雷帕霉素上调人脐静脉内皮细胞自噬活性抑制细胞增殖

目的探讨人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬激活对细胞增殖的影响。方法使用雷帕霉素(Rapa)处理HUVECs,Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin 1和unc-51样激酶1(ULK1)的表达,透射电镜(TEM)检测自噬小体,丹酰尸胺染色(MDC)检测自噬荧光;CCK-8法和EdU法检测自噬激活对细胞增殖的影响;血管形成实验检测成管能力。结果Rapa处理后,与对照组相比,LC3、Beclin 1和ULK1表达增强,实验组绿色自噬荧光表达强于对照组,TEM可见自噬小体;CCK-8和EdU结果显示,与对照组相比,实验组细胞自噬活化后细胞增殖能力减弱,成管能力降低。结论在一定时间内,Rapa上调HUVECs自噬活性抑制细胞增殖。

鳖甲煎丸对肝癌大鼠黏着斑激酶/雷帕霉素靶蛋白通路的影响

目的:探讨鳖甲煎丸对肝癌模型大鼠肝组织病理特征及FAK/mTORC1通路的影响。方法:HepG2(1×10^(7))细胞注射于大鼠右腋皮下,建立肝癌模型,分为模型组、5-氟尿嘧啶组、鳖甲煎丸低剂量组、鳖甲煎丸高剂量组,另设正常组。各药物组给予相应药物灌胃,持续给药4周,正常组、模型组给予等体积的0.9%氯化钠溶液。实验结束后,测定肝癌组织重量、肝癌组织体积、肝癌组织抑瘤率、肝癌FAK、mTORC1水平、肝癌VEGFR-2、VEGF、IL-4、IL-8、TNF-α蛋白水平。结果:与正常组比较,模型组肝癌组织重量、肝癌组织体积、肝癌组织抑瘤率、VEGFR-2、VEGF、IL-4、IL-8、TNF-α蛋白、肝癌FAK、mTORC1 mRNA和蛋白表达升高(均P<0.05)。与模型组比较,5-氟尿嘧啶组、鳖甲煎丸低剂量组、鳖甲煎丸高剂量组肝癌组织重量、肝癌组织体积、肝癌组织抑瘤率、VEGFR-2、VEGF、IL-4、IL-8、TNF-α蛋白、肝癌FAK、mTORC1 mRNA和蛋白表达降低(均P<0.05)。鳖甲煎丸高剂量组肝癌组织重量、肝癌组织体积、肝癌组织抑瘤率、VEGFR-2、VEGF、IL-4、IL-8、TNF-α蛋白、肝癌FAK、mTORC1 mRNA和蛋白表达低于鳖甲煎丸低剂量组(均P<0.05)。结论:鳖甲煎丸对大鼠肝癌具有明显抑制作用,能减轻大鼠肝癌所致的病理损伤,其机制可能与鳖甲煎丸抑制肝癌FAK、mTORC1表达,诱导肝癌细胞凋亡,降低炎症反应有关。

雷帕霉素在移植物抗宿主病防治中作用的研究进展

移植物抗宿主病(GVHD)降低异基因造血干细胞移植后患者的疗效和生活质量,特别是激素耐药的GVHD,探索新的防治策略至关重要。雷帕霉素通过抑制mTOR信号通路,在急、慢性GVHD的预防和治疗中均显示出一定的临床优势。另外,雷帕霉素可以调节T细胞、B细胞、树突细胞、骨髓来源的抑制细胞等细胞亚群,阐明了其有效防控GVHD的机制。本文就mTOR抑制剂雷帕霉素防治GVHD的最新研究进展作一综述,同时就如何优化使用雷帕霉素提出新的思考。

肝细胞DEP结构域蛋白5/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1信号轴在非酒精性脂肪肝形成中的作用

