25羟维生素D_3对正常气道上皮细胞通透性的影响及可能机制

目的探讨25羟维生素D3对人正常气道上皮细胞通透性及ZO-1表达的影响。方法选取正常人支气管上皮细胞系16HBE为研究对象,MTT法分别检测不同浓度25羟维生素D3对细胞活力的影响;实验分组为:对照组,不同浓度25羟维生素D3处理组。各处理因素作用细胞总时间为24h。跨上皮电阻测量仪测量标准化单细胞层跨上皮电阻(TER),比较各组TER差别。进一步用实时定量PCR观测各处理组紧密连接蛋白ZO-1mRNA表达的变化。结果与对照组相比,25羟维生素D3处理组TER(P<0.05)显著增高,但各浓度的25羟维生素D3对ZO-1表达无明显影响(P>0.05)。结论 25羟维生素D3可以使气道上皮通透性减低,但这种效应并非通过上调气道上皮ZO-1表达实现的。

PAF对肠上皮细胞紧密连接的影响及ITF的保护作用

目的:探讨血小板活化因子(PAF)是否会引起肠黏膜屏障的破坏以及这种破坏机制是否与紧密连接相关,并观察肠三叶因子(ITF)的保护作用.方法:培养人结肠腺癌细胞株Caco-2,分别设正常对照组:不加刺激物及干预因素;实验组:加入PAF,终浓度分别为50 ng/L、100 ng/L和200 ng/L;ITF预防组:先加入ITF0.3 g/L,30 min后加入PAF 100 ng/L;ITF治疗组:先加入PAF 100 ng/L,30 min后加入ITF0.3 g/L,24 h后进行实验.MTT比色法检测细胞活力;测定跨上皮电阻TER和荧光黄的透过量反映肠上皮细胞单层通透性;RT-PCR法检测紧密连接蛋白ZO-1和Occludin mRNA表达的变化;免疫荧光染色观察紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的形态学.结果:PAF未影响到细胞的增殖和细胞活力.各浓度PAF作用24 h后,细胞单层通透性增加,跨上皮电阻(TER)下降,荧光黄透过增加.ITF治疗组及预防组TER下降值较模型组明显降低(122.2±14.7,100.3±10.9 vs 210.3±26.4,P<0.05),荧光黄透过量减少(10226.1±556.2,9711.2±364.9 vs 11601.2±693.5,P<0.05),预防组作用更明显.PAF作用后,ZO-1和Occludin mRNA表达均有下降,以100 ng/L组改变最为明显,ITF预防组较之表达增加(1.28±0.06 vs 1.07±0.05,1.13±0.07 vs 0.81±0.06,P<0.05),ITF治疗组改变不明显.免疫荧光染色发现ZO-1和Occludin主要分布在细胞内近胞膜处.PAF作用后,ZO-1及Occludin形态学改变,预防性给予ITF后,可明显减轻这种改变.结论:PAF可引起肠黏膜屏障破坏,其机制可能和紧密连接蛋白的破坏相关;ITF可以通过改变紧密连接蛋白的表达而部分恢复肠黏膜正常通透性,起到保护作用.

SIRT1在TNF-α介导的肠上皮屏障破坏中的作用及机制研究

目的观察沉默信息调节因子1(SIRT1)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的肠上皮Caco-2细胞屏障功能破坏的影响并探讨其分子机制。方法将Caco-2细胞分3组处理:对照组、TNF-α100ng/mL 24h处理组(TNF-α组)及TNF-α100ng/mL24h处理+白芦藜醇(Resveratrol)40μm预处理12h组(TNF-α+Res组)。分别检测跨上皮电阻(TER)、SIRT1及紧密连接蛋白:ZO-1、occludin的蛋白表达。结果对照组、TNF-α组、TNF-α+Res组的SIRT1蛋白相对表达量分别为0.81±0.02、0.43±0.04、0.60±0.03。3组的TER分别为(154.00±5.00)、(97.00±4.00)、(128.00±6.00)Ohm/cm2。TNF-α组SIRT1的蛋白表达较对照组下降47.00%,TER降低37.00%,经白芦藜醇预处理使TER较TNF-α组升高32.00%。对照组、TNF-α组、TNF-α+Res组的ZO-1和occludin蛋白相对表达量分别为0.62±0.06和0.57±0.03、0.23±0.05和0.33±0.04、0.41±0.03和0.50±0.02。TNF-α处理后紧密连接蛋白ZO-1、occludin表达显著降低(P<0.05),而白芦藜醇预处理可缓解该现象,蛋白表达较TNF-α组分别升高78.00%、51.00%(P<0.05)。结论 TNF-α处理条件下SIRT1水平降低,而升高SIRT1水平可增加肠道紧密连接蛋白ZO-1、occludin蛋白水平的表达,从而减轻TNF-α对Caco-2细胞构成的上皮屏障功能的损伤。

