新型Na^(+)/H^(+)逆向转运蛋白UPF0118的Na^(+)结合鉴定

UPF0118蛋白是一种新型Na^(+)(Li^(+))/H^(+)逆向转运蛋白,属于AI-2E超家族,目前已被划分至Na^(+)/H^(+)逆向转运蛋白亚家族,但无直接证据表明该蛋白可与Na+产生相互作用。为鉴定UPF0118蛋白是否具有Na^(+)结合功能,利用PCR技术扩增upf0118基因编码序列,通过Eco RⅠ和PstⅠ酶切位点构建至原核表达载体p ETDuet-1,转化至E. coli BL21*(DE3),对诱导后大量表达的蛋白进行Ni^(2+)亲和层析和凝胶过滤层析,利用等温滴定量热技术对纯化蛋白进行滴定。结果表明,在pH 5.5条件下,Na^(+)滴入导致蛋白溶液产生明显放热现象。在pH 5.5条件下该蛋白具有Na^(+)结合功能,证明该蛋白Na+结合功能为其功能单元与分子机制的研究奠定基础。

茱萸丸调控TMA/FMO3/TMAO通路促进胆固醇逆向转运抗动脉粥样硬化

目的旨在研究茱萸丸对动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)形成的影响及其相关机制。方法采用高脂饲料喂养雄性载脂蛋白E基因敲除(ApoE^(-/-))小鼠诱导动脉粥样硬化模型,造模周期为12周。造模成功的47只ApoE^(-/-)小鼠随机分成5组,即模型组10只,茱萸丸低、中、高剂量组各9只,阿托伐他汀钙组10只,以同周龄雄性C57BL/6J小鼠10只作为空白组。空白组与模型组予等体积无菌蒸馏水灌胃,茱萸丸低、中、高剂量组分别给予130.54、261.08、522.16 mg·kg^(-1)灌胃,阿托伐他汀钙组10.40 mg·kg^(-1)灌胃,每日1次,各组小鼠共灌胃12周。给药结束后,采用苏木精-伊红(HE)染色观测主动脉及肝脏病理变化;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、单核细胞趋化蛋-1(MCP-1)、血管细胞黏附分-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)水平;生化法检测肝脏总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;超高效液相色谱-质谱联用技术(UHPLC-MS/MS)检测血浆三甲胺(TMA)、氧化三甲胺(TMAO)含量;免疫荧光法检测小鼠肝脏中二甲基苯胺单加氧酶3(FMO3)蛋白的表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测肝脏FMO3、腺苷三磷酸结合盒转运蛋白A1(ABCA1)、B族Ⅰ型清道夫受体(SR-B1)、ATP结合盒转运子G5抗体(ABCG5)、三磷酸腺苷结合盒转运体G8(ABCG8)和细胞色素P4507A1(CYP7A1)mRNA表达水平。结果与空白组比较,模型组小鼠HE染色可见主动脉内膜大面积增厚,肝脏脂肪变性及炎性浸润严重;血清中ox-LDL、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1升高;肝脏TC、TG、LDL-C升高;血浆中TMA、TMAO水平升高;以及肝脏中FMO3 mRNA与蛋白表达水平升高,ABCA1、SR-B1、ABCG5、ABCG8、CYP7A1 mRNA表达水平升高(P<0.01)。与模型组比较,茱萸丸低、中、高剂量组及阿托伐他汀钙组HE染色随着茱萸丸浓度的增加,斑块富集区域逐渐缩小,肝脏脂肪变性及炎性浸润降低;血清中ox-LDL、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1降低;肝脏TC、TG、LDL-C降低;血浆中TMA、TMAO水平降低;以及肝脏中FMO3 mRNA与蛋白表达水平降低,ABCA1、SR-B1、ABCG5、ABCG8、CYP7A1 mRNA表达水平降低(P<0.01或P<0.05)。结论茱萸丸对小鼠动脉粥样硬化斑块具有较好的治疗作用,其机制可能与调节TMA/FMO3/TMAO脂代谢通路,促进胆固醇的逆向转运和分解有关。

