枣ZjPG基因表达分析及载体构建

【目的】克隆枣多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)基因,分析ZjPG基因表达模式并构建过表达载体,为探究ZjPG基因调控枣裂果的分子机制及培育抗裂枣品种提供理论参考。【方法】以壶瓶枣为试验材料,克隆ZjPG基因(ID:LOC107426373),采用ExPASy、SOPMA、SWISS-MODEL等在线工具对ZjPG蛋白进行生物信息学分析;利用MEGA 7.0构建基于PG氨基酸序列的系统发育进化树并分析ZjPG基因启动子顺式作用元件;通过荧光定量PCR检测枣不同组织(幼叶、成熟叶、花、幼果和膨大期、白熟期、脆熟期及完熟期果实)与不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA,0.2和0.4 mol/L)和脱落酸(ABA,0.2 mol/L)处理下枣果实及脆熟期正常果实和开裂果实中ZjPG基因的相对表达量,并构建ZjPG基因过表达载体。【结果】壶瓶枣中ZjPG基因的编码区(CDS)序列全长为1353 bp,与NCBI网站ZjPG基因CDS序列相似性为99.70%,氨基酸序列相似性为99.33%,说明成功克隆ZjPG基因。ZjPG蛋白分子量为49145.28 Da,编码450个氨基酸残基,理论等电点为6.27,无跨膜结构域,为稳定亲水性蛋白,含有Pgu1保守序列。其二级结构由12.67%的α-螺旋,32.22%的延伸链,8.00%的β-折叠及47.11%的无规则卷曲组成。系统发育进化树结果显示,ZjPG与拟南芥AtPG和葡萄VvPG的亲缘关系较近,ZjPG与其他9个物种的PG蛋白基序具有高保守性。ZjPG基因的启动子中包含多个激素响应顺式作用元件。实时荧光定量PCR检测结果显示,ABA和MeJA均可诱导ZjPG基因表达;裂果中ZjPG基因相对表达量显著高于正常果(P<0.05);ZjPG基因在壶瓶枣的叶、花和果实中均有表达,在完熟期果实中的相对表达量最高。成功构建pCAMBIA-1300-ZjPG表达载体。【结论】成功克隆壶瓶枣ZjPG基因CDS序列并成功构建该基因的过表达载体,不同物种之间的PG蛋白序列具有高度保守性,ZjPG基因的表达受到ABA和MeJA信号调控,在裂果中高表达,ZjPG基因表达具有组织特异性和时空特异性。

苦瓜McPDS基因克隆及CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

以苦瓜八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因为靶标,构建其特异gRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体,以期为建立苦瓜CRISPR/Cas9基因编辑技术体系奠定基础。以苦瓜自交系B07叶片cDNA为模板,同源克隆苦瓜McPDS基因CDS序列。结果表明,McPDS基因CDS序列全长1731 bp,编码576个氨基酸,蛋白质相对分子质量为64.44 kD,理论等电点(PI)为7.09。跨膜结构分析结果表明,该蛋白为亲水性非跨膜蛋白。系统进化树分析结果表明,McPDS与黄瓜、甜瓜等葫芦科植物中的PDS蛋白同源性较高。此外,以McPDS为靶标基因,在5’端筛选2个高特异性靶点,经设计引物,成功构建1个双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体,为苦瓜基因编辑体系的建立奠定了技术基础。

甜菜BvPCNA基因RNAi载体构建

【目的】增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)在植物中广泛存在,但是其在植物中的功能研究较少。本研究可以为BvPCNA-like基因的功能分析奠定基础。【方法】课题组前期在甜菜基因组中克隆获得一个基因位点,命名为BvPCNA-like基因,本研究以BvPCNA-like基因的克隆载体为初始材料,选取适宜的靶序列,利用植物表达载体pFGC5941作为基础载体,使靶序列上游启动子为35 S,植物筛选标记为抗除草剂基因BlpR,设计靶序列特异性引物,采取PCR-酶切-连接方法,构建BvPCNA-RNAi载体。【结果】通过RCR鉴定表明已获得了预期目标载体,插入片段由正向靶序列BvPCNA-F、中间片段、反向靶序列BvPCNA-R组成,靶序列长度为320 bp。【结论】本研究所得载体适用于对双子叶植物进行遗传转化,可以作为BvPCNA-like基因理论研究或应用研究的载体材料。

