藤黄酸下调蛋白C受体表达杀伤三阴性乳腺癌干细胞的作用机制

背景:藤黄酸对乳腺癌具有很强的细胞毒性,可有效杀伤三阴性乳腺癌干细胞,但潜在的机制尚不清楚。目的:探讨藤黄酸对三阴性乳腺癌干细胞的杀伤作用及可能的机制。方法:使用PharmMapper数据库预测藤黄酸的靶点蛋白,使用String网站构建各药物靶点蛋白互作网络关系,使用Cytoscape软件构建活性成分-作用靶点网络,通过R语言软件对潜在靶点进行KEGG信号通路富集分析。采用CCK-8法检测不同浓度藤黄酸对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231活力的影响,筛选适宜的作用浓度。采用细胞球培养法富集MDA-MB-231细胞干细胞,经过不同浓度(0,0.5,1.0,2.0μmol/L)藤黄酸作用24 h,TUNEL荧光染色与流式细胞仪检测干细胞凋亡,qPCR与Western blot检测蛋白C受体表达,Western blot检测p-PI3K、p-AKT、Caspase-3和Cleaved Caspase-3蛋白表达;将干细胞分4组培养:空白对照组(干细胞不做任何处理)、siRNA-NC组、siRNA-蛋白C受体组和siRNA-蛋白C受体+PI3K激动剂组,培养36 h后,采用Western blot法检测p-PI3K、p-AKT、Caspase-3和Cleaved Caspase-3蛋白表达。结果与结论:(1)网络药理学发现,三阴性乳腺癌干细胞标志物蛋白C受体是藤黄酸的作用靶点之一;KEGG富集分析涉及细胞凋亡、上皮生长因子受体、RAS和PI3K-AKT信号通路等;(2)CCK-8检测结果显示,藤黄酸可抑制MDA-MB-231细胞活力,半数抑制浓度IC50值为(1.18±0.34)μmol/L,因此后续实验选择浓度0.5,1.0,2.0μmol/L;(3)TUNEL荧光染色和流式细胞术检测证实,藤黄酸以剂量依赖的方式诱导三阴性乳腺癌干细胞凋亡(P <0.05);qPCR和Western blot检测证实,藤黄酸可下调蛋白C受体mRNA和蛋白表达,下调Caspase-3、p-PI3K和p-AKT蛋白表达,上调Cleaved Caspase-3蛋白表达(P <0.05);siRNA-蛋白C受体转染实验也进一步证实,敲低三阴性乳腺癌干细胞蛋白C受体表达可提升Cleaved Caspase-3蛋白表达(P <0.05)、下调PI3K/AKT信号通路磷酸化水平(P <0.05),而应用PI3K激动剂740 Y-P能够降低Cleaved Caspase-3蛋白表达(P <0.05)、提升p-PI3K和p-AKT的磷酸化水平(P <0.05),一定程度上改善细胞凋亡情况;(4)结果表明,藤黄酸可能通过下调蛋白C受体来发挥三阴性乳腺癌及干细胞杀伤及诱导凋亡作用,进一步的分子机制可能和PI3K/AKT信号通路抑制有关。

藤黄酸对脓毒症大鼠肠道损伤的保护作用

目的探讨藤黄酸(GA)对脓毒症大鼠肠损伤的影响以及对RIP1/RIP3/MLKL信号通路的调节作用。方法取40只SPF级SD大鼠,按随机数字表法分为假手术(Sham)组、脓毒症(Spesis)组、低剂量GA组和高剂量GA组,各10只。除Sham组外,其余3组大鼠均采用盲肠穿孔结扎法(CLP)建立脓毒症大鼠模型。低剂量GA组和高剂量GA组于造模前24 h分别灌胃给予50、100 mg·kg^(-1)GA。造模后12 h麻醉处死,收集外周血和小肠组织。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)表达水平;苏木素-伊红(HE)染色观察小肠组织病理变化并进行Chui’s评分;蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测凋亡相关蛋白(Caspase-3、Bax和Bcl2)、紧密连接蛋白(ZO-1和Occludin)及RIP1/RIP3/MLKL信号通路相关蛋白的表达水平。结果与Sham比较,Spesis组大鼠肠黏膜受损明显,Chui’s评分显著升高(P<0.05);血清中炎性因子TNF-α、IL-1β、和IL-6表达明显增加(P<0.05);小肠组织中Bax、ZO-1和Occludin蛋白表达明显降低(P<0.05),而Caspase-3、Bcl2、MLKL、RIP1以及RIP3蛋白表达明显增加(P<0.05);与Spesis组比较,低剂量GA组和高剂量GA组大鼠肠黏膜损伤均有不同程度改善,Chui’s评分均明显降低(P<0.05);血清中炎性因子TNF-α、IL-1β、和IL-6表达均显著降低(P<0.05);小肠组织中Bax、ZO-1和Occludin蛋白表达明显增加(P<0.05),而Caspase-3、Bcl2、MLKL、RIP1以及RIP3蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论GA能够减轻脓毒症诱导的大鼠肠道损伤,这或许与RIP1/RIP3/MLKL信号通路密切相关。