不同类型盐生植物适应盐胁迫的生理生长机制及Na^(+)逆向转运研究进展

盐生植物是指能在离子浓度至少200 mmol/L以上的生境中生长并完成生活史的植物。盐生植物可分为稀盐盐生植物、泌盐盐生植物、拒盐盐生植物三类。本文从生长形态、生理和分子3个方面总结三类盐生植物响应盐胁迫的不同策略及研究进展,发现盐生植物在分子水平上主要通过Na^(+)转运蛋白和为其提供能量的两类基因应对体内过高Na^(+),这可能是引起盐生植物生理和生长形态异于非盐生植物的重要因素。其中稀盐盐生植物主要通过液泡离子区隔化应对盐胁迫,并表现出肉质化生长形态;泌盐盐生植物通过将体内盐分排出体外应对盐胁迫,并进化出特有的生理结构——盐腺或盐囊泡;拒盐盐生植物通过将盐离子积累在皮层细胞液泡和根部木质部薄壁细胞中减少向上运输Na^(+),同时根部多栓质化减少Na^(+)吸收。本综述旨在为今后研究盐生植物及其耐盐机制提供相关依据,为植物耐盐分子育种奠定基础。

丹参酮ⅡA促进胆固醇逆向转运改善动脉粥样硬化

目的探究丹参酮ⅡA对动脉粥样硬化模型小鼠及巨噬细胞RAW264.7胆固醇逆向转运的影响及其作用机制。方法雄性LDLR-/-小鼠32只随机分为4组,给予普通饲料或高脂饲料喂养12周。对照组、模型组给予生理盐水,丹参酮ⅡA组、阿托伐他汀组给予丹参酮ⅡA溶液、阿托伐他汀溶液干预12周。RAW264.7细胞用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)100 mg·L^(-1)诱导24 h,并同时给予含有丹参酮ⅡA低、中、高剂量(10、20、40μmol·L^(-1))的培养基。检测小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C值。油红O染色观察小鼠主动脉根部、RAW264.7细胞内脂质积聚。Western blot测定小鼠主动脉组织、肝组织、RAW264.7细胞ABCA1、ABCG1蛋白表达。结果与模型组比较,丹参酮ⅡA、阿托伐他汀降低小鼠血清TC、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平(P<0.05),减小小鼠主动脉根部斑块相对管腔面积比值,上调小鼠主动脉组织、肝组织ABCA1、ABCG1蛋白水平(P<0.05);丹参酮ⅡA减少RAW264.7细胞内的脂滴累积,ABCA1、ABCG1蛋白表达增加(P<0.05)。结论丹参酮ⅡA通过促进胆固醇逆向转运,抑制泡沫细胞形成,改善脂代谢,发挥抗动脉粥样硬化的作用。

载脂蛋白E在胆固醇逆向转运中作用的研究进展

载脂蛋白E(ApoE)是一种多功能蛋白质,参与血浆脂蛋白的清除、荷脂细胞的胆固醇外流及逆向转运等多种生理过程,降低人体低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白的含量,从而降低患动脉粥样硬化(As)等心血管疾病的概率。基于对ApoE结构功能和作用机制的认识,ApoE模拟肽类药物为治疗As等心血管疾病提供新的方向。本文主要对ApoE在细胞胆固醇流出及胆固醇逆向转运等生理过程中的作用机制和ApoE模拟肽类药物研究进展进行综述,以期为As的防治提供新的思路。

番杏Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因的克隆及特性分析

根据同源序列设计筒并引物，通过RT—PCR及RACE的方法从盐生植物番杏中克隆出Na^+／H^+逆向运输蛋白基因。序列分析表明，该cDNA全长2199bp，开放读码框为1665bp，可编码一个554个氨基酸的多肽，与其他植物中已经克隆的Na^+／H^+逆向转运蛋白具有很高的同源性。系统发育分析表明该蛋白(TtNHX1)与液泡型的Na^+／H^+逆向转运蛋白的亲缘较近，与质膜型的Na^+／H^+逆向转运蛋白亲缘关系较远。TtNHX1的表达具有组织特异性，在番杏的根、茎和叶中均有表达，而花中没有表达。经NaCl诱导后根、茎和叶中的表达量增加，而花中仍没有表达。