鼠源ATP5B基因克隆及其原核和真核表达载体构建

【目的】克隆鼠源ATP5B基因,构建其原核和真核表达载体,为研究ATP5B蛋白功能及其在病毒感染过程中的作用机制提供基础。【方法】克隆鼠源ATP5B基因编码区(CDS),运用ProtParam、ProtScale和SignalP-5.0等对ATP5B蛋白进行生物信息学分析。采用同源重组方法构建原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag和真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag。以原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,分析最适诱导温度和IPTG浓度。以真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞,通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测ATP5B蛋白在细胞中的表达及分布情况。【结果】鼠源ATP5B基因CDS长1590 bp,鼠源ATP5B蛋白由529个氨基酸残基构成,分子量为55 kD,理论等电点(pI)为5.21,属于稳定的疏水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽,不属于分泌蛋白;鼠源ATP5B蛋白二级结构中α-螺旋占43.67%,无规则卷曲占32.51%,β-转角占9.45%,延伸链占14.37%。原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag经IPTG诱导后,通过考马斯亮蓝染色和Western blotting在81 kD处成功检测到融合蛋白,且主要以包涵体形式表达,诱导条件以30℃、0.5 mmol/L IPTG的效果更好。以真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞后,在55 kD处检测到Flag标签特异性条带,即ATP5B蛋白在HEK-293T细胞中成功表达,IFA检测结果表明该蛋白主要定位在细胞质中。【结论】成功构建鼠源ATP5B基因原核和真核表达载体,原核表达载体表达出的融合蛋白主要以包涵体形式存在,只有少量可溶蛋白,真核表达的ATP5B蛋白主要定位在细胞质中。鼠源ATP5B蛋白是理化性质稳定的疏水性蛋白,无信号肽位点,不属于分泌蛋白。

绣球‘杜丽’AP 3基因克隆与基因编辑载体构建

绣球(Hydrangea macrophylla)是以花序为主要观赏部位的园林植物,多用作切花装饰和景观营造,在亚洲、美洲、欧洲广泛栽培。为探究AP 3基因在绣球花萼形成过程中的功能,加快重瓣绣球新品种培育进程,该研究以绣球‘杜丽’为材料,克隆其MADS-box B类基因HmAP 3,并结合生物信息学方法预测基因功能;根据HmAP 3序列信息,筛选出高特异性编辑靶点并构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过农杆菌转化法将载体整合到绣球基因组中。结果表明:(1)克隆到1段HmAP 3基因的cDNA序列,其序列全长546 bp,共编码181个氨基酸,测序结果表明其氨基酸序列与参考序列一致性为100%,与拟南芥AtAP3相似度为58.8%。(2)不同属植物AP3氨基酸序列差异较大,在同属不同物种中,AP3蛋白主要结构较为保守,仅在少数基序上存在差异。(3)在HmAP 3中共鉴定到2个高特异性靶点,并成功构建2个单靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体。(4)该研究共获得5株基因组内含有Cas 9序列的抗性芽,但其靶点均未突变,在抗性芽中没有检测到Cas9表达。该研究探讨了AP 3基因在重瓣绣球育种中的价值,对绣球的CRISPR/Cas9基因编辑技术进行了初探,为绣球优良品种繁育工作奠定了基础。

辣椒CaWRKY39基因克隆及其酵母单杂交pGADT7载体构建

辣椒是我国重要的经济作物之一,但番茄斑萎病毒(TSWV)极易造成其巨大的生产损失,亟需有效的防治策略。前期研究发现,辣椒转录因子CaWRKY39在TSWV侵染下特异性高表达,推测其可能在辣椒抗TSWV中发挥重要作用。本研究从辣椒‘萧新19’叶片中克隆了CaWRKY39基因,并对其进行生物信息学分析,结果表明,CaWRKY39的CDS全长为1 035 bp,编码一个由344个氨基酸组成、相对分子量为38 570.53 Da、理论等电点为9.59的稳定疏水蛋白,该蛋白二级结构和三级结构主要由无规则卷曲构成,占比为60.76%。系统进化分析发现CaWRKY39蛋白与棉花GhWRKY39蛋白亲缘关系最近,表明两者功能可能具有相似性。为进一步验证CaWRKY39对相关抗性基因的靶向调控作用,采用RT-PCR技术扩增CaWRKY39基因CDS序列,利用NdeⅠ、EcoRⅠ双酶切,并通过无缝克隆的方法成功构建了酵母单杂交表达载体pGADT7-CaWRKY39。本研究结果可为深入研究CaWRKY39转录因子参与辣椒抗TSWV病毒的分子机理提供技术支持和参考。