目的建立肝细胞Dishevelled/Egl-10/pleckstrin(DEP)结构域蛋白5(DEPDC5)基因(Depdc5)肝细胞特异性敲除小鼠高脂喂养模型,探讨DEPDC5/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)信号轴对非酒精性脂肪肝的调控。方法构建肝细胞特异性敲除Depdc5^(flox/flox)模型;Alb-Cre小鼠(LKO),Depdc5^(flox/flox)小鼠(Loxp)作为对照。32只2~3月龄雄性小鼠随机分为高脂LKO组、高脂Loxp对照组、高脂+雷帕霉素LKO组及高脂+雷帕霉素Loxp对照组,每组8只。检测肝脏血清生物化学指标、脂质含量、蛋白、mRNA及病理切片,采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。结果高脂喂养导致LoxP小鼠肝脏脂肪变性,LKO小鼠肝脏脂肪变性减轻但合并出现肝损伤;雷帕霉素抑制了Depdc5敲除引起的mTORC1通路激活,显著改善Loxp小鼠肝脏脂肪变性,并改善LKO小鼠的肝损伤。结论Depdc5基因敲除能够保护高脂喂养小鼠肝脏脂肪变性,雷帕霉素可以改善DEPDC5缺失诱发的肝损伤。

药物涂层球囊与雷帕霉素洗脱支架治疗冠状动脉小血管病变患者的效果比较

目的:比较药物涂层球囊与雷帕霉素洗脱支架治疗冠状动脉小血管病变患者的效果。方法:选取2021年3月至2022年2月该院收治的60例冠状动脉小血管病变患者进行前瞻性研究,依据随机数字表法将其分为对照组与研究组各30例。两组均接受经皮冠状动脉介入治疗,对照组植入雷帕霉素洗脱支架,研究组使用药物涂层球囊治疗,术后随访1年。比较两组术前、术后即刻、术后1年时病变血管最小管腔直径(MLD)和狭窄程度,晚期管腔丢失情况以及并发症发生率。结果:术后即刻,两组MLD均大于术前,狭窄程度均低于术前,但组间比较差异均无统计学意义(P>0.05);术后1年,两组MLD均小于术后即刻,狭窄程度均高于术后即刻,但研究组MLD大于对照组,狭窄程度低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);术后1年,研究组晚期管腔丢失小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);研究组并发症发生率为13.33%(4/30),低于对照组的36.67%(11/30),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:药物涂层球囊治疗冠状动脉小血管病变患者近期疗效与雷帕霉素洗脱支架相当,但远期疗效更好,术后1年时MLD更大、狭窄程度更低,可减少晚期管腔丢失,降低支架内血栓形成、再狭窄等并发症发生率。

国产雷帕霉素药物洗脱支架和紫杉醇药物洗脱球囊对冠心病患者近期预后的影响

目的探究国产雷帕霉素药物洗脱支架与紫杉醇药物洗脱球囊对冠心病患者经皮冠状动脉介入术(PCI)近期预后的影响。方法研究对象为2020年3月至2021年3月在新乡医学院第一附属医院接受介入治疗的冠心病患者,回顾性选取56例接受国产雷帕霉素药物洗脱支架置入的患者作为药物洗脱支架组,另选取57例接受紫杉醇药物洗脱球囊扩张的患者作为药物球囊洗脱组,均进行1 a随访,对术前术后1周时的心率变异性指标、冠状动脉造影结果参数、靶病变管腔直径及狭窄情况及血清激肽释放酶1(KLK1)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)、内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)水平进行比较,并比较术后1 a内发生不良心血管事件情况。结果两组术前和术后1周的正常窦性RR间期标准差(SDNN)、均值标准差(SDANN)、相邻NN间期之间差大于50 ms数占比(pNN50)、靶病变参考血管直径、最小管腔直径、直径狭窄率组间差异无统计学意义(P>0.05),术后1周两组SDNN、SDANN、pNN50、靶病变最小管腔直径指标均较术前升高(P<0.05),直径狭窄率较术前降低(P<0.05),靶病变参考血管直径较术前无变化(P>0.05)。术前,两组患者的KLK1、TIMP-1、ET-1、NO水平差异无统计学意义(P>0.05),术后1周两组KLK1、NO水平较术前升高且研究组更高,TIMP-1、ET-1水平较术前降低且研究组更低(P<0.05)。两组随访期内不良心血管事件发生率差异无统计学意义(P>0.05)。结论在对冠心病患者进行PCI治疗时,使用国产雷帕霉素药物洗脱支架与紫杉醇药物洗脱球囊近期预后方面的效果相似,且不会增加患者预后不良风险。

