睾丸和卵巢打点注射pIRES2-EGFP质粒生产转基因兔的研究(英文)

为探讨直接用注射器对睾丸和卵巢打点注射pIRES2-EGFP质粒转染兔的精子细胞和卵母细胞,建立操作方便、效率高、成本低、可批量生产转基因兔的可行性。选择5只成年新西兰雄兔、29只经产新西兰雌兔,每侧睾丸和卵巢内分别打点注射0.5~0.8 mg/mL质粒0.25 mL。①第3周随机取一只雄兔睾丸做冰冻切片,于荧光显微镜下观察转染情况。②（Ⅰ：1#♂×7♀、Ⅱ：2#♂×7♀、Ⅲ：3#♂×7♀、Ⅳ：4#♂×7♀）其它雄兔于第6周和第7周与3日前做过卵巢注射并超排处理的雌兔配种,最后采集新生仔兔耳组织,提取基因组DNA,经PCR和Southern杂交检测阳性率。结果显示雄兔睾丸冰冻切片于荧光显微镜下可见绿色荧光,统计所得后代转基因阳性率,并进行差异分析,其中Ⅰ组后代阳性率最高,PCR和Southern杂交检测阳性率为93.55%和83.87%,Ⅳ后代阳性率最低,依次为80.65%和70.97%,但是各组之间差异不显著。上述实验结果表明,对睾丸和卵巢同时注射外源基因可获得较高阳性率的转基因后代,生产转基因的方法操作简便、高效,为日后大规模制备一些大型家畜的转基因后代奠定了基础。

睾丸注射法制备携带猪PID1基因的转基因兔

目的研究磷酸酪氨酸互作结构域1(PID1)基因与肌内脂肪含量的关系,探究睾丸注射法在转基因动物制备中的可行性。方法将携带猪PID1基因的重组质粒pIRES2-acGFP-PID1与转染试剂共孵育后,对新西兰兔进行了睾丸打点注射试验。对繁殖的F1代个体进行了活体荧光检测、PCR和western blotting检测,以及抽样屠宰进行肌内脂肪含量等检测;将F1代阳性个体互交,繁殖了F2代兔,对其进行了阳性率检测以及肌内脂肪含量检测。结果外源PID1基因和荧光蛋白基因在后代中均成功表达,其中,F1代阳性率为35.88%,F2代阳性率为34.33%;转基因阳性兔与阴性和空白对照兔相比,PID1蛋白表达水平有所增加,肌内脂肪含量有显著提高(P<0.05)。结论 PID1基因与肌内脂肪沉积密切相关,同时,进一步证明了睾丸注射法可以用于制备转基因动物,且外源基因可以稳定遗传。

用注射器直接对睾丸打点注射EGFP生产转基因兔的试验研究

为探讨直接用1 mL注射器对睾丸打点注射pIRES2-EGFP建立操作方便、效率高、成本低、可批量生产转基因兔的可行性。选择4只成年新西兰雄兔,双侧睾丸内分别打点注射0.5～0.8 mg/mL浓度的质粒0.25 mL,第3周和第8周分别取4^#和3^#雄兔睾丸做冰冻切片,置荧光显微镜下观察是否发绿色荧光。其它雄兔于第3周开始参与配种,最后采新生仔兔耳组织提取其基因组进行PCR和Southern杂交检测阳性率。结果表明,雄兔睾丸冰冻切片于荧光显微镜下可见绿色荧光,PCR和Southern杂交检测表明在睾丸注射后的第6周和第7周进行配种所得后代阳性率最高。不同雄兔后代经PCR和Southern杂交检测平均阳性率存在差异（P〈0.05）,2^#雄兔后代平均阳性率达到56.46%,3^#雄兔的最低达36.96%的阳性率。表明用注射器直接对睾丸打点注射外源基因生产转基因的方法操作简便、高效,为大规模制备一些大型家畜的转基因后代奠定了基础。

卵巢打点注射质粒pIRES2-EGFP生产转基因兔的研究(英文)

本研究以绿色荧光蛋白为报告基因,转染兔卵母细胞,探索建立操作方便、效率高、成本低、可定量生产转基因兔的可行性方法。选择14只成年新西兰雌兔,每侧卵巢内分别打点注射0.25 mL 0.5-0.8 mg/mL的质粒,注射后第3日、第16日和第31日进行人工辅助配种;卵巢注射后第3日、第16日和31日随机各取1只雌兔卵巢做冰冻切片,置荧光显微镜下观察绿色荧光;应用PCR和Southern杂交检测转基因新生仔兔阳性率。结果经荧光显微镜观察,卵巢注射后第3日配种的雌兔卵巢冰冻切片及48 h以后的胚胎呈现绿色荧光;卵巢注射报告基因后第3日配种的雌兔后代阳性率最高,PCR和Southern杂交检测结果分别为72.7%和45.5%;第31日配种的后代阳性率最低,分别为36.8%和15.8%;第16日配种、第3日配种和第31日配种雌兔的阳性后代数量呈递减趋势。卵巢注射后第3日配种,虽然后代阳性率较高,但是其产仔数最少。实验结果表明,用注射器直接对卵巢打点注射外源基因生产转基因兔的方法操作简便、高效,为日后大规模制备一些大型家畜的转基因后代奠定了基础。

