枯草芽孢杆菌优化表达蛋白质谷氨酰胺酶的研究

蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,PG)作用于大分子蛋白质或其小侧链的谷氨酰胺,使其脱酰胺变成谷氨酸可提高蛋白质溶解性和乳化性,在食品行业应用广泛。PG来源于解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum),但原始解脘金黄杆菌菌株表达PG产量较低。为提高蛋白质谷氨酰胺酶表达水平,将来源于解朊金黄杆菌的蛋白质谷氨酰胺酶基因优化密码子,将密码子换成枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)偏爱密码子,再将密码子优化前后的PG基因分别连接至表达载体pBSA43,最后转化到枯草芽孢杆菌WB600中进行高效表达。结果显示,密码子优化前重组菌株的PG酶活力为1.83 U·mL^(-1),优化后重组菌株的PG酶活力为2.91 U·mL^(-1)。为进一步提高PG表达水平,经响应面分析优化后,确定最佳发酵条件:发酵时间为62.3 h,发酵温度为32.5℃,培养基初始pH为7.24。在该条件下,密码子优化后重组菌株PG酶活力为5.76 U·mL^(-1)。来源于解朊金黄杆菌的蛋白质谷氨酰胺酶基因经密码子优化后,表达水平明显提高,为蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达提供参考。

蛋白质谷氨酰胺酶在乳清蛋白肽酶法制备中的应用

乳清蛋白是公认的人体优质蛋白质补充剂,却存在着一些过敏蛋白,为了降低乳清浓缩蛋白中的过敏原含量,开发β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)抗原性较低的乳清蛋白肽,该研究建立基于蛋白酶与蛋白质谷氨酰胺酶(protein glutaminase,PG)的乳清蛋白肽酶解工艺。通过蛋白酶筛选与复配确定最佳酶解组合——碱性蛋白酶+Prote AXH,建立PG辅助蛋白酶酶解工艺:5%乳清蛋白溶液在50℃下,加入1%PG充分孵育0.5 h后调整pH值为7.5,分步加入1%碱性蛋白酶和1%Prote AXH共反应2 h,最终得到的深度水解乳清蛋白粉水解度可达29.82%,分子质量<3000 Da的占比为88.48%,得率在93.5%,β-LG的降解率可达97.5%,必需氨基酸比例在46.16%。综上所述,PG的添加对提高乳清蛋白肽得率和过敏原降解率均有明显的效果,该研究可为低致敏乳清蛋白肽酶法制备提供一定的技术参考。

蛋白质谷氨酰胺酶在毕赤酵母中的异源表达

蛋白质谷氨酰胺酶(protein glutaminase,PG)可水解蛋白质侧链的谷氨酰胺残基,生成氨和蛋白质-L-谷氨酸,从而增加负电荷、降低蛋白等电点,进而改善蛋白质的功能特性。但其生产菌株解朊金黄杆菌的产酶量较低,仅有0.258 U/mL,且基因操作效率低,故近年来多采用异源表达的方法,以提高其产量。该实验成功实现蛋白质谷氨酰胺酶酶原(Pro-PG)在毕赤酵母GS115中异源表达,还进行了培养基优化及重组酶学性质的研究。结果表明:重组毕赤酵母pPIC9K-Pro-PG/GS115在摇瓶水平经1%(体积分数)甲醇诱导120 h,表达出的Pro-PG经胰蛋白酶加工后,PG酶活力达到0.878 U/mL。酶学性质研究发现,重组的PG最适作用温度为60℃,在不超过60℃时孵育1 h其相对酶活力可保持在80%以上;该酶作用的最适pH为6.0,在pH 3.0~8.0条件下孵育1 h其相对酶活力可保持在70%以上。

蛋白质谷氨酰胺酶对米谷蛋白功能性质的影响

研究蛋白质谷氨酰胺酶对米谷蛋白功能性质的影响,测定米谷蛋白及其脱酰胺样品的溶解度、乳化、起泡、黏度、持水持油力等功能性质。结果表明,谷氨酰胺酶法脱酰胺的米谷蛋白其功能性质均有提高,在中性溶液中溶解度显著增加(达到96.99%);酶解时间1～12h的范围内,改性蛋白在中性条件下的乳化性能最好,酶解时间1～5h的范围内,强酸性条件下的乳化稳定性得到显著改善,并呈现出最佳的起泡性能,而起泡稳定性和黏度则随着反应时间的增加均逐渐降低;此外,改性蛋白与未改性蛋白比较,持水性提高1.75～2.03倍,持油性提高1.58～1.94倍。