雷帕霉素对人晶状体上皮细胞侵袭、迁移及炎症因子TNF-α、 IL-6、MIP-1α的影响

目的探讨雷帕霉素(RAPA)对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的人晶状体上皮细胞侵袭、迁移,以及对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)的影响。方法体外培养人晶状体HLE-B3细胞系,分为Con组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+RAPA组、Y组、RAPA+Y组和RAPA+A组。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定细胞活力;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α、IL-6和MIP-1α表达水平;采用Transwell小室法检测细胞侵袭、迁移能力;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测上皮间质转化(EMT)相关基因、蛋白的相对表达量;采用蛋白免疫印迹(WB)法测定EMT和转化生长因子-β(TGF-β)/Smads信号通路相关蛋白的相对表达量。结果细胞活力实验结果显示,选择50μmol/L的H_(2)O_(2)作为造模条件进行后续实验,选择20 nmol/L RAPA加入TGF-β1/Smads信号通路抑制剂LY2109761和激活剂SRI-011381进行TGF-β1/Smads信号通路验证实验。与Con组比较,H_(2)O_(2)组TNF-α、IL-6、MIP-1α表达水平,细胞迁移与侵袭能力,N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及纤维粘连蛋白(FN)的mRNA、蛋白相对表达量,TGF-β1、p-Smad3蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05),E-钙粘蛋白(E-cadherin)的mRNA、蛋白相对表达量和Smad7蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,H_(2)O_(2)+RAPA组和Y组TNF-α、IL-6、MIP-1α表达水平,细胞迁移与侵袭能力,N-cadherin、Vimentin及FN mRNA、蛋白相对表达量,TGF-β1、p-Smad3蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05),E-cadherin mRNA、蛋白相对表达量和Smad7蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05);与H_(2)O_(2)+RAPA组比较,RAPA+Y组TNF-α、IL-6、MIP-1α表达水平,细胞迁移与侵袭能力,N-cadherin、Vimentin及FN mRNA、蛋白相对表达量,TGF-β1、p-Smad3蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05),E-cadherin mRNA、蛋白相对表达量和Smad7蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05),RAPA+A组TNF-α、IL-6、MIP-1α表达水平,细胞迁移与侵袭能力,N-cadherin、Vimentin及FN mRNA、蛋白相对表达量,TGF-β1、p-Smad3蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05),E-cadherin mRNA、蛋白相对表达量和Smad7蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05)。结论RAPA可显著抑制H_(2)O_(2)诱导的人晶状体上皮HLE-B3细胞的侵袭、迁移能力,抑制EMT进程,并且缓解炎症反应,其作用机制可能与抑制TGF-β1/Smads通路的信号转导有关。

关于纳米粒子载雷帕霉素药物涂层球囊制备的研究进展

心血管疾病是全球最常见的死因之一,其治疗方法是医学研究的重要范畴。文章通过聚乳酸-聚乙醇酸将载有雷帕霉素的中空介孔二氧化硅纳米粒子混入包覆在球囊表面,形成类似于传统药物球囊的微粒涂层。简化了球囊亲水预处理、亲水涂层、药物风干、喷涂的过程,又使药物承载量增大,均匀,同时在血管内输送损耗小。在动脉硬化血管部位扩张球囊,将负载有雷帕霉素的中空介孔二氧化硅纳米粒子释放在血管内皮上,通过纳米粒子的渗透性、缓释性,提高雷帕霉素的抗动脉硬化、抗动脉再狭窄作用。