核基质附着区(MAR)调控的人胰岛素样生长因子(hIGF-1)转基因兔的制备

用ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄⅢ双酶解含鸡α－珠蛋白基因５′端核基质附着区（ＭＡＲ）、小鼠金属硫蛋白基因启动子（ＭＴ－１）和人胰岛素样生长因子－１（ｈＩＧＦ－１）基因的ｐＭＴＳＭＣＡＧ质粒，０．６％琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收纯化ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１片段（３．９ｋｂ），用该片段制备转基因兔。利用水平显微注射系统注射１－细胞兔胚胎４６８枚，移植到３６只受体兔，有８只妊娠，共产下１９只活仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ，应用ＰＣＲ技术分析其外源基因整合情况，获得８只阳性兔（显示出约６００ｂｐ外源ＤＮＡ条带）。再对８只阳性兔的ＰＣＲ产物进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，得到５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１外源基因的转基因兔，转基因整合率为２６．３％（５／１９）。用１只阳性转基因公兔（５０２号）繁殖了６窝，共获得４２只仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ后，如上用ＰＣＲ分析和做Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，Ｆ１代中有５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１融合基因。

高效整合转基因兔研究

用含有核基质附着区（ＭａｔｒｉｘＡｔｔａｃｈｍｅｎｔＲｅｇｉｏｎｓ，ＭＡＲ）的鸡珠蛋白基因与含有鼠金属硫蛋白（ＭＴ）基因启动子的人－类胰岛素促生长因子１（ｈ－ＩＧＦ－１）基因构建表达了载体。研究了ＭＡＲ对转基因兔整合率的影响。结果表明，带有ＭＡＲ的表达载体转基因兔整合率达到２６．３％，为一般不含ＭＡＲ构件转基因克整合率的两倍，对提高转基因动物生产效率，将起到重要作用。

转基因兔的培育及应用

转基因兔的培育及应用山东农业大学泰安２７１０１８朱瑞良转基因动物技术是将确定的外源基因导入哺乳动物的胚胎系，整合于染色体上，使其能正常表达并遗传给后代。该技术是近十年来人们开辟的一个崭新的热门研究领域，是外源基因转移从细胞水平到机体水平的一大飞跃。进...

转基因兔的培育及应用前景

本文阐述了转基因兔的生物学基础及培育方法;介绍了国内外转基因兔的培育状况,并对转基因兔的应用前景和今后的工作做出展望。

rhPA/GH双转基因兔的制备及rhPA表达检测

【目的】双基因共整合可协同促进转基因生物的目的基因表达水平提高,研究获得rhPA/GH双转基因兔,并比较分析目的基因rhPA的表达水平及兔个体生长发育情况,为制备高表达rhPA转基因动物和遗传育种提供新思路。【方法】利用NotⅠ/SalⅠ双酶切PCL25/GH质粒和QIAGEN DNA胶纯化试剂盒回收显微注射用基因片段。以3只rhPA单转基因兔(标号K06、K10、K17)作为供体兔,通过FSH/hCG超数排卵、受精卵原核显微注射、胚胎移植、苯酚/氯仿抽提新生仔兔耳尖组织基因组、PCR整合检测等方法获得rhPA/GH双转基因兔。经ELISA和Western blotting对转基因兔乳清进行表达检测,比较分析单、双基因表达rhPA水平。测量不同月龄的转基因兔体重,通过监测双转基因兔不同生长阶段的体重来分析GH对兔生长发育的影响。【结果】成功获得了约16700 bp大小的显微注射用基因片段,共超排3只供体兔获得122枚卵,其中103枚受精卵,受精率为84.4%(103/122),显微注射后挑取形态较好的81枚移植6只同步发情受体兔,5只兔怀孕,妊娠率为83.3%(5/6),妊娠到期共出生32只仔兔。通过PCR检测鉴定有19只携带rhPA基因的转基因兔,其中有11只rhPA/GH双转基因兔(7♂,4♀),双基因整合率为34.4%(11/32),且4只rhPA/GH双转基因母兔来源亲代分别为K06供体兔2只(标号K06-1、K06-2)、K10供体兔1只(标号K10-1)、K17供体兔1只(标号K17-1)。K06号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为42.2μg·mL^-1,K06-1和K06-2号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量分别为432、444μg·mL^-1;K10号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为42.8μg·mL^-1,K10-1号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量为636μg·mL^-1;K17号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为15.2μg·mL^-1,K17-1号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量为248μg·mL^-1。4只rhPA/GH双转基因母兔(K06-1、K06-2、K10-1、K17-1)乳腺表达rhPA含量在248-636μg·mL^-1之间,远远高于rhPA单转基因母兔(K06、K10、K17)乳腺的表达含量(15.2-42.8μg·mL^-1),表达水平显著提高了约10.2-16.3倍,说明GH能够协同促进目的基因rhPA在转基因兔乳腺中的表达水平。Western blotting结果显示出现一约39.0 kD大小的条带,与目的蛋白rhPA大小相同,进一步证明转基因兔乳腺中表达的这种蛋白为目标产物rhPA。对rhPA/GH双转基因兔从出生到6个月的体重进行连续测量,发现与正常非转基因兔的体重没有明显的差异,绘制生长曲线进一步表明4只整合GH的转基因兔与2只未整合GH的正常兔在生长发育的不同阶段体重上没有显著性差异,成长至6个月的体重均在4.0-5.0 kg之间,这证明GH的导入并不影响转基因兔的存活和正常生长发育至成年。【结论】成功地制备了rhPA/GH双转基因兔,并证明了GH基因的导入能够显著地提高目的基因rhPA的表达量,且不会对转基因兔的生长发育产生影响,这为将来制备高表达转基因兔及其它动物奠定了基础,也为转基因动物乳腺生物反应器和转基因育种建立提供了新思路、新方法。