新藤黄酸对CAL27细胞裸鼠移植瘤增殖及凋亡作用的研究

目的:探讨新藤黄酸(GNA)对CAL27细胞裸鼠移植瘤增殖及凋亡的影响。方法:将18只SPF级裸鼠随机分为对照组、GNA低剂量组及GNA高剂量组(n=6)。通过接种对数生长期的舌鳞癌CAL27细胞建立皮下裸鼠移植瘤模型,低及高剂量组裸鼠分别隔日静脉注射新藤黄酸8.0 mg/kg与16.0 mg/kg干预,对照组给予等量生理盐水。给药期间绘制肿瘤生长曲线,2周后处死裸鼠并取出肿瘤组织,计算抑瘤率。TUNEL法检测各组裸鼠移植瘤细胞凋亡;免疫组化法检测瘤体组织的AKT、Bcl-2与PI3K蛋白的表达水平;HE染色法检测新藤黄酸对正常组织器官的毒副作用。结果:GNA低及高剂量组裸鼠移植瘤生长缓慢,瘤重及瘤体积明显低于对照组(P<0.05),低和高剂量组抑瘤率分别为57.58%和83.68%。TUNEL结果表明,GNA低及高剂量组凋亡指数高于对照组;免疫组织化学结果表明,GNA低及高剂量组裸鼠肿瘤组织的AKT、Bcl-2及PI3K的表达显著低于对照组(P<0.05)。HE结果显示,GNA对正常组织器官无明显改变。结论:GNA可能通过调控肿瘤组织AKT、Bcl-2及PI3K等蛋白的表达,诱导CAL27细胞凋亡,抑制人舌鳞癌的发生发展,对正常组织器官无明显毒副作用。

超高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中藤黄酸等5种成分

采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术,建立了化妆品中藤黄酸、转位藤黄酸、藤黄酸B、异藤黄酸及新藤黄酸的测定方法。样品经过体积分数75%甲醇水溶液超声提取后,以Zorbax Eclipse Plus C18为色谱柱、0.1%(体积分数)甲酸水-乙腈(体积比30∶70)为流动相,采用电喷雾离子(ESI)源、正离子扫描的多反应监测(MRM)模式进行定量分析。结果表明,藤黄酸等5种成分在5~250 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数(r)≥0.999,加标回收率为90.6%~117.9%,相对标准偏差(RSD)均小于10%。该方法简单、快速,为化妆品中藤黄酸等成分的检测提供了技术参考。

共载藤黄酸和Cypate纳米粒子用于肿瘤的化疗-光热协同治疗

目的制备以乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic),PLGA]为载体共载藤黄酸(gambogic acid,GA)和光热剂Cypate的纳米粒子(GA-Cy-PNs),实现化疗联合光热治疗以提高抗肿瘤治疗效果。方法使用油/水乳化法制备GA-Cy-PNs;利用透射电镜评价纳米粒子的结构;通过马尔文激光粒度仪测定粒径分布和Zeta电位,考察纳米粒子贮存及血浆稳定性;利用紫外分光光度法考察GA和Cypate的包封率和载药量;采用透析法研究GA-Cy-PNs体外释放行为;使用近红外热成像仪评价光热转换能力和光热稳定性;采用激光共聚焦显微镜观察近红外激光照射对4T1细胞和HepG2细胞摄取GA-Cy-PNs能力的影响;采用CCK-8法考察纳米粒子对4T1细胞和HepG2细胞的毒性。结果制备的GA-Cy-PNs呈球形,粒径均一,均匀分散,能被较好的贮存并具有良好的血浆稳定性;GA和Cypate的包封率分别为80.76%和82.73%,载药量分别为3.51%和7.19%,在酸性条件下,GA释放速度加快;光热测试表明GA-Cy-PNs具有良好的光热转换能力和优异的热稳定性;近红外激光照射能促进细胞对纳米粒子的摄取;体外生物安全性评估试验表明,GA-Cy-PNs具有良好的生物安全性和生物相容性;细胞毒性试验证实在近红外光照射下,联合化疗药物的治疗效果明显优于单一治疗。结论GA-Cy-PNs是一种具有化疗与光热联合治疗功能的纳米粒子,展现出明显地抗肿瘤细胞活性,为肿瘤的协同治疗提供新的研究策略。