雷帕霉素治疗PIK3CD基因突变致PI3Kδ过度活化综合征4例病例系列报告

背景PI3Kδ过度活化综合征(APDS)采用传统治疗方案预防感染的疗效欠佳,近年来雷帕霉素被用于PIK3CD基因突变所致的APDS1患儿的临床治疗。目的探讨雷帕霉素治疗APDS1的疗效和安全性。设计病例系列报告。方法纳入2017年6月至2023年6月在浙江大学医学院附属儿童医院经基因检测确诊为APDS1且口服雷帕霉素治疗的连续病例。国内儿童雷帕霉素治疗APDS引起的非肿瘤性淋巴细胞增生,仍属于超说明书用药,用药前家长均充分了解用药风险并签署了知情同意书。雷帕霉素口服剂量为1 mg·m^(-2)·d^(-1)。主要结局指标①12个月内发生肺炎的次数;②B超评估肝、脾、淋巴结肿大情况。结果4例使用雷帕霉素治疗的APDS1患儿中,男3例、女1例,发病年龄为(35.5±17.9)月龄,确诊年龄(56.5±35.0)月龄;全外显子组测序均显示PIK3CD基因c.3061G>A(p.E1021K)新发杂合突变;均因“反复咳嗽”就诊,均有肝、脾、淋巴结肿大;均有肺炎,反复腮腺炎2例,伴特异性皮炎、炎症性肠病和韦格纳肉芽肿病各1例,生长迟缓2例;4例均行支气管镜检查,3例有支气管内膜鹅卵石样凸起;均有CD19+B细胞比例下降、CD4^(+)/CD8^(+)倒置,3例IgM升高,1例IgG下降。在雷帕霉素治疗前均予IVIG、抗感染、糖皮质激素等治疗,治疗后仍有反复呼吸道感染、肝脾肿大,且3例出现PLT减少,2例出现贫血。4例患儿确诊后1~44个月起口服雷帕霉素,疗程12~58个月。雷帕霉素治疗后12个月肺炎年均次数由5.3次降至1.0次,肝、脾和浅表淋巴结肿大均明显改善,Hb和PLT均恢复至正常水平,但免疫学指标在治疗前后比较差异均无统计学意义。随访期间未发现雷帕霉素相关不良反应,无发生肿瘤及死亡病例。结论雷帕霉素对APSD1有一定疗效且相对安全。

搭载雷帕霉素纳米晶的透明质酸微针贴片的制备及性质初步探究

目的可降解载药微针可以持续、安全、无痛地实现局部药物缓释,而微针载药系统用于心血管领域可最大程度发挥药物的局部抗凝,抑制内膜增生,减小药物全身给药带来的毒副作用。为此本文制备了一款搭载雷帕霉素纳米晶的透明质酸(hyaluronic acid,HA)微针贴片,并对该贴片进行初步理化性质评价、体外模拟释药性能评估以及刺入大隐静脉性能的分析评价。方法首先以150万分子量的透明质酸为基材掺杂的雷帕霉素水相纳米晶混悬液(rapamycin nanoparticles,RAP-NPs)形成药物均匀分散的水凝胶;然后通过聚二甲基硅氧烷微针模板(polydimethylsiloxane,PDMS)制备可溶于水的雷帕霉素水相纳米晶混悬液的透明质酸微针贴片(hyaluronic acid-rapamycin-microneedle,HA-RAP-MN);最后对这种载药微针进行初步理化性质评价和体外模拟释药性能分析评价。结果RAP-NPs水相混悬液可与HA水凝胶形成混匀的混合物,使药物能够均匀分散在微针中并持续释放药物,解决了难溶性药物分子无法在HA水凝胶中均匀分散的技术瓶颈。药物模拟释放实验表明雷帕霉素可在8h内释放70%以上,达到缓释效果。免疫荧光结果表明雷帕霉素均匀分布于静脉中膜及内膜。结论可溶于水的雷帕霉素水相纳米晶混悬液的透明质酸微针贴片在局部降低冠状动脉旁路移植术后内膜增生方面具有可预期的应用潜力。