拟南芥WRKY13基因表达载体构建及鉴定分析

铁是植物生长所必需的微量元素,目前植物受到缺铁胁迫的现象广泛存在,严重影响了植物的生长,减少了作物的产量。因此筛选和克隆植物缺铁胁迫耐受基因对解决农业生产问题具有极大的科学价值和现实意义。文章以拟南芥为实验材料,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术克隆WRKY13基因的启动子区域,成功构建了ProWRKY13∶GUS融合表达载体;利用浸花法将ProWRKY13∶GUS载体转化拟南芥,经鉴定分析后可知,获得了阳性转基因植株。对转基因植株进行缺铁诱导的GUS组织染色,实验结果为研究缺铁胁迫下WRKY13基因的功能及转录水平变化提供了重要依据。

猪转录因子YY1基因克隆、序列特征及真核表达载体构建

YY1(Yin-Yang1,YY1)作为重要的转录因子对基因表达调控起到重要的作用。本研究旨在克隆猪YY1基因CDS区序列,利用生物信息学软件分析猪YY1基因编码蛋白的特性和功能。利用免疫荧光检测YY1在猪卵泡颗粒细胞中的定位;利用同源重组构建YY1真核表达载体,通过qRT-PCR及Western Blot(WB)检测YY1过表达载体在猪原代卵泡颗粒细胞中的表达效率。本研究成功克隆了猪YY1基因全长CDS区,生物信息学分析结果表明猪YY1蛋白由411个氨基酸组成,相对分子质量为44.3 kDa,为亲水性与酸性蛋白,无跨膜结构域与信号肽,二级结构主要含有α-螺旋(16.06%)、延伸链(19.71%)、β-转角(7.54%)和无规则卷曲(56.69%),YY1主要定位于细胞核,共含39个潜在的磷酸化位点,互作蛋白有EP300、E2H2、HDAC1、HDAC2等。免疫荧光检测发现YY1主要在猪原代卵泡颗粒细胞的细胞核中表达,qPCR和Western Blot检测结果显示该真核表达载体在猪原代卵泡颗粒细胞中成功表达。本研究为进一步探究猪转录因子YY1的生物学功能及提高母猪的繁殖率提供了理论依据。

番茄SlERF-H6基因VIGS沉默载体构建

番茄(Solanum lycopersicum)具有较高的营养价值,深受消费者的喜爱,目前番茄已经成为广泛种植的经济作物之一。乙烯响应因子(ethylene response factor,ERF)是一类植物特有的转录因子。ERF在植物形态发生、逆境响应、成熟衰老、激素信号转导和代谢物调节等多种生理过程中起重要的调节作用。文章以番茄的SlERF-H6(LOC101259323)基因为研究对象,通过对SlERF-H6的基因序列进行分析,获得该基因的特异性区域沉默序列。利用同源重组技术成功构建了番茄SlERF-H6病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)载体。为进一步探究番茄SlERF-H6基因在果实成熟中的作用提供参考。