蛋白质谷氨酰胺酶发酵条件的初步优化

蛋白质谷氨酰胺酶在食品行业中具有广泛的应用前景,通过对蛋白质的脱酰胺基作用,可以促进植物蛋白的溶解、乳化和起泡等。对产吲哚金黄杆菌产生蛋白质谷氨酰胺酶的代谢曲线和发酵培养基配方进行研究,结果表明,发酵液氨浓度和pH值随发酵时间延长而升高,发酵12 h酶活最高,发酵培养基初始pH值为5.2时酶活最高;通过单因素试验,确定乳糖和蔗糖为最适碳源,大豆蛋白胨和多聚蛋白胨为最适氮源;正交试验结果表明,大豆蛋白胨、乳糖和Tween 80最适浓度分别为1.2%、0.7%和0.15%,培养基优化后酶活最高为0.661 U/mL。

一种快速微量化测定蛋白质谷氨酰胺酶活性的方法及其初筛应用

通过对苯酚-次氯酸盐法(试管体系)反应体系微量化,借助酶标仪动态检测96孔板中蛋白质谷氨酰胺酶与底物产生氨的最大速度Δmaxv,对于不同浓度的标准PG样品与不同酶活的发酵液,Δmaxv与酶活间呈显著正相关(r=0.999、r=0.890),故用Δmaxv代替酶活进行快速测定。选用96孔板作为快速测量体系,标准PG样品与发酵液在96孔板内部60孔中Δmaxv变异系数分别为10%、18%。利用该方法进行亚硝酸钠(nitrite,NIT)诱变初筛,0.6 mg/m L的NIT处理10~9CFU/m L菌液20 min,涂板后筛选400株菌株样本,利用该方法最终得到1株是出发菌株酶活1.825倍且稳定性良好的菌株,可继续作为出发菌株应用于后续诱变筛选工作中。该方法可以准确、快速地提高诱变初筛的效率,为以后的育种工作奠定了基础。

蛋白质谷氨酰胺酶产生菌的分离筛选和鉴定

[目的]筛选出能够产生蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,PG)的菌株,并对筛选出的菌株分类和鉴定。[方法]以carboxybenzoxy(Cbz)-Gln-Gly为唯一氮源,从来自全国各地采集到的726份土样中富集筛选能够产生蛋白质谷氨酰胺酶的菌株,分别从形态学、生理学和分子生物学方面对所筛选的菌株进行分类鉴定,并测定发酵上清的脱酰胺活性。[结果]共筛选到9株产PG酶的细菌,经鉴定,其中7株为产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indologenes),一株为解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum),另外一株为粘金黄杆菌(Chryseobacterium.gleum)。[结论]分别发酵测定9株菌的PG酶活性,产吲哚金黄杆菌ZYF120413-7发酵酶活最高,为0.7168U/m L。粘金黄杆菌D4-1-1的产酶能力最低,其酶活为0.1029U/m L。本课题的研究成果扩大了PG酶产生菌株的来源,为后续研究打下了基础。

微生物蛋白质谷氨酰胺酶的初步分离纯化

蛋白质谷氨酰胺酶可以特异性地水解蛋白质和多肽的谷氨酰胺残基,研究了产吲哚金黄杆菌产生的微生物蛋白质谷氨酰胺酶的代谢曲线和初步的分离纯化。发酵过程中pH升高,氨浓度增加,到14 h时酶活达到最高为0.359 U/mL。发酵液离心去上清液经3 kD滤膜超滤4倍时,纯化倍数和得率都最高。超滤液加入4倍体积无水乙醇沉淀蛋白质,酶的得率最高为72.7%。沉淀用缓冲液复溶后,经过SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析分离,得到单一峰。经过多步纯化后酶得率为31.72%,纯化倍数为124倍,经SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带,分子量约为20 kD。

蛋白质谷氨酰胺酶成熟肽基因mpg原核表达及其多克隆抗体的制备

蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,简称PG)是一种新型蛋白质脱酰胺酶,在蛋白质改性领域具有广阔的应用前景。但是,目前关于蛋白质谷氨酰胺酶的测定方法主要是通过苯酚-次氯酸盐反应测定铵离子含量指示蛋白质谷氨酰胺酶的酶活,该方法精确度和灵敏度有限。因此,利用原核表达系统表达解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)分泌的蛋白质谷氨酰胺酶成熟肽基因mpg,纯化后制备其多克隆抗体用于检测解朊金黄杆菌分泌的蛋白质谷氨酰胺酶的含量。首先以解朊金黄杆菌基因组为模板扩增出成熟肽基因mpg,将其与pET32a载体连接构建重组质粒pET32a-mpg,转化至大肠杆菌BL21(DE3)。在25℃条件下,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6 h,目的蛋白表达量最高、呈可溶性蛋白。通过Ni-NTA柱纯化的重组蛋白mPG-His 6,将其作为抗原,免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。间接酶联免疫法检测其效价,所得抗体效价为1∶5 000。蛋白质免疫印迹实验结果说明,该多克隆抗体特异性良好。最后使用该多克隆抗体对解朊金黄杆菌的发酵上清液进行蛋白质免疫印迹反应,检测天然蛋白质谷氨酰胺酶,结果表明该抗体特异性良好,可用于检测解朊金黄杆菌分泌的蛋白质谷氨酰胺酶,为深入研究蛋白质谷氨酰胺酶的生物学功能、建立蛋白质谷氨酰胺酶高产菌株的高通量筛选方法奠定了基础。