基于网络药理学分析藤黄酸治疗牙周炎的分子机制

目的应用网络药理学和分子对接技术探讨藤黄中主要成分藤黄酸(GA)在牙周炎治疗中的作用及分子机制。方法使用SwissTargetPrediction、SEA及SuperPred数据库获取GA的相关靶点;利用GeneCards、DisGeNET及CTD数据库获取牙周炎的相关靶点;通过构建韦恩图获取药物和疾病的共同靶点;将共同靶点上传至STRING在线平台构建共同靶点“蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络”,并运用Cytoscape 3.10.0软件对PPI网络进行可视化处理并筛选出关键靶点;使用Metascape数据库对关键靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析,并构建“KEGG通路-关键靶点”网络图;通过PDB数据库获取药物关键靶点度值前10的靶点蛋白pdb文件,使用AutoDock4软件进行分子对接。结果获得“药物-疾病”共同靶点185个,包括STAT3、CASP3、TLR4、HIF1-α、MTOR、STAT1、ITGB1、HDAC1、ITGB3、CASP8等核心靶点;KEGG分析共获得141条信号通路,包括中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成、PI3K-AKT、Toll样受体等多条信号通路;分子对接结果显示GA与对应关键靶点结合能均≤-5 kJ/mol,药物结合能力较好。结论GA可通过参与NETs形成、PI3K-AKT、Toll样受体等通路,调节免疫反应、炎症反应、组织修复,发挥对牙周炎的治疗作用。

基于网络药理学和实验验证探讨藤黄酸抑制膀胱癌的作用及机制

目的利用网络药理学和实验验证探讨藤黄酸(gambogic acid,GA)抑制膀胱癌的作用及机制。方法利用PubChem、PharmMapper、GeneCards数据库和Venny 2.1.0获取GA抑制膀胱癌的潜在靶基因;通过STRING数据库和Cytoscape 3.9.1软件构建蛋白互作图;通过DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析,并进行可视化处理。通过CCK-8、细胞克隆形成实验检测GA对UM-UC-3细胞增殖能力的影响;通过细胞划痕实验、Transwell实验检测GA对UM-UC-3细胞迁移和侵袭能力的影响;通过流式细胞术检测GA对UM-UC-3细胞凋亡的影响;通过Western blot检测GA处理UM-UC-3后细胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、FoxO1的蛋白水平变化。结果筛选出GA抑制膀胱癌的潜在靶点57个,核心靶点为EP300。GO富集分析结果显示GA抑制膀胱癌可能涉及生物学过程26个、细胞组分17个、分子功能28个。KEGG通路富集分析显示GA抑制膀胱癌可能与PI3K/AKT、FoxO1、HIF-1信号通路有关。细胞学实验表明,与对照组相比,GA处理24 h后,UM-UC-3细胞的增殖、迁移、侵袭能力均降低,凋亡率升高;UM-UC-3细胞的PI3K、p-PI3K、p-AKT的蛋白表达水平均下调,FoxO1的蛋白表达水平上调。结论GA抑制膀胱癌UM-UC-3细胞的增殖、迁移、侵袭并促进其凋亡,其机制可能与PI3K/AKT/FoxO1信号通路有关。

纳米LDH作为藤黄酸吸附和释放载体的试验和分子对接模拟

目的 以藤黄酸(GA)为模型药物,将GA吸附在层状双金属氢氧化物(LDH)表面从而获得GA-LDH复合物。方法 采用高效液相色谱法(HPLC)测定GA含量,并进行方法学验证。采用共沉淀、离子交换、剥离-重组、胶束载药等方法制备GA-LDH复合物。以载药量和包封率为指标,对载药方法、药载比和不同粒径大小的载体进行单因素考察。采用IR和XRD等对样品结构表征,考察GA-LDH的缓冲及缓释性能;采用分子对接方法计算GA与 LDH之间的结合能大小。结果 确定以离子交换法、药载比为3∶5、水热合成LDH制备GA-LDH复合物的最佳制备工艺。优化后GA-LDH的载药量和包封率分别为21.37%、46.29%。酸碱滴定试验发现GA-LDH具有和LDH相似的缓冲性能。体外释放试验表明,GA-LDH具有一定的缓释效果,释药机制为被动扩散过程。分子对接结果从理论上佐证了GA-LDH复合物的形成。结论 该载药复合物具有良好的载药性能和缓冲性能,有望成为一种新型的中药抗肿瘤成分高效载体。