桑树Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(MnNHX1)的克隆与耐盐力表达

【目的】研究川桑液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)基因的功能,探究桑树耐盐机制,为植物抗逆基因工程筛选提供优良的候选基因。【方法】以川桑基因组数据库为基础,基于同源基因序列的保守性,以川桑叶片cDNA为模板克隆川桑液泡膜型NHX基因;利用生物学软件和在线公共平台,分析所得基因编码的蛋白质序列及功能结构域,并构建系统进化树,分析与其他物种的亲缘关系。采用荧光定量PCR方法研究在NaCl胁迫条件下不同时间段‘湖桑32号’根、茎、叶等不同组织中桑树NHX1表达量的变化情况;通过构建超量表达载体,将其转化到拟南芥中,分析转基因拟南芥在Na Cl胁迫环境中的种子发芽数,根长、侧根生长情况和幼苗成活率,并对转基因拟南芥连续浇灌含高浓度Na Cl的营养液,研究过量表达NHX基因对拟南芥的影响。【结果】本研究得到1个液泡膜型NHX基因,命名为MnNHX1(Gen Bank登录号:KJ720637);该基因ORF长度为1 644bp,编码547个氨基酸残基,具有Na+/H+交换泵,且在其上游含有抑制剂氨氯吡嗪脒结合位点(LFFIYLLPPI)以及糖基化位点等结构域,TMHMM在线程序预测Mn NHX1具有12个明显的跨膜结构区;系统进化树分析结果显示,Mn NHX1具有较高的保守性,先与源于蔷薇科的桃聚合,与桑树形态学和基因组进化分析分类结果一致。荧光定量PCR试验表明,在无Na Cl胁迫条件下桑树NHX1在‘湖桑32号’根、茎、叶中均有表达;在Na Cl胁迫处理12 h后,根、茎中桑树NHX1的表达量显著增加,而后回落;而在胁迫处理24 h后,叶中桑树NHX1的表达量显著提高,随后回落。过量表达Mn NHX1的转基因拟南芥在Na Cl胁迫环境中,种子发芽率低于野生型,而根长和侧根生长情况以及幼苗成活率都优于野生型;连续浇灌含高浓度Na Cl营养液的转基因拟南芥生长状态更为优良。【结论】MnNHX1为优良的植物耐盐基因,在桑树中为组成型表达,并受Na Cl胁迫诱导,表现出组织特异性。过量表达Mn NHX1的拟南芥耐盐能力显著提高,生存在盐胁迫环境中,依然具有良好的生长和发育能力。

紫花苜蓿Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的耐盐性

以紫花苜蓿(Medicago sativa)为材料,利用反转录PCR方法分离了NHX1全长cDNA(命名为MsNHX1)。Southern杂交结果表明,在紫花苜蓿中存在一个小的液泡型Na+/H+逆向转运蛋白基因家族。序列分析表明,该基因所编码的蛋白与拟南芥、水稻和棉花中液泡型Na+/H+逆向转运蛋白具有较高的同源性。在洋葱表皮细胞中瞬时表达MsNHX1-GFP融合基因的结果表明,MsNHX1定位在液泡膜上。Northern杂交发现该基因的表达受高浓度NaCl诱导。MsNHX1在盐敏感酵母突变体中表达可以提高转化子对NaCl的耐受性,说明MsNHX1具有转运Na+的功能。在拟南芥中表达MsNHX1能显著提高植株耐受盐胁迫的能力;而且在受到盐胁迫时,转基因植株比野生型的渗透调节能力更强,生物膜受破坏程度降低,光合能力增强。以上研究结果表明MsNHX1是一个液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白,在植物耐受盐胁迫过程中起重要作用。

Na^+/H^+逆向转运蛋白和植物耐盐性

Na+ H+逆向转运蛋白对植物耐盐起着重要作用 ,它利用质膜H+ ATPase或液泡膜H+ ATPase及PPiase泵H+产生的驱动力把Na+排出细胞或在液泡中区隔化以消除Na+的毒害。主要讨论植物中Na+

菊芋Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆与表达分析

根据同源序列设计简并引物,通过RT-PCR及RACE的方法从菊芋中克隆了Na+/H+逆向转运蛋白基因。序列分析表明,该基因全长2148 bp,开放读码框为1647 bp,可编码长549个氨基酸的多肽,与其它植物已克隆的Na+/H+逆向转运蛋白具有很高的同源性。系统发育分析表明该蛋白(HtNHX1)与液泡型Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。NaCl胁迫条件下RT-PCR检测结果表明,HtNHX1随NaCl浓度增加和处理时间延长表达持续增强,但到了第3天表达量开始下降。HtNHX1逆向转运蛋白基因的转录调控可能是决定菊芋耐盐能力的一个重要因素。

一个新的水稻液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆及表达特征

通过RT-PCR技术从水稻幼苗组织中克隆了一个新的Na+/H+逆向转运蛋白基因OsNHX2,它编码一条长544氨基酸的多肽。OsNHX2与水稻和拟南芥的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白OsNHX1、AtNHX1氨基酸序列一致性分别为78%和77%。基因结构分析表明OsNHX2与OsNHX1具有类似的外显子和内含子构成,但不同于拟南芥AtNHX1,表明OsNHX2与OsNHX1可能起源于单双子叶植物分化后的水稻染色体复制。半定量RT-PCR方法检测了OsNHX2与OsNHX1在水稻耐盐品种韭菜青与盐敏感品种IR28的地上部与根部的表达。结果表明:耐盐品种韭菜青的OsNHX2与OsNHX1基因在盐胁迫下表达持续增强,而在盐敏感品种IR28的地上部,OsNHX2基因在盐胁迫处理后1h表达增强后立即减弱,根部的表达则基本不变,而IR28地上部与根部OsNHX1则在盐胁迫处理初期表达增强,随后即减弱。研究结果表明水稻两个液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因OsNHX2、OsNHX1在盐敏感程度不同的水稻品种中表达有所不同,液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的转录调控可能是决定水稻耐盐能力的一个重要因素。

