水稻WRKY转录调控因子基因功能研究进展

WRKY转录调控因子的生物学功能涉及植物生长发育、物质代谢、抗病耐逆、氧化衰老等诸多方面。水稻全基因组测序完成后,水稻WRKY转录调控因子基因的功能研究随之逐渐开展,目前已经发现它在植物抗病、耐逆、衰老、糖代谢以及形态建成方面发挥重要作用。随着研究的深入,水稻WRKY基因的编号未能统一,很容易让人混淆,有必要进行校正。结合作者实验室的一些研究结果,对水稻WRKY基因家族的研究现状进行了综述,以期为进一步深入开展WRKY基因家族的研究提供帮助。

水母雪莲Myb转录调控因子SmP基因的克隆及序列分析

采用TD PCR(TouchdownPCR)法从水母雪莲 (SaussureamedusaMaxim)红色系愈伤组织cDNA文库中筛选并克隆了雪莲Myb转录调控因子SmP (S .medusaMaximMyb relatedPgene)基因。序列分析表明该基因全长 96 9bp ,包括一个 771bp的完整开放阅读框架 (ORF) ,编码一个 2 5 6氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列的同源性分析表明在N 端具有两个典型的R2R3 MybDNA结合结构域。C 端富含亲水的丝氨酸S(18 38% ) ,且以寡聚体的形式存在 。

转录调控因子WRKY超级家族:起源、结构和功能

WRKY蛋白质是一个植物特有的超级转录调控因子家族,在拟南芥和水稻基因组中分别拥有至少74个和97个成员。最古老的WRKY转录调控因子拥有2个高度保守的WRKY结构域,可能起源于15～20亿年前的真核生物。虽然所有WRKY蛋白质主要通过特异地结合靶基因启动子区域的W盒序列而调控其表达,但各家族成员基因的生物学功能存在着各自的特异性。本文详细总结了WRKY蛋白质在调控植物发育和逆境诱导反应的信号转导途径建立等方面的分子生物学功能。

罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910转录调控因子rovS基因的克隆及表达研究

为了对罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910株毒力相关转录调控因子rovS进行克隆及表达研究,实验根据GenBank上登录的相关基因设计引物,采用PCR方法扩增该株细菌的rovS基因,然后将该基因定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达。结果显示,该基因有849个碱基,编码282个氨基酸;同源基因序列比对显示,无乳链球菌ZQ0910株与无乳链球菌2 603 V与ATCC13813的rovS基因的同源性最高;经IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为34 ku;用亲和层析后的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经ELISA检测效价达到1∶512 000。研究结果表明,实验成功克隆与表达了rovS基因,为深入探讨RovS调节因子在调节细菌的代谢、生长和毒力等多种生命活动中的作用提供了理论依据。

水稻WRKY转录调控因子研究进展

WRKY转录调控因子是植物中最大的转录调控因子家族之一,包含1或2个大约由60个氨基酸残基组成的高度保守的WRKY结构域。WRKY结构域的N端有严格保守的WRKYGQK氨基酸序列,其C端有锌指结构模型Cys(2)-His(2)或Cys(2)-His Cys。WRKY转录调控因子与靶基因启动子区域的DNA序列(T)TGAC(C/T)(W盒)特异性结合,调节目的基因的表达,在调控植物生长发育、物质代谢、抗病耐逆及氧化衰老过程中起重要作用。我们就有关水稻WRKY转录调控因子的结构分类及其生物学功能的研究进展做简要综述。

番茄转录调控因子基因Pti5植物表达载体的构建及其转化烟草的研究

本实验构建了含有CaMV35S启动子控制下的Pti5 VP16基因的植物双元表达载体pBI121UCH1。通过根癌农杆菌叶盘转化法,将Pti5 VP16基因导入烟草SRI中,经卡那霉素筛选,获得了抗性植株。经PCR和Southern印迹分析,表明抗性植株中整合了Pti5 VP16基因,经抗病性鉴定转基因烟草植株的抗病性明显提高。