Peyer’s结淋巴细胞对上皮屏障功能的影响

目的 :体外建立稳定的上皮细胞与Peyer’s结淋巴细胞 (PPL)共培养体系 ,进一步研究该体系中的上皮细胞生理学特性。方法 :采用短路电流检测单层上皮细胞跨上皮电阻 (TER)的变化、半定量RT PCR方法检测上皮细胞间的紧密连接相关蛋白ZO 1和ZO 2mRNA的表达。结果 :①Caco 2细胞单层与PPL共培养的第 2天 ,无论是混合共培养还是上下共培养组的TER均与对照有统计学差异 (P <0 0 5 ) ;②同时上下共培养或混合共培养组在第 8天TER仍保持较高水平 ,与对照有统计学差异 (P <0 0 5 ) ;③在上下共培养和混合共培养组中 ,半定量RT PCR检测ZO 1mRNA的表达也均明显高于对照。结论 :Peyer’s结淋巴细胞 (PPL)可以较好地维持上皮屏障功能。

Peyer’s结淋巴细胞对结肠上皮细胞屏障功能的影响

为探讨粘膜上皮细胞与淋巴细胞相互作用的机制,利用Caco-2上皮细胞(系)与新鲜分离的小鼠Peyer’s结淋巴细胞共培养模型,采用短路电流检测单层上皮细胞跨上皮电阻(TER)的变化,半定量RT-PCR方法检测上皮细胞间的紧密连接相关蛋白ZO-1和ZO-2mRNA的表达以及ELISA方法测定相关细胞因子mIL-6和hIL-8的变化。结果表明,Peyer’s结淋巴细胞可以较好地维持上皮的屏障功能,但当痢疾杆菌F2a-12脂多糖(LPS)作用后,却使跨上皮电阻明显降低。细胞因子mIL-6和hIL-8在不同共培养情况下的差异表达,揭示淋巴细胞与上皮细胞间的“对话”包括细胞间的直接接触作用。

C-8神经酰胺对肺泡Ⅱ型上皮细胞通透性及紧密连接蛋白的影响

目的研究外源性C-8神经酰胺对肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)单层通透性的影响,探讨其作用机制。方法将体外分离培养的AECⅡ通过差速贴壁法纯化,在Transwell上构建单层,待细胞融合后给予不同浓度的C-8神经酰胺(0、25、50、100μmol/L)继续培养24 h,应用伏欧计测定跨上皮电阻值(TEER)及辣根过氧化物酶(HRP)标记法检测吸光度(OD)值;分别提取细胞总蛋白及总RNA,采用Western blot和实时定量聚合酶链式反应方法检测不同浓度的C-8神经酰胺对AECⅡ紧密连接蛋白ZO-1和Occludin蛋白水平和mRNA水平表达的影响。结果不同浓度的C-8神经酰胺刺激融合的AECⅡ单层24 h后,各组间TEER值、OD值差异均有统计学意义(F=38.780、19.780,P<0.001)。C-8神经酰胺作用后,ZO-1、Occludin蛋白(F=71.150,P<0.01;F=7.703,P=0.002)及mRNA(F=4.887,P=0.014;F=3.637,P=0.048)表达量明显降低。结论 C-8神经酰胺可能通过下调紧密连接蛋白的表达增加肺泡Ⅱ型上皮细胞通透性。

9种中药提取物细胞毒性及其与人结肠腺癌细胞系单层细胞旁通透性的相关性研究

目的了解9种中药提取物对Caco-2细胞毒性与对其细胞单层细胞-细胞间通透性的相关性。方法用MTT法测定9种中药提取物24 h及48 h的细胞毒,并计算IC50值。采用TranswellTM培养板构建Caco-2细胞单层,细胞电阻仪测定受试物对其TEER值的影响,找到影响细胞单层紧密连接的临界剂量,以此剂量与细胞毒参数行相关分析。结果 24、48 h细胞毒参数(IC50)与临界剂量(最大无毒剂量、最小有毒剂量)相关系数均>0.84,相关性检验P值均<0.01。最大无毒剂量与IC50的比值列阵显示,《小品方》甘草饮最小,三七醇提物最大。结论 9种中药提取物对Caco-2细胞毒与该细胞单层细胞旁通透性高度相关,采用细胞毒参数来预估中药提取物在Caco-2单层细胞模型供侧起始最大浓度具可行性。