中间偃麦草Na^+/H^+逆向转运蛋白的分子克隆及生物信息学分析

根据小麦液泡膜Na+/H+逆转运蛋白基因TaNHX1的全长序列设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法从中间偃麦草(Elytrigia intermedia)中克隆到了TaNHX1的同源基因,命名为TiNHX1(Acession Numeber:EF409418)。TiNHX1最大开放阅读框为1 641 bp,编码含有546个氨基酸残基、分子量为59.8 kDa的蛋白,预测等电点8.0。TiNHX1含有38个碱性氨基酸,36个酸性氨基酸,256个疏水氨基酸及129个极性氨基酸。二级结构预测表明该蛋白含约44%的α-螺旋、21%的β-折叠、4%的β-转角和29%的不规则卷曲。亲疏水性分析显示,TiNHX1含有12个连续的疏水片断,其中10个可能构成穿膜螺旋。序列分析显示,TiNHX1与小麦(Triticum aestivum)、长穗偃麦草(Elytrigia elongate)、水稻(Oryza sativa)、小盐芥(Thellungiella halophila)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等植物的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白高度同源,序列相似性分别为97%、96%、85%、68%、67%。序列比对结果以及进化树分析均表明TiNHX1应为定位于中间偃麦草液胞膜上的Na+/H+逆向转运蛋白。

植物Na^+/H^+逆向转运蛋白研究进展

盐胁迫主要由Na+ 引起 ,过高的Na+ 浓度引起的离子毒害 ,渗透胁迫和K+ /Na+ 比率的不平衡使植物新陈代谢异常 ,这是对大多数器官造成伤害的原因。植物抵御盐胁迫的主要方式是将细胞内过多的Na+ 从质膜向细胞外排放和将Na+ 在液泡中区隔化 ,这一过程是由Na+ /H+ 逆向转运蛋白完成的。本文概述了植物中Na+ /H+ 逆向转运蛋白的发现、特征、分子生物学方面的研究 ,以及Na+ /H+

Na^+/H^+逆向转运蛋白及其与植物耐盐性的关系

在概述了Na+ /H+ 逆向转运蛋白的分子组成、生化性质、生理功能的基础上 ,介绍了此种蛋白对盐胁迫的响应及其与耐盐性的关系 ,并对有关Na+ /H+

Na^+/H^+逆向转运蛋白与植物耐盐性关系研究进展

Na+/H+逆向转运蛋白与植物的耐盐性有密切的关系。在高等植物体内,主要存在两种Na+/H+逆向转运蛋白,分别为位于细胞质膜上的逆向转运蛋白SOS1,以及存在于液泡膜上的AtNHX1。质膜Na+/H+逆向转运蛋白主要负责Na+的外排,液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白主要负责把Na+区隔化入液泡。过量表达质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1或液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白AtNHX1能够明显提高植物的耐盐性。对植物中Na+/H+逆向转运蛋白及其与植物耐盐性之间的关系最新研究进展作一概述。

唐古特白刺质膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆与表达分析

土壤中过多的Na+会导致植物产生盐害,严重影响植物的生长和发育。质膜型Na+/H+逆向转运蛋白SOS1介导植物细胞内过量的Na+外排,在植物抵御盐胁迫过程中起着重要的作用。唐古特白刺隶属于蒺藜科白刺属,是中国特有的盐生植物,主要生长于西北地区的荒漠或盐渍化荒漠,具有极强的抗逆能力。应用简并RT-PCR及RACE技术克隆获得唐古特白刺Na+/H+逆向转运蛋白NtSOS1基因(GenBank登录号KC292267)。序列分析显示,该cDNA全长4 008bp,包含3 492bp的开放阅读框,编码分子量为127.59kDa的蛋白质。疏水性分析预测NtSOS1基因编码蛋白N端具有11个跨膜结构域,C端具有一个面向胞质的长亲水尾部,包含保守环核苷酸结合区域、自我抑制基序及磷酸化位点等多个活性调控结构域。NtSOS1氨基酸序列与葡萄、霸王、拟南芥等植物的SOS1序列同源性较高,分别可达71.77%,68.94%,62.65%。系统发育分析表明NtSOS1基因为质膜型Na+/H+逆向转运蛋白,与液泡型Na+/H+逆向转运蛋白属于不同分支。半定量RT-PCR结果显示冷、热、盐和干旱胁迫都可以诱导NtSOS1基因的表达,同时,NtSOS1基因随着盐处理浓度增加呈现出先上升(0～300 mmol/L)后下降(400mmol/L)的趋势。结合植物的生境特点和NtSOS1表达模式分析,该基因表达水平的升高可能在唐古特白刺适应恶劣生境的过程中发挥积极作用。本研究的开展为利用NtSOS1基因进行作物与牧草改良并深入研究唐古特白刺抗逆分子机制奠定了基础。