藤黄酸治疗溃疡性结肠炎的作用机制研究

目的:研究藤黄酸治疗溃疡性结肠炎(UC)的作用机制。方法:选取SD大鼠80只,随机分为空白组(n=20)、模型组(n=20)、柳氮磺吡啶组(n=20)和藤黄酸组(n=20)。除空白组外,其余3组建立右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导UC大鼠模型。柳氮磺吡啶组给予柳氮磺吡啶灌胃,藤黄酸组给予藤黄酸灌胃。比较各组体质量,结肠长度,检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)水平,通过结肠组织病理检测p-信号转导和转录激活因子-3(STAT3)/STAT3水平。结果:给药第1天,四组体质量比较,差异无统计学意义(P>0.05);给药第5天,模型组体质量低于其他三组(P<0.05);给药第10天,模型组体质量低于其他三组,柳氮磺吡啶组与藤黄酸组低于空白组(P<0.05)。模型组结肠短于其他3组(P<0.05)。模型组TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于其他3组(P<0.05);柳氮磺吡啶组与藤黄酸组TNF-α、IL-6水平高于空白组(P<0.05);免疫组织化学染色显示,模型组P-STAT3/STAT3高于其他3组(P<0.05)。结论:藤黄酸可以改善溃疡性结肠炎大鼠体质量、结肠长度、炎性因子水平,其机制与IL-6/STAT3信号通路有关。

HPLC法测定藤黄中藤黄酸和新藤黄酸的含量

目的建立藤黄中藤黄酸和新藤黄酸的含量测定方法。方法采用反相高效液相色谱法,色谱柱为HypersilODSC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇-0.1%冰醋酸水溶液(93∶7),流速1.0mL/min;检测波长为360nm,外标法定量。结果藤黄酸线性范围为2.45～49μg,回归方程Y=11334.8+232781X(r=0.9999,n=5),平均回收率99.3%,RSD=1.02%(n=6);新藤黄酸线性范围为2.55～51μg,回归方程Y=75197.5+226301X(r=0.9997,n=5),平均回收率100.5%,RSD=1.48%(n=6)。结论本法精密度高,重复性好,简便、可靠,可作为藤黄的质量控制方法。

藤黄酸碱降解产物的结构研究

目的 :对藤黄酸的稳定性进行研究 ,为制剂工艺的确定提供实验依据。方法 :用碱降解藤黄酸的方法制备了次藤黄酸 ,用UV ,IR ,NMR和 2DNMR光谱法鉴定其结构 ,并对其碱降解反应的机理进行了讨论。结果 :首次确定了次藤黄酸的结构。

薄层扫描法测定不同温度藤黄炮制品中藤黄酸及新藤黄酸的含量

薄层扫描法测定不同温度藤黄炮制品中藤黄酸及新藤黄酸的含量刘幸平，程康华，叶定江（南京中医药大学２１００２９南京林业大学２１００３７）关键词滕黄，藤黄酸，新藤黄酸，薄层扫描法藤黄为藤黄科植物（ＧａｒｃｉｎｉａｈａｎｂｕｒｙｉＨｏｏｋＦ．）分泌的干燥树脂...

紫外分光光度法测定藤黄药材中总藤黄酸含量

目的 建立藤黄药材中总藤黄酸含量的测定方法.方法 采用紫外分光光度法,以新藤黄酸为对照品,在360 nm处对藤黄样品中的总藤黄酸进行含量测定.结果 新藤黄酸浓度在5.304～26.520 mg/L范围内,与吸收度的线性关系良好（r=0.999 5）,平均加样回收率为98.53％（RSD=0.21％,n=9）.结论 该方法简便、准确、重现性好,可用于藤黄药材的质量控制.

高效液相色谱法测定藤黄药材中藤黄酸与新藤黄酸的含量

目的建立藤黄药材中藤黄酸与新藤黄酸的含量测定方法。方法采用反相高效液相色谱法,色谱柱为Purospher RP-18（250mm×4.6mm,5μm）;流动相：乙腈A-0.1%乙酸水溶液B（0-30min80%-90%A,30-32min90%-80%A）;流速：1ml/min;检测波长为360nm,外标法定量。结果藤黄酸的线性范围为0.0408～0.4080mg/m L,回归方程Y=16023031X-54083（r=0.9991,n=5）,平均回收率为99.7%,RSD=1.39%（n=9）;新藤黄酸的线性范围为0.0372~0.3720mg/m L,回归方程Y=11893364X-34797（r=0.9999,n=5）,平均回收率为100.1%,RSD=1.00%（n=9）。结论本方法精密度高,重复性好,简便、可靠,可作为藤黄中藤黄酸和新藤黄酸的含量检测方法。