连续性血液净化对急性重症胰腺炎早期诱导的肠黏膜屏障功能障碍的影响

目的研究连续性血液净化(continuous blood purification,CBP)对急性重症胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)早期诱导的肠黏膜屏障功能障碍的作用。方法以26例行持续静静脉血液滤过(continuous veno-venous hemofiltration,CVVH)的早期SAP患者作为研究对象。所有患者行CVVH24h,以血清D-乳酸、二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)和内毒素水平以及肠黏膜上皮细胞的通透性作为评价肠黏膜屏障功能的指标。分别在治疗前和治疗6、12和24h时采集静脉血。同时培养人Caco-2细胞,建立单层肠黏膜上皮细胞模型并与SAP患者CVVH各时间点的血清混合培养,电阻仪测定跨细胞电阻以反映其通透性的变化,荧光显微镜观察骨架蛋白(纤维状肌动蛋白)的分布和表达。结果 CVVH治疗后急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ显著改善。与正常对照组比较,SAP患者血清二胺氧化酶、D-乳酸和内毒素水平及通透性明显增高(P<0.01),骨架蛋白模糊,部分断裂,细胞间连接松散。CVVH治疗后SAP患者血清二胺氧化酶、D-乳酸和内毒素水平明显下降(P<0.01),肠黏膜上皮细胞的高通透性和骨架蛋白解聚得以减轻。结论 SAP患者早期存在肠黏膜屏障功能障碍。CBP不仅改善全身机能状况而且对SAP诱导的肠黏膜屏障功能障碍具有保护作用。这种作用与清除炎症因子并改善上皮细胞骨架蛋白的重排有关。

ML-7对酒精致肠黏膜屏障功能障碍的作用

目的探讨MLCK特异性抑制剂ML-7对乙醇诱导的肠上皮细胞通透性的作用。方法应用ML-7预处理Caco-2细胞后,测定跨上皮细胞电阻值(TEER)及荧光黄透过率,分析肠上皮细胞屏障的通透性的变化。应用Western blotting检测紧密连接相关蛋白(Occludin和ZO-1)的表达。结果 ML-7显著抑制乙醇诱导的肠上皮细胞屏障TEER值降低、荧光黄透过率升高、Occludin(S/IS)比值增加及ZO-1表达减少。结论 MLCK参与乙醇诱导肠上皮细胞屏障通透性增加的过程,揭示了乙醇引起肠上皮细胞屏障对大分子的通透性增加的部分机制。

Calu-3细胞气液界面培养及暴露研究的初探

目的探索Calu-3细胞气液界面(air-liquid interface,ALI)培养条件,及其在暴露系统中暴露洁净空气的耐受性。方法在Calu-3细胞3阶段培养:培养瓶扩增、液液培养至长满Transwell膜、ALI培养后,通过细胞跨上皮电阻(trans-epithelium electrical resistant,TEER)的测定和紧密连接蛋白ZO-1的表达来确定细胞屏障状态;利用气液界面暴露系统将Calu-3细胞暴露在洁净空气中,暴露1、2、3、4、5、6 h,以培养箱培养的细胞作为对照,检测暴露后Calu-3细胞的活性、TEER的变化,确定基于ALI培养的Calu-3细胞在体外暴露系统中的单次最长暴露时间。结果Calu-3细胞液液培养(8±1)d长满Transwell膜,屏障形成,转为ALI培养,在ALI培养的1~18 d内屏障完整,状态稳定,可以用于暴露实验;Calu-3细胞的活性在洁净空气暴露6 h之后明显下降(P<0.01),TEER在洁净空气暴露4、5、6 h之后明显下降(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。结论ALI培养1~18 d的Calu-3细胞可以用于气液界面暴露实验;综合细胞活性和TEER的变化,Calu-3细胞在暴露系统中暴露洁净空气的单次最长暴露时间为3 h。