蛋白质谷氨酰胺酶在植物蛋白改性中的应用研究进展

植物蛋白具有成本低,可再生、安全、环保等特点受到人们的极大关注。天然植物蛋白中存在大量的谷氨酰胺和天冬酰胺,影响了它们的溶解性、起泡性等,它们中的大多数植物蛋白由于功能较差而限制了其在食品中的应用。脱酰胺是一种极为有效的蛋白质改性方法,其中蛋白质谷氨酰胺酶具有安全、高效、专一等酶法改性的优点,又可以克服酶法改性产生不良风味、容易水解等缺点。本文针对目前蛋白质谷氨酰胺酶的特点以及在植物蛋白质的应用研究进展进行综述,研究发现蛋白质谷氨酰胺酶改善了蛋白质的乳化性、起泡性、持水性等功能性质,减少过敏原或不愉快的口感,提高蛋白质的可接受性。蛋白质谷氨酰胺酶在食品工业的应用中具有无限潜能,对这一领域进行全面的综述为蛋白质谷氨酰胺酶在食品工业中的应用提供理论依据。

蛋白质谷氨酰胺酶的重组表达与发酵条件优化

蛋白质谷氨酰胺酶(protein-glutaminase,PG)对植物蛋白具有高效的脱酰胺作用,可提高蛋白的溶解度,进而改善其起泡性、凝胶性等功能性质,在植物性食品中有巨大的应用前景。但由于原始菌株解脘金黄杆菌PG产量低,需异源重组表达以提高产量。将PG基因重组到质粒pHT43,采用强组成型启动子P 43替换pHT43的诱导型启动子P grac,并将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,获得表达菌株pHT43:pro-mPG(P 43)/BL21(DE3)。将发酵16 h的重组菌超声破碎,菌体上清液中含有带前导肽的PG,经镍柱纯化、脱盐及浓缩后,用0.3 mg/mL的胰蛋白酶酶切,得到成熟的PG。SDS-PAGE显示PG消化前后分子量分别约为38 kDa和20 kDa,Western-blot结果表明两者均能与his-tag抗体结合显色。成熟PG的酶活力为0.250 U/mL,酶反应的最适条件为45℃、pH 6.5。发酵条件优化后的最佳产酶培养基配方为:4 g/L谷氨酰胺,4 g/L蔗糖,1 g/L酵母提取物,8 g/L酵母浸粉,2 g/L胰蛋白胨,10 g/L NaCl,3 g/L CaCl 2。37℃、pH 6.5条件下发酵16 h,最终酶活力提高至0.761 U/mL。

蛋白质谷氨酰胺酶对米谷蛋白的分子结构及功能性质的影响

目的:研究蛋白质谷氨酰胺酶(PG酶)对米谷蛋白的分子结构及功能性质的影响。方法:采用zeta电位仪、体积排阻色谱(SEC-HPLC)及傅里叶红外光谱(FT-IR)研究米谷蛋白及其酶法脱酰胺样品的zeta电位、相对分子质量分布和二级结构变化。研究不同pH值条件下酶法脱酰胺样品溶解度的变化。结果:随着酶解时间的延长,米谷蛋白的脱酰胺度逐渐增大,当反应时间48 h时,DD值为52.29%;zeta电位逐渐增加,体系中蛋白质聚合体部分逐渐减少,α-螺旋结构有所降低;米谷蛋白在中性溶液中溶解度显著提高(达96.99%)。结论:酶法脱酰胺使蛋白质分子所带负电荷增加,分子间静电排斥作用增大;在中性pH条件下米谷蛋白的溶解度上升。

蛋白质谷氨酰胺酶基因的合成表达及性质研究

蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,PG)是引起蛋白质脱酰胺作用的一种新型水解酶,在食品工业中具有十分广泛的应用前景。通过重叠延伸PCR法合成了PG全长基因,将其成熟肽序列克隆至原核表达载体pET32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白主要以包涵体形式表达。通过降低诱导温度和共表达分子伴侣两种策略,以期实现重组蛋白的可溶性表达,结果发现低温对可溶性的提高有一定的作用,而分子伴侣影响甚微。收集包涵体经变性、复性后获得活性PG。将PG与底物Cbz-Gln-Gly进行孵育反应,结果表明,PG可有效水解Cbz-Gln-Gly谷氨酰胺残基上的氨酰基,释放出氨;酶学性质的研究表明,此酶的最适反应温度为40℃,最适作用pH为6.0。实验为PG酶的研究和开发提供了理论依据和重要参考。