新藤黄酸对急性淋巴细胞性白血病的调控机制

目的探究新藤黄酸对急性淋巴细胞性白血病细胞Nalm-6的增殖、迁移、侵袭的影响及作用机制。方法使用不同浓度的新藤黄酸处理Nalm-6细胞,通过MTT实验、软琼脂克隆形成实验、transwell迁移实验与transwell侵袭实验来检测新藤黄酸对Nalm-6细胞增殖、迁移、侵袭的影响。通过凋亡坏死检测试剂盒检测Nalm-6细胞的凋亡情况,通过Western blot实验检测Nalm-6细胞中c-Myc、P21蛋白表达情况。结果新藤黄酸可呈剂量依赖性抑制Nalm-6细胞的增殖、克隆形成、迁移与侵袭,导致Nalm-6细胞凋亡,下调c-Myc表达,上调P21表达。结论新藤黄酸可通过调控c-Myc和P21抑制Nalm-6,有望为急性淋巴细胞性白血病提供新的潜在治疗选择。

藤黄酸衍生物的合成与抗菌活性研究及其对拓扑异构酶的影响

藤黄酸分子式为C_(38)H_(44)O_9,具有较好的抗肿瘤活性,但尚无其抑制细菌生长方面活性报道.以藤黄酸为母药,合成得到藤黄酸甲酯和藤黄酸二甲基乙酰胺两种藤黄酸衍生物,考察这几种药物对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性细菌大肠杆菌的生长的影响,并通过凝胶电泳法检测几种药物对DNA拓扑异构酶活性的影响.实验结果表明,三种药物对革兰氏阴性细菌大肠杆菌均无抑制作用,对革兰氏阳性细菌金黄酥葡萄球菌有抑制作用.藤黄酸及其衍生物可以通过抑制拓扑异构酶的活性而抑制革兰氏阳性细菌金黄酥葡萄球菌生长的作用.

高效液相色谱法测定藤黄中藤黄酸与新藤黄酸含量

用高效液相色谱法测定了藤黄中藤黄酸(gambogic acid)和新藤黄酸(neo-gambogic acid)的含量,并对测定条件进行了选择。方法简便、准确。

藤黄酸衍生物-5诱导人头颈部鳞状细胞癌细胞凋亡的体外研究

目的:研究藤黄酸(GA)的衍生物5(C5),体外诱导人头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞的凋亡作用。方法:不同时间段分别用不同剂量C5作用于HNSCC细胞系CAL27、HN13和HN30,采用MTT法检测细胞存活率,Logit法测定抑制50%的细胞生长所需的浓度(IC50)值。采用Annexin-V/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡。免疫细胞化学法和Western blot法检测凋亡相关蛋白表达的变化。结果:C5明显抑制CAL27、HN13和HN30细胞的生长,且与剂量和时间呈正相关。IC50值比GA对照组明显降低。应用5.0μmol/L高浓度的C5,处理CAL27细胞系组24 h、48 h和72 h,细胞凋亡比例分别为52.19%、65.24%和84.53%。C5引起明显的、剂量依赖性的Bcl-2表达减少和Bax表达增加。结论:C5可以体外通过上调Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白表达诱导头颈部鳞状细胞癌细胞的凋亡。

新藤黄酸体内外抗肿瘤作用研究

目的初步探讨新藤黄酸的体内外抗肿瘤作用。方法采用MTT方法观察新藤黄酸对多种肿瘤细胞的增殖抑制作用;采用4、8、16、32mg/kg剂量新藤黄酸作用于人肿瘤裸小鼠(BALB/c-nude)模型,观察新藤黄酸的体内抗肿瘤作用。结果MTT法显示新藤黄酸对培养的人肿瘤细胞(人结肠癌细胞HCT-8、人肝癌细胞Bel-7402、人胃癌细胞BGC-823、人非小细胞肺癌细胞A549、人卵巢癌细胞A2780)增殖有一定的抑制作用,作用72h的IC50在1.75～3μmol/L;8、16、32mg/kg新藤黄酸iv给药,对人非小细胞肺癌A549细胞肿瘤移植的模型小鼠有一定的抑制肿瘤增长作用(P<0.05)。但4～16mg/kg剂量的新藤黄酸iv给药,对人肝癌Bel-7402肿瘤模型的抑制生长作用不明显。结论新藤黄酸能够抑制培养的肿瘤细胞生长;iv给药时对A549细胞肿瘤移植的模型小鼠肿瘤增殖有明显的抑制作用。