荞麦主要拒Na^＋部位及其Na^＋／H^＋逆向转运活性的研究

【目的】确定荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)的主要拒Na+部位、质子泵和Na+/H+逆向转运活性与其拒Na+特性的关系。【方法】以耐盐荞麦品种川荞1号和盐敏感荞麦品种TQ-0808为试验材料,采用"压力室"法压取木质部汁液,测定各部位拒Na+能力;采用蔗糖密度梯度离心法分离细胞质膜和液泡膜,测定质子泵和Na+/H+逆向转运活性。【结果】盐敏感品种的主要拒Na+部位在根部,耐盐品种的主要拒Na+部位在根部和茎基部,耐盐品种整体拒Na+能力明显大于盐敏感品种;相同盐浓度处理下,耐盐品种质子泵和Na+/H+逆向转运活性明显大于盐敏感品种,说明耐盐品种主要拒Na+部位细胞的排Na+能力和Na+区隔化能力明显大于盐敏感品种。【结论】耐盐品种主要拒Na+部位Na+的区隔化在限制Na+向地上部运输中发挥了重要作用,是耐盐荞麦品种主要拒Na+部位拒Na+的主要方式。

小拟南芥Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆及生物信息学分析

为了克隆新疆特色植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)的Na+/H+逆向转运蛋白基因,本研究以经200mmol/L NaCl胁迫诱导12h的叶片总cDNA为模板,采用RT-PCR技术克隆到Na+/H+逆向转运蛋白基因,命名为ApNHX1(GenBank登录号:JF357965)。结果表明:ApNHX1全长开放阅读框1617bp,编码538个氨基酸残基。利用相关的生物信息学软件对ApNHX1蛋白氨基酸的等电点、结构域、二级结构组成、跨膜结构、亲水性等进行研究,并且构建植物NHX1基因家族系统进化树,结构表明ApNHX1和拟南芥、鼠尔芥、盐芥和油菜等的NHX1同源基因遗传距离最为接近,属于Ⅰ型液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白。因此,构建植物过量表达载体p35S::ApNHX1,转化到农杆菌GV3101中,这为进一步研究基因功能奠定基础。

胆汁途径与非胆汁途径胆固醇逆向转运研究新进展

血浆中胆固醇水平升高是引起动脉粥样硬化(AS)及冠心病的主要危险因素。胆汁途径胆固醇逆向转运(RCT)是指外周组织以及巨噬细胞内胆固醇经脂蛋白运输到肝脏,以胆汁形式分泌,并最终通过粪便排出体外的过程。大量研究显示,除胆汁途径RCT之外,还存在非胆汁途径RCT来清除体内过多胆固醇,从而维持体内胆固醇的动态平衡。本文针对不同途径RCT以及各相关转运体、脂蛋白、受体等对RCT调节的最新进展做一综述,以期为胆石症和AS相关疾病的治疗提供新的理论依据和作用靶点。

新疆无苞芥Na＋/H＋逆向转运蛋白基因OpNHX1的克隆、表达分析与功能验证

从耐盐植物无苞芥中克隆获得了1个Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1,命名为OpNHX1(GenBank登录号:KC200248)。OpNHX1基因cDNA全长2 153 bp,包含一个1 605 bp的开放阅读框,编码534个氨基酸。系统进化树分析表明,OpNHX1编码产物与拟南芥、小盐芥亲缘关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明,该蛋白基因在无苞芥根、茎、叶、花和荚果中均有表达,其中茎中表达量最高。半定量RT-PCR分析表明,该基因受高盐、干旱、低温及ABA的诱导上调表达。进一步将该基因在拟南芥中过量表达,显著提高了转基因植株在盐胁迫下的存活率,说明OpNHX1基因参与了植物的耐盐性。酵母功能互补试验结果显示,该基因转化酵母Δnhx1后可以补充NHX1的缺失,表明OpNHX1参与Na+/H+的转运。