重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的检测

人组织纤溶酶原激活剂(ht-PA)是临床血栓疾病治疗的主要生物药品,应用转基因动物乳腺生物反应器制备已有报道,但重组人纤溶酶原激活剂(rh PA)在转基因动物中表达尚未见报道。设计了以人t-PA的F、E、K1区位点缺失体为编码序列,以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子,构建了乳腺特异性表达载体PCL25/rh PA,通过受精卵原核显微注射法制备转基因兔。用PCR检测及其产物测序筛选转基因兔,ELISA试剂盒及纤维蛋白平板溶圈法检测转基因兔的表达产物。实验获得原代转基因兔5只(2♂,3♀),其中2只乳腺中表达人重组纤溶酶原激活剂,rh PA浓度最高可达400μg/m L,表达产物比活性是现有阿替普酶的150-200倍。实验结果表明,重组人纤溶酶原激活剂(rh PA)可以在山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子调控下获得乳腺特异性表达,表达重组蛋白具有较高的溶栓活性。

广西大学科学家成功育出9只体外显微授精转基因兔

据中国军网2011年2月26日援引新华社南宁2011年2月26日电，广西大学动物科学技术学院的研究人员经过2年多的努力，培育成了7只体外显微授精转fat-1基因兔和2只转绿色荧光蛋白（GFP）基因克隆兔。该项研究成果有助于新品种肉用兔的培育，具有广阔的应用前景。

国内诞生首例第八凝血因子转基因兔

10月11日，兰诺生物技术无锡有限公司宣布，他们已成功地将人类重组第八凝血因子的基因植入家兔基因组，培育出国内首例含有第八凝血因子的转基因兔。传统凝血因子主要是从人血浆中提取，因其成本高、产出量低，还可能携带人体致命病毒，使其应用受到很大限制。

广面诞生一批体外显微授精转基因兔

近日从广西大学了解到，学校动物科学技术学院目前培育成功7只体外显微授精转fat—1基因兔，其中4只通过了转基因成分鉴定。

国内首例第八凝血因子转基因兔在锡诞生

无锡市生物医药产业获突破性成果。10月11日，兰诺生物技术无锡有限公司宣布，成功将人类重组第八凝血因子的基因植入家兔基因组，培育出国内首例含有第八凝血因子的转基因兔。

我国成功培育含第七凝血因子的转基因兔

据无锡市科技局消息，兰诺生物技术无锡有限公司科研人员成功将人类重组第七凝血因子的基因植入家兔基因组．培育出含有第七凝血因子的转基因兔，并从转基因母兔的乳汁中分泌出大量人源性第七凝血因子。该成果一旦通过相关风险评估，将能批量生产，替代用于创伤性出血与常见血液疾病治疗的进口药品。

国内首例第八凝血因子转基因兔在无锡诞生

无锡市生物医药产业获突破性成果。lO月11日，兰诺生物技术无锡有限公司宣布，成功将人类重组第八凝血因子的基因植人家兔基因组，培育出国内首例含有第八凝血因子的转基因兔。“目前，我们已首批培育成功6只转基因兔，它们将通过分泌含有第八凝血因子的乳汁，经蛋白提纯后，用于血友病患者的治疗”，国际著名动物克隆和转基因动物专家、公司总裁杜福良博士介绍说。

国内首例第八凝血因子转基因兔在锡诞生

无锡市生物医药产业获突破性成果。10月11日,兰诺生物技术无锡有限公司宣布,成功将人类重组第八凝血因子的基因植入家兔基因组,培育出国内首例含有第八凝血因子的转基因兔。＂目前,我们已首批培育成功6只转基因兔,它们将通过分泌含有第八凝血因子的乳汁,经蛋白提纯后,用于血友病患者的治疗＂,国际著名动物克隆和转基因动物专家、公司总裁杜福良博士介绍说。

广西诞生一批体外显微授精转基因兔

从广西大学了解到,学校动物科学技术学院目前培育成功7只体外显微授精转fat-1基因兔,其中4只通过了转基因成分鉴定。 动物科学技术学院院长石德顺介绍,去年12月12日,3只显微授精转fal-1基因兔在广西大学诞生，接着连续诞生4只；今年1月14日，又有2只转GFP基因克隆兔诞生。