布鲁菌铁转录调控因子rirA基因突变株的构建与鉴定

为了构建牛布鲁菌S2308(简称S2308)的铁转录调控因子rirA基因突变株(S2308ΔrirA),探讨该基因对自身生长的影响以及其对不同类型细胞黏附侵袭和胞内繁殖的作用。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那抗性基因替换rirA基因,获得突变株S2308ΔrirA。将亲本株S2308、疫苗株RB51和突变株S2308ΔrirA在相同营养条件下培养,观察其振荡培养时的生长变化趋势和静置培养时的聚集状态。将各菌株侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8)和小鼠巨噬细胞(RAW264.7),分别检测其黏附侵袭能力和胞内生存能力。结果显示,成功获得了布鲁菌rirA基因突变株且10代内未发生回复性突变;与亲本株相比,S2308ΔrirA在相同体外培养条件下其生长趋势未发生明显改变,且其凝集状态与亲本株类似;黏附侵袭试验显示,S2308ΔrirA对HPT-8细胞的黏附侵袭能力显著强于亲本株,而其对RAW264.7的黏附侵袭能力在一定程度上弱于亲本株;布鲁菌胞内生存试验发现,布鲁菌侵染HPT-8细胞24h后,其胞内细菌数量显著升高,而侵染巨噬细胞24h后,S2308ΔrirA的繁殖能力明显低于亲本株。这些结果表明,铁转录调控因子rirA基因参与了布鲁菌胞内寄生的过程,并与菌株的毒力强弱存在密切联系。

胶孢炭疽病菌环境pH应答转录调控因子基因的克隆与分析

参照油梨炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的环境pH应答转录因子基因pac1设计1对特异性引物,以芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)基因组DNA为模板,扩增获得大小为2 625 bp的目的基因片段。序列分析结果表明,目的片断包含完整的阅读框,与油梨炭疽病菌C.gloeosporioides pac1基因相应片段长度相同,二者碱基序列同源性达97%。用RT-PCR技术获得pac1基因cDNA片段,证实目的基因片段中存在3个大小分别为59,50,71 bp的内含子。拼接的全长cDNA长1 755 bp,推测编码的氨基酸序列长584个氨基酸残基,与推测的油梨炭疽病菌pac1基因所编码的蛋白质同样大小,二者氨基酸序列相似性达99%,只有1个氨基酸的差异,可以肯定克隆的目的片段为C.gloeosporioides pac1基因,为进一步研究C.gloeosporioides侵染芒果时的pH调控奠定了基础。

miRNA-21转录调控因子的生物信息学分析

【目的】探讨mi RNA-21转录调控因子AP-1、STAT3、NFI1、CBP、EBP、TGF-β、BMP-6、GFI1的结构特征及其与mi RNA-21转录结合位点。【方法】利用生物信息学工具分析mi RNA-21转录调控因子的理化性质、三级结构、跨膜区、信号肽、亚细胞定位及预测与mi RNA-21转录结合位点。【结果】等电点分析表明STAT3等电点小于7.0,其余7个转录调控因子等电点大于7.0;脂溶指数分析显示,EBP脂溶指数大于100,为亲水性蛋白,其余7个转录调控因子脂溶指数均小于100,为疏水性蛋白;从不稳定指数分析结果可知,EBP不稳定指数小于40,为稳定蛋白,其余7个转录调控因子不稳定指数大于40,为不稳定蛋白。所有转录调控因子二级结构均由α-螺旋、无规则卷曲和扩展链结构3种形式组成;EBP有跨膜区,BMP-6有信号肽,其余均无跨膜区或信号肽。亚细胞定位分析发现BMP-6位于细胞质中,EBP则位于质膜上,其余转录调控因子位于细胞核中;所有转录调控因子三级结构呈现发夹型结构,并预测出6个转录调控因子与mi RNA-21转录结合位点。【结论】mi RNA-21转录调控因子呈现多样性特征,拥有典型的发夹型结构特征,可能有助于对mi RNA-21转录表达调控,研究结果将有助于开展研究基于mi RNA-21的癌症治疗及其相关治疗药物的筛选。