BMP7过表达慢病毒载体构建及其对小鼠主动脉平滑肌细胞钙化的影响

目的构建骨形态发生蛋白7(BMP7)过表达慢病毒载体,分析BMP7过表达对小鼠主动脉内皮细胞Jagged1表达的影响及其对共培养血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响。方法根据目的基因信息Mouse-BMP7(NM_007557.3)和质粒信息pLVX-zsGreen-C1进行基因序列合成,构建BMP7过表达慢病毒。qPCR检测BMP7过表达慢病毒感染效率;Western blot检测其感染的小鼠主动脉内皮细胞Jagged1蛋白表达。将过表达BMP7慢病毒感染的内皮细胞与VSMCs共培养,茜素红染色观察共培养后VSMCs钙化情况。结果成功构建BMP7过表达慢病毒载体并转染至小鼠主动脉内皮细胞。qPCR检测结果提示,与正常对照组比较,BMP7过表达组的BMP7 mRNA相对表达量显著升高(P<0.01),空载体对照组BMP7 mRNA无显著变化(P>0.05)。Western blot结果显示,BMP7过表达组内皮细胞Jagged1蛋白表达水平较正常对照组显著降低(P<0.01),而空载体对照组内皮细胞Jagged1蛋白水平较正常对照组无显著改变(P>0.05)。茜素红染色结果提示,与感染过表达BMP7慢病毒的内皮细胞共培养后,VSMCs的钙化程度明显增加。结论成功构建小鼠BMP7过表达慢病毒载体,并发现过表达BMP7可以降低小鼠主动脉内皮细胞Jagged1表达,并促进共培养的VSMCs钙化。

抗冻基因CBF_2表达载体构建及转化紫花苜蓿的研究

本研究以拟南芥基因组DNA为模板,用PCR方法扩增目的基因,连接到PGEM-T Easy Vector载体上构建成克隆载体T-CBF2。用BamHⅠ和SacⅠ分别对克隆载体T-CBF2和植物表达载体PBI121进行双酶切,获得目的片段和线性质粒。在T4DNA连接酶的作用下进行定向连接,构建成植物表达载体P-T-CBF2。采用直接转化法将重组子导入根癌农杆菌EHA105。经PCR鉴定,重组质粒已成功导入根癌农杆菌中。通过农杆菌介导法转化和田苜蓿,现在已经得到转基因的苜蓿愈伤组织。

一种载体构建的新方法:重组融合PCR法

本研究介绍一种多目的片段一步重组克隆的载体构建的新方法。该方法要求在PCR引物设计时,在第一个目的片段上游引物的5'端和最后一个目的片段下游引物的5'端各设置16bp与线性化目标载体末端同源的序列,再在各目的片段之间的引物上各设计25bp的重叠序列,以便进行融合PCR将多片段扩增成融合片段。此方法将融合片段与线性化骨架载体进行一步重组、转化和重组子鉴定。该方法只要求骨架载体上有一个特异性酶切位点,特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建;该方法还可以引入定点突变,可便捷构建分析启动子功能等需引入定点突变的载体;该构建方法还可以实现多基因的无缝融合构建多顺反子,在构建原核基因表达载体、叶绿体表达载体、线粒体表达载体方面有着明显优势。本研究以水稻胚乳特异性表达载体PGt1-mGFP-pSB130为例,介绍此载体构建方法。

梨ACC氧化酶基因(ACO)的片段克隆及其RNAi载体构建

以若光梨成熟果实为材料,提取总RNA,在ACC氧化酶基因(ACO)cDNA序列同源性较高区域设计一对特异引物,利用RT-PCR克隆了ACC氧化酶(ACO)基因片段。将ACO反义基因、与副球菌中类胡罗卜素合成有关的间隔基因YYT和ACO正义基因3个片段串联在一起,经鉴定后,插入到植物表达载体中,构建成能够表达ACC氧化酶基因的双链RNA的植物载体pYF028,为耐贮砂梨的遗传转化创造条件。

马铃薯Y病毒CP基因RNAi载体构建与干涉效果测定

RNA沉默(RNAi)介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略。马铃薯Y病毒(PVY)在世界范围内引起马铃薯、烟草等重要经济作物的病害,并且造成严重的经济损失。本文以PVY的外壳蛋白(CP)基因为模板扩增300bp和354bp两个片段,正向和反向分别插入植物表达载体pROKⅡ的35S启动子下游,从而构建了以PVY的CP基因为靶标的RNAi植物表达载体pROKY300,转入农杆菌EHA105中,以农杆菌渗入法在本氏烟中瞬时表达与PVYCP同源的hairpin RNA。结果表明,瞬时表达的hairpinRNA有效干涉了PVY侵染。