雷帕霉素对γδT细胞体外增殖和细胞毒活性的影响

目的探讨雷帕霉素与Torin2对人γδT细胞体外培养增殖和细胞毒活性的影响及相关机制。方法选择10例健康志愿者,其中男性5例,女性5例;平均年龄68.0岁(标准差4.7岁)。选择人慢性淋巴细胞白血病(CLL)肿瘤细胞株MEC-1。从志愿者外周静脉血获得外周血单个核细胞(PBMC),经处理获得γδT细胞。体外增殖培养的人γδT细胞在第10天观察细胞形态特征,流式细胞术检测人γδT细胞百分率。γδT细胞分别用100 nmol/L雷帕霉素(雷帕霉素组)和Troin2处理(Troin2组),同时用RPMI 1640培养液作为空白对照(对照组),分别培养24、48 h,计算活细胞数。采用不同效靶比(1∶1、3∶1、9∶1、18∶1、36∶1),乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测人γδT细胞对MEC-1细胞的杀伤作用。流式细胞术检测各组白细胞介素(IL)-17的表达。Western blot检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、丝苏氨酸激酶(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、起始因子4E结合蛋白1(4EBP-1)的表达。结果扩增前人γδT细胞百分含量为4.70%±1.17%,经10 d扩增且纯化后γδT细胞百分含量为94.20%±2.18%。雷帕霉素组24 h扩增倍数为1.45±0.20,48 h扩增倍数为2.71±0.06,与对照组间差异无统计学意义(P>0.05);Torin2组24 h扩增倍数为1.14±0.05,48 h扩增倍数为2.09±0.06,均显著低于雷帕霉素组及对照组(P<0.05)。雷帕霉素组γδT细胞的杀伤活性分别为0.05%±0.01%(1∶1)、10.84%±0.88%(3∶1)、23.02%±0.65%(9∶1)、50.74%±2.96%(18∶1)、77.75%±0.55%(36∶1),均显著高于对照组(P<0.05);Torin2组γδT细胞的杀伤活性分别为0.06%±0.01%(1∶1)、4.06%±0.84%(3∶1)、10.72%±2.97%(9∶1)、18.20%±2.83%(18∶1)、36.18%±2.19%(36∶1),均低于雷帕霉素组及对照组(P<0.05)。雷帕霉素组IL-17表达为(32.7±1.7)%,Troin2组IL-17表达为(12.2±1.4)%,均显著低于对照组(73.1±2.7)%(均P<0.05)。且Troin2组抑制γδT分泌IL-17程度更明显,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,与对照组相比,雷帕霉素组、Troin2组mTOR表达水平均下降,差异有统计学意义(t_(雷帕霉素组)=14.23,P<0.05;t_(Troin2组)=11.67,P<0.05);雷帕霉素组、Troin2组p-mTOR表达水平均下降,差异有统计学意义(t_(雷帕霉素组)=16.78,P<0.05;t_(Troin2组)=25.31,P<0.05);雷帕霉素组PI3K表达提高,差异有统计学意义(t=18.77,P<0.05);AKT表达提高,差异有统计学意义(t=22.21,P<0.05);pAKT表达提高,差异有统计学意义(t=19.33,P<0.05);4EBP-1表达提高,差异有统计学意义(t=14.37,P<0.05)。结论雷帕霉素能在不影响体外人γδT细胞增殖的基础上,增强人γδT细胞对MEC-1细胞的肿瘤杀伤活性并抑制其IL-17的水平,其机制可能与mTOR C1/C2位点之间的负反馈机制相关。

鞭毛素蛋白联合雷帕霉素对4T1乳腺癌细胞及荷瘤小鼠的抑制作用

目的 在乳腺癌4T1细胞构建的荷瘤小鼠模型中,探讨鞭毛素蛋白(flagellin,FliC)与雷帕霉素(rapamycin,RAPA)联用对肿瘤生长和转移的影响,并探讨其对部分免疫细胞的调节作用。方法 用小鼠乳腺癌4T1细胞建立Balb/c肿瘤模型,分别注射鞭毛素蛋白和(或)雷帕霉素,并定期记录肿瘤大小,计算肿瘤抑制率。用MTT法检测二者联用对乳腺癌4T1细胞的抑制作用。用流式细胞术检测荷瘤小鼠肿瘤组织中CD11b+Gr-1+骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)和CD11b+F4/80+肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的百分比。用HE染色检测肝、肺组织中转移情况。结果 体内实验中,RAPA和FliC对肿瘤生长均有抑制作用,但RAPA+FliC组抑制效果最好(F=5.593,P<0.05)。在体外实验中,给药组对4T1细胞增殖的抑制率均高于Control组,但RAPA+FliC组的抑制率最高。肿瘤组织中,与FliC组和Control组相比,RAPA+FliC组和RAPA组组织细胞中CD11b+Gr-1+MDSC和CD11b+F4/80+TAM百分比基本相同且均为最低(P<0.05)。与Control组相比,RAPA组和RAPA+FliC组肝、肺组织肿瘤转移情况较轻。结论 鞭毛素蛋白与雷帕霉素联合作用可抑制4T1细胞的增殖活性,并增强乳腺癌荷瘤小鼠抗肿瘤效应,抑制肿瘤生长和转移。其机制可能与肿瘤微环境中免疫细胞浸润有关,但具体相关性还有待进一步证实。