蛋白质谷氨酰胺酶的发酵及初步分离和应用研究

研究了不同发酵条件对于产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes）生产蛋白质谷氨酰胺酶能力的影响，酶的分离和初步的应用。通过考察种子的生长曲线，发酵的温度、转速、摇瓶装液量，碳源和氮源，得出最大产酶能力的发酵条件为：30℃，200r/min，装液量25ml/250ml，蔗糖为碳源，多聚蛋白胨为氮源，发酵10-12h。初步分离研究表明在4倍超滤浓缩和4倍乙醇沉淀条件下，酶活力回收率均为最高，分别为84.99%和76.07%。该酶与酪蛋白37℃温育2h时，酪蛋白的脱酰胺度为41.03%，到24h后，脱酰胺度不再增加，并且酪蛋白的溶解性也有所增加。

正交试验优化谷氨酰胺酶改性米谷蛋白工艺

研究谷氨酰胺酶对米谷蛋白改性的工艺。以脱酰胺度、溶解度为考察指标进行了工艺条件的优化,探讨谷氨酰胺酶与米谷蛋白质量比、反应温度、反应pH值3个工艺参数对改性米谷蛋白溶解度及脱酰胺度的影响,确定了谷氨酰胺酶改性最佳工艺条件,用正交试验法对米谷蛋白酶法改性工艺条件进行了优化,得到最佳工艺条件为:谷氨酰胺酶与米谷蛋白的质量比1:7、酶解脱酰胺改性的反应温度37.0℃、时间24h、pH7.0。优化后的米谷蛋白脱酰胺度为52.76%,溶解度为93.78%。

酶法脱酰胺对无麸质玉米薄饼品质的影响

本实验采用蛋白质谷氨酰胺酶(PG)对玉米粉进行酶法改性,研究不同酶解时间(0,2,4,8,16 h)对玉米粉的脱酰胺度、持水持油能力、糊化特性、蛋白质二级结构以及无麸质玉米薄饼品质的影响。结果表明:适度脱酰胺会促使玉米蛋白二级结构的变化,进而改善玉米粉的持水持油能力,提高玉米粉的糊化温度,提升无麸质玉米薄饼的比体积,改善薄饼的质构品质。其中PG酶处理4 h时的感官评分最高,风味较好,此时与对照组相比,无麸质玉米薄饼的比体积由1.24增大到了1.61 mL/g,感官总评分从74±4.91分上升到了83±11.91分。综上,研究结果表明适当的PG处理可以改善玉米蛋白的性质从而提高无麸质玉米薄饼品质,为PG酶的应用提供科学依据和技术指导。

谷氨酰胺酶水解小麦蛋白工艺研究

以溶解度、脱酰胺度为考察指标,研究蛋白质谷氨酰胺酶对小麦蛋白进行酶解改性的工艺。通过单因素及正交试验,对蛋白质谷氨酰胺酶酶解谷朊蛋白进行了工艺条件的优化。探讨蛋白质谷氨酰胺酶与谷朊蛋白质量比、酶解温度、酶解时间和酶解p H 4个工艺参数对酶解谷朊蛋白溶解度及脱酰胺度的影响,确定了蛋白质谷氨酰胺酶解改性小麦蛋白的最佳工艺条件:谷氨酰胺酶与谷朊蛋白质量比0.05︰1,酶解温度45℃,酶解时间26 h,酶解p H 7.3。在此酶解工艺优化条件下,谷朊蛋白溶解度为82.36%,脱酰胺度为45.76%。

脱酰胺对热诱导小麦面筋蛋白构象及凝胶性质的影响

利用蛋白质谷氨酰胺酶(PGase)对小麦面筋蛋白进行处理,研究PGase脱酰胺及热诱导对小麦面筋蛋白构象及其凝胶性质的影响。结果表明,PGase脱酰胺能够在一定程度上抑制小麦面筋蛋白的热诱导聚集行为,提高小麦面筋蛋白热诱导凝胶的强度和保水性。当PGase添加量为3 U/g时,其凝胶强度和保水性均达到最大值,分别为903. 27 N和78. 70%。研究还表明,PGase处理后小麦面筋蛋白与水相互作用增加,从而提高了脱酰胺小麦面筋蛋白热诱导凝胶中非可冻结水含量。扫描电镜结果显示PGase脱酰胺结合热诱导处理的小麦面筋蛋白形成了更加有序的凝胶网络结构。