沉默信息调节因子1对缺氧条件下肠上皮屏障功能的保护作用及机制

目的观察沉默信息调节因子1（SIRT1）对肠缺氧上皮Caco-2细胞屏障功能的影响并探讨其分子机制。方法对Caco-2细胞分别进行1％O2浓度缺氧6h（缺氧组）和常规处理（常规组）及加浓度为40μmol／L Resveratrol（SIRT1激动剂）预处理6h后再缺氧6h（观察组），分别检测3组肠上皮细胞跨上皮电阻（TER），PCR及Western blot分别检测3组SIRT1及紧密连接蛋白ZO—1、Occludin和Claudin-1的mRNA与蛋白表达。结果缺氧组SIRT1mRNA及其蛋白的相对表达量均明显低于常规组（分别为0．40±0．02比0．70＋0．07，P=0．001；0．37±0．03比0．76±0．03，P=0．001），也明显低于观察组（0．50±0．02，P=0．026；0．54±0．02，P=0．011）。缺氧组3种紧密连接蛋白mRNA表达均低于常规组（P〈0．05），也低于观察组（P〈0．05），观察组的ZO-1及Claudin-1表达与常规组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。3种紧密连接蛋白的表达水平常规组最高，观察组次之，缺氧组最低，两两比较，差异均具有统计学意义（均P〈0．05）。常规组、缺氧组和观察组的TER分别为（142±7）Ohm／cm^2、（94±3）Ohm／cm^2和（119±7）Ohm／cm^2；两两比较，差异均具有统计学意义（均P〈0．05）。结论缺氧条件下SIRT1水平降低，而SIRT1的激活可通过增加肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA与蛋白的表达，从而减轻缺氧对肠上皮屏障功能的损伤。

肠上皮内淋巴细胞对肠上皮屏障功能的影响

目的:研究在痢疾志贺菌F2a-12脂多糖刺激下,大鼠小肠上皮内淋巴细胞(IEL)对人结肠癌上皮细胞系Caco-2屏障功能的影响。方法:新鲜分离的大鼠小肠IEL与Caco-2共培养,并用F2a-12LPS刺激共培养细胞。通过检测短路电流、紧密连接相关蛋白表达及透射电镜来反映上皮屏障功能的变化。结果:共培养后跨上皮电阻增加,但在LPS刺激后显著降低;紧密连接相关蛋白ZO-2mRNA表达在共培养后增加,LPS刺激后共培养细胞ZO-1mRNA表达显著下降;透射电镜下可见共培养后细胞间紧密连接显著增强,但在LPS刺激后共培养细胞间的连接几乎消失。首次在电镜下发现上皮细胞与IEL间有连接样结构的存在,为其相互作用提供了形态学的证据。结论:IEL对上皮屏障功能具双向调节作用,在生理状态下增强,但在感染信号存在时降低。

白细胞介素-22对缺氧条件下肠上皮屏障的保护作用及其机制

目的观察白细胞介素-22（IL-22）对缺氧肠上皮T84细胞屏障功能的影响，探讨其分子机制。方法对T84细胞进行2％02缺氧6h（Hx组）及100μg／L重组IL-22（Hx＋rlL-22）处理，分别检测跨上皮电阻（TER），IL-22受体A1（IL-22RAl）及紧密连接蛋白：ZO-1、Occludin、Claudin-1及Claudin-4的mRNA与蛋白表达。结果缺氧引起IL-22RAl的mRNA及蛋白表达较常氧分别下降30．0％及63．0％，并引起TER降低54．7％，经rlL-22预处理使得TER较Hx升高43．8％。缺氧处理使ZO．1、Occludin、Claudin．1及Claudin-4表达明显降低，而rlL-22预处理则可缓解该现象（mRNA及蛋白表达较Hx组分别升高：44．3％、36．4％、77．6％、61．2％及109．3％、77，6％、153．3％、79．6％，P〈0．01）。结论IL-22与其受体作用后可以维持肠屏障功能，稳定渗透性，调控紧密连接蛋白的表达。

ROCK参与乙醇诱导肠上皮细胞屏障通透性增加

目的探讨Rho相关的卷曲蛋白激酶(ROCK)参与乙醇诱导的肠上皮细胞屏障通透性增加的作用。方法应用ROCK特异性抑制剂Y-27632预处理Caco-2细胞后,测定跨上皮细胞阻抗值(TEER)及荧光黄透过率,分析肠上皮细胞屏障的通透性的变化。应用Western blot的方法检测肌球蛋白轻链(MLC)、p-MLC及紧密连接相关蛋白(occludin)的表达。结果 Y-27632显著抑制乙醇诱导的TEER值降低、荧光黄透过率升高、pMLC/MLC及occludin(S/IS)比值的增加。结论 ROCK参与乙醇诱导肠上皮细胞屏障通透性增加。