油茶FAD2基因的植物表达载体和RNA干扰载体构建及其功能分析

茶油是从油茶种子中提取的食用植物油,富含油酸、亚油酸以及亚麻酸等多种人体必需的不饱和脂肪酸。在植物的不饱和脂肪酸生物合成途径中,脂肪酸脱饱和酶(Fatty Acid Desaturase,FAD)有多个家族成员,可以将单不饱和脂肪酸转化成多不饱和脂肪酸,其中FAD2可以将油酸(18∶1Δ9)和棕榈油酸(16∶1Δ9)转化成亚麻酸(18∶2Δ9,11)和十六碳二烯酸(16∶2Δ9,11)。为了揭示油茶FAD2基因的功能,本研究在原有的基础上构建了这个基因的植物表达载体p BI121-Co FAD2以及RNA干扰载体p BI121-Co FAD2 RNAi,并分别对相应的拟南芥突变体和野生型植株进行了转基因研究。结果表明,同野生型相比,fad突变体中,18∶1和16∶1含量较高,18∶2和16∶2含量较低;突变体植株经过植物表达载体的转化后,脂肪酸组分得到了恢复;而野生型植株经过RNA干扰载体的转化后,18∶1和16∶1含量升高,18∶2和16∶2含量降低。由此说明,油茶FAD2基因在植物体内具有调控18∶1和16∶1转变成18∶2和16∶2的功能,对于茶油脂肪酸组分的构成起着关键的调控作用。

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3（AP3）在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育。研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子。因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用。本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）AP3基因启动子序列（U30729）设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plusDNA聚合酶扩增了长度为1767bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其Gen-Bank登录号为FJ619533。Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18（AL132971）9264~11030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白（CAB81799）,说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子。PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等。本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3：：GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。

牡丹PsMADS5基因的克隆、表达及载体构建

以牡丹品种赵粉(Paeonia suffruticosa L.cv.Zhao Fen)为试材,采用RT-PCR和RACE法从花瓣中获得了1个牡丹SEPALLATA基因cDNA,命名为PsMADS5,GenBank登录号为HQ449569。其cDNA全长1222bp,包含190bp的5'非编码区、302bp的3'非编码区和1个长度为732bp编码243个氨基酸的开放阅读框。序列比对和系统进化分析表明,PsMADS5与葡萄的亲缘关系最近,相似性达83%以上,属于MADS家族SEP亚家族。相对荧光定量PCR分析表明,PsMADS5在花瓣中的表达量最高,其次是心皮,再次是萼片,在雄蕊中表达量最低。成功构建正义和反义表达载体,为牡丹花型改良和品种创新提供基础。

水稻叶绿体16S启动子克隆改造、载体构建及转化研究

利用PCR方法从水稻叶绿体基因组DNA中分离 1 6S启动子 ,并在其下游加入rbcL基因SD序列 ,以增强该启动子的翻译能力 ;序列分析表明 ,除加入的SD序列外 ,扩增片段与水稻 (Oryzasativa)叶绿体基因组DNA序列 1 6S启动子相应区域同源性为 1 0 0 %。将 1 6S启动子与bar基因和gfp基因的融合基因连接 ,以psbA基因的 3′序列为终止子 ,并以烟草叶绿体trnH_psbA和trnK为同源片段构建了烟草叶绿体表达载体pR1 6S。用基因枪转化烟草 ,转化植株经Southern、Northern检测及后代遗传学分析 ,发现1 6S启动子具有启动活性 。

植物hpRNA干扰载体构建的研究进展

RNAi技术在基因功能鉴定和功能基因表达调控中发挥着重要作用。hpRNA干扰载体被广泛用于植物的RNAi研究。对植物hpRNA干扰载体的构建方法进行综述,并分析其优缺点,为植物hpRNA干扰载体构建方法的选择提供参考。

一种通用高效的复杂载体构建的新方法

文章报道了一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法。此法是在PCR引物设计时,在目的片段5′端加上随机设计的接头,利用PCR克隆目的片段,再用T4DNA聚合酶3′→5′外切酶活性处理PCR克隆目的片段,产生多个首尾相匹配的黏性末端,进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。以7片段拼接的水稻单交换质体定点整合表达载体pRSMGA的构建为例,应用上述方法构建只需做两次连接、转化,且其重组、转化效率高。数10次实验证明:这是一种简便、通用、高效的复杂构建载体的方法,该法至今尚未见报道。