转录调控因子CBF1(RBP-Jκ)对Cbfa1和Ose2元件启动子活性的影响

目的探讨Notch信号转录调控因子CBF1(RBP-Jκ)对核心结合因子Cbfa1基因启动子和骨钙素基因启动子区域Ose2元件启动子活性的影响。方法构建CBF1真核表达载体pCMV-Tag4/CBF1;将梯度浓度pCMV-Tag4/CBF1和荧光素酶报告质粒共转染两成骨前体细胞系Kusa-A1和Kusa-O,用双荧光素酶报告基因方法检测Cbfa1和Ose2元件启动子活性。结果随CBF1浓度增加,Kusa-A1和Kusa-O细胞中Cbfa1和Ose2元件启动子活性均逐渐提高。统计分析表明Kusa-A1细胞中1/40μg/μL实验组两启动子活性均与对照组差异显著;Kusa-O细胞中1/40μg/μL实验组Ose2元件启动子活性与对照组差异显著。结论转录调控因子CBF1可以促进Cbfa1和Ose2元件启动子活性,从而可能对细胞的成骨性分化有正调节作用。

神经干细胞分化与bHLH转录调控因子

近年来 ,许多 b HLH转录调控因子被克隆。研究揭示 ,b HLH转录调控因子参与了中枢神经系统神经干细胞的分化。根据 b HLH转录调控因子在神经分化过程中的作用 ,它们可分为决定因子和分化因子。此外 ,有负调控因子调控 b

IL-1β对正常和自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞iNOS基因转录调控因子的影响

用ＩＬ－１β处理体外培养的ＳＨＲ和ＷＫＹ大鼠血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ），比较两种大鼠ｉＮＯＳ基因表达活性的变化，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，ＶＳＭＣ受ＩＬ－１β刺激后，两种细胞的ｉＮＯＳ基因均表现出极高的转录活性，并且ＳＨＲ的ｉＮＯＳｍＲＮＡ水平高于ＷＫＹ大鼠．以大鼠ｉＮＯＳ基因转录调控区上游６００ｂｐ（－１０３７～－４３８）和下游５００ｂｐ（－４３７～４６）ＤＮＡ片段为探针，与ＶＳＭＣ核蛋白孵育后，进行凝胶电泳迁移率改变分析（ＥＭＳＡ），结果显示，两种大鼠的ＶＳＭＣ被ＩＬ－１β处理后，其核蛋白可分别与转录调控区上游或下游序列结合形成一条电泳滞后带．但是，转录调控区上游序列和下游序列与核蛋白形成的复合物具有明显不同的电泳迁移率．与ＷＫＹ大鼠相比，ＳＨＲ的ＶＳＭＣ核蛋白与ＤＮＡ结合活性较高．提示ＳＨＲ的ＶＳＭＣｉＮＯＳ基因及其转录调控因子对ＩＬ－１β的反应与ＷＫＹ大鼠明显不同．

十字花科黑腐病菌中转录调控因子HpaR1调控一个纤维素酶基因的表达

十字花科黑腐病菌(Xcc8004)中的一个转录调控因子XC_2736(HpaR1)在致病过程中具有重要的作用。前期研究发现该转录调控因子可能调控胞外纤维素酶的合成。为了解HpaR1对纤维素酶的转录调控机理,本研究对HpaR1进行原核表达纯化,并与488bp的包含XC_0639的启动子区DNA片段进行凝胶电泳迁移率试验,发现HpaR1与XC_0639启动子可以发生结合。将488bp的XC_0639的启动子DNA片段与报告基因gus融合,构建XC_0639的报告质粒pGUS0639r,分别导入野生型8004菌株和缺失突变体DM2736中,分析发现在突变体背景下GUS的表达水平比野生型背景明显降低。表明HpaR1正调控XC_0639的表达。构建XC_0639的极性整合突变体PK0639,检测发现PK0639几乎丧失胞外纤维素酶的活力;通过功能反式互补构建的互补菌株CPK0639可以恢复纤维素酶活性。研究结果表明HpaR1通过调控纤维素酶基因XC_0639的表达来调控细胞的纤维素酶活性。本研究为更深入地了解HpaR1如何调控细菌生理生化功能奠定了基础。

