.05)。结论 UGT1A1基因G71R突变是广西新生儿黄疸主要突变类型,该突变与新生儿高胆红素血症有密切关系;新发现的715C→T无义突变可能是新生儿胆红素脑病发生的重要原因之一。

酸性多糖中的葡萄糖醛酸与中性糖的含量测定

目的对酸性多糖中的葡萄糖醛酸 (GA)与中性糖的含量进行测定。方法将葡萄糖和GA配成一系列混合糖 ,比较硫酸咔唑法和间羟联苯法测定GA含量的准确度 ;分别建立葡萄糖和GA对硫酸蒽酮的标准曲线以扣除GA对中性糖测定的干扰。结果葡萄糖的存在对用硫酸咔唑法测定GA有干扰 ,而用间羟联苯法测定几无干扰 ;另外 ,GA的存在对用硫酸蒽酮法测定中性糖有一定干扰。结论应采用间羟联苯法测定酸性多糖中的GA含量 ,同时扣除GA在硫酸蒽酮法中的干扰以得到中性糖的含量。

新生儿迁延性黄疸与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因突变的关系

目的探讨胆红素-尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT1A1)基因Gly71Arg变异与北京地区汉族新生儿黄疸发病的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性长度多态性方法测定无亲缘关系的北京地区汉族新生儿黄疸[病例组,n=96,总胆红素(307.6±38.5)μmoL/L,未结合胆红素(292.9±35.9)μmoL/L]与健康对照组[n=101,总胆红素(131.2±42.1)μmoL/L,未结合胆红素(126.3±39.7)μmoL/L]UGT1A1Gly71Arg基因多态性的基因型,并检验二组基因型分布、等位基因频率差异和UGT1A1基因Gly71Arg变异对病例组总胆红素的效应。采用SPSS10.0软件进行统计学分析,组间差异采用t检验及协方差分析,基因型频率采用χ2检验。结果病例组新生儿UGT1A1Gly71Arg基因多态性频率与健康对照组存在明显差异(χ2=9.47P<0.01),Arg等位基因频率明显高于健康对照组(χ2=10.34P<0.01)。病例组新生儿UGT1A1Gly71Arg基因多态性Arg等位基因纯合子携带者总胆红素水平明显高于杂合子携带者和非携带Arg等位基因者(Pa<0.001),采用协方差分析校正胎龄和出生体质量影响后,Arg等位基因纯合子携带者总胆红素水平仍明显高于杂合子携带者和非携带Arg等位基因者(Pa<0.001)。结论UGT1A1基因Gly71Arg变异可能是北京地区汉族新生儿黄疸的发病原因之一,该基因多态性Arg等位基因纯合子携带者黄疸更严重。

葡萄糖醛酸内酯酯化及结晶工艺改进研究

对现行淀粉硝酸氧化法合成葡醛内酯的酯化与结晶工艺进行了改进。通过水解液浓缩、乙酸丁酯带水、醋酸共沸脱水3次处理,葡醛内酯粗品收率从15%提高到18%,结晶终止温度从-5℃提高到25℃,该项改进不仅提高了产品收率,而且简化了分离过程,大幅度降低了能耗,从而降低了生产成本。