小鼠气管–支气管上皮细胞的气–液界面培养

目的建立一种小鼠气管–支气管上皮细胞气–液界面(ALI)培养及纤毛摆动频率测量的方法,最大程度还原气道上皮的生理功能。方法利用1 mg/mLⅪⅤ型链蛋白酶冷消化的方法获取BALB/c小鼠气管–支气管上皮细胞,筛选出最佳消化时长以保证所得细胞的数量及活力。差速贴壁法去除成纤维细胞后,接种于Ⅰ型鼠尾胶原预包被的Transwell小室,用不同培养基进行增殖期和ALI分化期培养。结果采用链蛋白酶冷消化12 h、14 h和16 h所得细胞数目分别为(1.78±0.33)×10^5、(1.93±0.26)×10^5和(2.01±0.28)×10^5,经台盼蓝染色活细胞率分别为(96.86±0.25)%、(94.73±1.63)%和(86.87±5.95)%。1周左右细胞铺满小室,继续ALI培养2~3周后光学显微镜下可见纤毛节律性摆动,电镜及免疫荧光均证实纤毛结构。培养所得细胞纤毛摆动频率与小鼠气管在体纤毛摆动频率与一致。结论本实验建立的气管–支气管上皮细胞分离、ALI培养及纤毛摆动频率测量体系简便、稳定、高效、可靠,为探索气道疾病的致病和治疗机制创造了基础,亦可为其他物种气道上皮和(或)其他器官上皮的培养提供参考依据。

Caco-2建立肠黏膜屏障模型及其在通透性研究中的应用

目的利用Caco-2细胞建立体外肠黏膜屏障模型，系统评价并初步探讨其在炎症损伤后黏膜通透性改变中的应用。方法体外培养Caco-2细胞，接种于Transwell板上，每日观察细胞形态；自培养第5天起，隔日测细胞膜的跨上皮电阻（transepithelialelectricalresistance，TEER）；对于TEER值达标准的孔测定荧光黄透过率，进行透射电镜的完整性验证。应用培养21d的Caco-2细胞屏障，加入不同浓度（0、50、100、200nmoWL）的血小板活化因子（platelet—activatingfactor，PAF）孵育24h，光镜、电镜观察形态学改变，检测TEER和荧光黄透过率，应用间接免疫荧光和Westernblot观察ZO-1蛋白的分布及表达。结果Caco-2细胞单层TEER从第5～15天逐渐增加，在第15天已经达到600Ω·cm2，平台期保持至第21天；在此期间，细胞形成紧密单层，电镜下细胞呈高分化，细胞间形成紧密连接，绒毛整齐，极性形成；荧光黄透过量极低，体外肠上皮细胞屏障形成。加入PAF后，以100nmoVL对黏膜屏障通透性影响最大：电镜下见紧密连接结构破坏、断裂，细胞表面微绒毛脱落、稀疏；免疫荧光可见紧密连接的标志蛋白ZO-1荧光信号减弱，ZO-1环断裂，胞浆内可见阳性染色，提示其向膜下转移。此时，TEER值下降，荧光黄透过量明显增加，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01），与形态学改变规律一致；ZO—1蛋白表达亦降至最低，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。结论经形态学及细胞通透性验证，培养2～3周的Caco-2细胞可形成肠屏障模型，用于体外肠黏膜屏障的研究；PAF影响紧密连接相关蛋白的表达，破坏紧密连接结构，从而影响肠黏膜屏障通透性。

肠道转运Caco-2细胞单层模型的建立及验证评价

目的建立Caco-2细胞单层模型用于药物转运研究。方法按照常规的细胞培养方法,将Caco-2细胞接种到Millicell小室内(接种密度1×10~6个·mL^(-1)),培养21 d。定期用细胞电位仪监测跨上皮细胞电阻(TEER),评价细胞单层的紧密性与完整性;通过荧光黄转运实验检查Caco-2细胞单层模型细胞旁路转运通透性;通过普萘洛尔转运实验验证Caco-2细胞单层模型跨细胞被动转运通透性。结果培养21 d后,TEER值达到(981±123)Ω·cm^2,荧光黄和普萘洛尔的表观通透系数分别为0.33×10及16.7×10^(-6)cm·s^(-1)。结论本研究建立的Caco-2细胞单层模型紧密、完整,具有良好通透性,可用于药物转运研究。