细菌GntR家族转录调控因子的研究进展

GntR家族转录调控因子是细菌中分布最为广泛的一类螺旋–转角–螺旋(helix-turn-helix,HTH)转录调控因子,此家族转录调控因子包含两个功能域,分别是N端的DNA结合结构域和C端的效应物结合结构域/寡聚化作用结构域。DNA结合结构域的氨基酸序列是非常保守的,但效应物结合结构域/寡聚化作用结构域的氨基酸序列却存在很大的差异性。目前许多GntR家族的转录调控因子已经被鉴定,这些转录因子调控细菌许多不同的细胞过程,如运动性、葡萄糖代谢、细菌的耐药性、病原细菌的致病力等。本文主要阐述了GntR家族转录调控因子的发现、二级结构、生物学功能、调控模式等方面的研究进展,旨在为研究者全面、深入地了解GntR家族转录调控因子的功能及作用机理提供帮助。

鼠伤寒沙门菌中假定转录调控因子的筛选

目的·基因组信息学分析结合分子生物学实验对鼠伤寒沙门菌中假定转录调控因子进行筛选,以期发现新的转录调控因子和调控机制。方法·通过沙门菌基因组信息分析筛选得到30个假定转录调控因子,利用λ-Red同源重组系统敲除各目的基因。酸耐受实验检测各敲除株在对数期酸耐受应答中的差异;细胞感染模型检测各敲除株上皮细胞入侵能力和巨噬细胞内复制能力;利用realtimePCR检测突变株中pho P及其下游基因的转录水平。结果·成功构建30个敲除株。ΔSTM14_0739、ΔSTM14_2717和ΔSTM14_1646对数期酸耐受能力较WT增强,ΔSTM14_1878、ΔSTM14_4338和ΔSTM14_1965则较WT减弱。ΔSTM14_0739和ΔSTM14_2717对He La细胞的入侵率降低,ΔSTM14_1878和ΔSTM14_2717在RAW264.7细胞内的24 h复制率提高。Realtime-PCR结果显示STM14_2717敲除并不影响pho P转录。结论·研究发现了新的转录调控因子,为深入研究沙门菌致病机制提供新的方向。

猪链球菌2型强毒株05ZYH33转录调控因子Rgg基因敲除突变体与野生株的基因表达差异分析

目的:为了解猪链球菌2型强毒株05Z33转录调控因子Rgg的调控作用,用基因芯片方法分析野生株与rgg基因敲除突变体之间的差异表达基因。方法:用猪链球菌2型全基因组序列点样制备芯片,将芯片运用于rgg敲除株与野生株的基因表达差异研究,采用定量real-time PCR(qRT-PCR)验证表达谱结果。结果:在突变体中共发现45个基因表达量变化在2倍以上,其中19个基因表达上调,26个基因表达下调。这些基因在细菌毒力、免疫抗原、DNA合成和修复、基础代谢和ABC转运系统等方面起着重要作用。结论:转录调控因子Rgg是一个全局调控因子,但rgg敲除后并不影响猪链球菌的毒力。

嗜水气单胞菌AraC家族转录调控因子AetY的功能

为研究嗜水气单胞菌中国流行菌株NJ-35的AraC家族转录调控因子AetY(U876_01475)的功能,本实验采用同源重组技术构建了该基因的缺失株ΔaetY及互补株CΔaetY,并对野生株、缺失株及互补株生物被膜形成能力、自凝集活性、对恩诺沙星的耐药性和对斑马鱼的致病力进行检测。结果显示,与野生株相比,ΔaetY生物被膜形成能力、自凝集活性、对恩诺沙星的最小抑菌浓度(MIC)均显著降低,对斑马鱼致病力明显降低,半数致死量(LD_(50))增加400余倍。CΔaetY各项指标均恢复至野生株水平。本研究首次针对嗜水气单胞菌AraC家族成员进行了基因功能分析,为进一步探究该菌的致病机理提供参考。

猪链球菌2型05Z33强毒株转录调控因子Rgg基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33转录调控因子Rgg的基因敲除突变体,观察其生物学性状,并在动物感染实验中比较敲除株与野生株的毒力差异,为进一步研究猪链球菌转录调控因子在致病中的作用提供实验基础。方法:分别以猪链球菌2型05ZYH33基因组和pSET1质粒为模板,扩增基因SSU05_1997两侧各约500 bp的片段为上下游同源臂,氯霉素(Cm)抗性基因为中间片段,采用重叠PCR方法连接3个片段;连接产物先克隆到T载体上,再经过酶切克隆到温度敏感自杀载体pSET4S上;将构建的基因敲除载体pSET4S-1997电转化入05ZYH33感受态细胞,通过改变培养温度筛选出基因敲除突变体05Z33△rgg;对敲除株和野生株的生物学性状及小鼠和猪的致病性进行了初步比较。结果:PCR分析和测序结果均显示基因SSU05_1997完全被Cm抗性基因所替代,基因敲除突变体构建成功;05ZYH33△rgg对小鼠和猪的致病性与野生株相比无明显差异。结论:转录调控因子Rgg可能和猪链球菌2型的毒力无关。

转录调控因子CsgD强化重组大肠埃希菌生物被膜催化转化桑树黄酮苷的研究

生物被膜催化剂具有可再生、可持续和可扩展等优势,但其生长慢、产量低等问题限制了其在桑树黄酮苷生物转化中的应用。本文以产α-L-鼠李糖苷酶RhaB1的重组大肠埃希菌为研究对象,通过过表达其生物被膜转录调控因子基因csgD,考察CsgD对胞外聚合物分泌、细菌运动和群体感应等生物被膜形成过程关键因子及其催化性能的调控影响。结果表明,过表达菌株形成生物被膜在20 h达到成熟期,比原始菌株延长了25%,生物被膜产量提高了61.51%,说明过表达csgD对生物被膜生长具有促进作用。培养24 h后,过表达菌株分泌的紧密型胞外多聚物中多糖和蛋白质质量浓度为47.54 mg/L和54.72 mg/L,比原始菌株提高了18.24%和37.44%;过表达菌株的游动、群集和蹭行运动半径分别为3.41 mm、7.29 mm和10.61 mm,比原始菌株提高了7.23%、8.00%和7.06%。荧光定量PCR结果显示,过表达菌株中胞外聚合物基因(pgaA、bcsA)、运动性基因(fimH、motB)和群体感应基因(luxS、lsrB、aphA)的表达量显著上升,表明过表达csgD对胞外聚合物分泌、细菌运动和群体感应均具有促进作用。此外,过表达菌株的最适生物被膜催化条件为pH 6.0、温度35℃,此时芦丁转化为异槲皮苷的得率为69.29%,比原始菌株提高了56.74%。本研究表明,csgD基因对重组大肠埃希菌生物被膜形成及催化性能的强化作用,为生物转化桑树黄酮苷生产高附加值产品提供了新的思路。

锌指结构转录调控因子Sp8广泛分布于嗅球并在中间神经元表达

目的探讨锌指结构转录调控因子Sp8在成年健康大鼠嗅球的分布及与嗅球中间神经元的关系。方法4月龄SD大鼠嗅球的冠状位切片,免疫荧光单标观察Sp8在嗅球的分布特点,免疫荧光双标观察Sp8与嗅球PV、TH、CB中间神经元的共表达。结果Sp8免疫阳性细胞在大鼠嗅球各层均有分布,其中主要分布于僧帽细胞层、内丛状层和颗粒细胞层,而在外丛状层最少;Sp8/PV和Sp8/CB双标细胞均主要分布在EPL层,Sp8/TH双标细胞主要分布在突触球层,共表达率均超过90%。结论Sp8广泛分布于嗅球且在其大多数中间神经元表达。