雷帕霉素对光诱导下视网膜色素上皮细胞自噬的影响

目的:探讨雷帕霉素对光诱导下视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)自噬的影响。方法:将自噬双标mRFP-eGFP-LC3质粒转染进ARPE-19细胞中获得稳定表达的转染细胞株,随后随机分为6 h对照组、6h模型组、6 h雷帕霉素组;12 h对照组、12 h模型组、12 h雷帕霉素组和24 h对照组、24 h模型组、24 h雷帕霉素组。对照组避光培养,模型组受光照刺激;雷帕霉素组加入10μmol/L雷帕霉素后受光照刺激,光源采用LED冷光灯,在(16500±500)lx光照强度下照射细胞6、12、24 h。检测转染效率,MTT检测ARPE-19细胞存活率;激光共聚焦显微镜对自噬流变化进行定性分析,透射电镜观察细胞自噬形态;蛋白免疫印迹法对Beclin1、LC3、P62自噬相关蛋白表达量进行检测。结果:与对照组相比,模型组光照6、12、24 h后,细胞存活率显著下降(P<0.001);雷帕霉素组经光照后细胞存活率高于模型组(P<0.05)。光照6、12、24 h后模型组红色荧光斑点较对照组逐渐增多,绿色荧光斑点也随之增加,Merge图中从光照12 h开始黄色斑点数量增多明显。雷帕霉素组在光照6、12、24 h时红色荧光斑点较模型组加强,绿色荧光较模型组弱。透射电镜观察发现模型组胞内见较多的自噬泡,雷帕霉素组细胞见大量聚集分布自噬囊泡。蛋白免疫印迹结果发现光照6、12、24 h后,模型组中自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的相对表达水平均增加,P62蛋白表达较低。而采用雷帕霉素干预后,与模型组相比,雷帕霉素组在光照6 h时Beclin 1蛋白表达量差异不明显、在12、24h时Beclin 1蛋白表达量逐渐升高;LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值均高于模型组;P62蛋白表达量差异不显著。结论:光照可诱导ARPE-19细胞自噬现象的发生,且雷帕霉素能上调其自噬活性。

雷帕霉素对高糖诱导的人肾小球足细胞增殖、凋亡和IL-6表达的影响及其机制

目的观察雷帕霉素对高糖诱导的人肾小球足细胞增殖、凋亡和IL-6表达的影响,并基于磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(AKT)信号通路探讨相关机制。方法体外培养人肾小球足细胞系HGPC,分为对照组、高糖组、实验组,对照组不做干预,高糖组、实验组加入30 mmol/L D-葡萄糖,实验组在此基础上分别加入2.5、5、10μmol/L雷帕霉素,检测各组细胞活力,筛选雷帕霉素最适浓度。将HGPC细胞分为对照组、高糖组、实验组、抑制剂组、雷帕霉素+抑制剂组、雷帕霉素+激动剂组;对照组不加药物,高糖组加入30 mmol/L D-葡萄糖,抑制剂组加入30 mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002,实验组、雷帕霉素+抑制剂组、雷帕霉素+激动剂组加入30 mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L雷帕霉素,雷帕霉素+抑制剂组再加入10μmol/L LY294002,雷帕霉素+激动剂组再加入10μmol/L PI3K/AKT信号通路激动剂SC79;各组给药后培养24 h。采用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷法检测细胞增殖能力,Hoechst 33258染色检测凋亡细胞;采用ELISA法检测细胞培养液上清中的白细胞介素6(IL-6);Western blotting法检测细胞中的细胞周期素D1(Cyclin D1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)及PI3K/AKT通路相关蛋白。结果高糖组细胞增殖率、Cyclin D1表达低于对照组,实验组和抑制剂组细胞增殖率、Cyclin D1表达高于高糖组;与实验组相比,雷帕霉素+抑制剂组细胞增殖率、Cyclin D1表达增高,雷帕霉素+激动剂组细胞增殖率、Cyclin D1表达降低(P均<0.05)。高糖组细胞凋亡率、Caspase-3表达及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、IL-6水平高于对照组,实验组和抑制剂组细胞凋亡率、Caspase-3表达及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、IL-6水平低于高糖组;与实验组相比,雷帕霉素+抑制剂组细胞凋亡率、Caspase-3表达及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、IL-6水平下降,雷帕霉素+激动剂组凋亡率、Caspase-3表达及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、IL-6水平上升(P均<0.05)。结论雷帕霉素可促进高糖诱导的人肾小球足细胞增殖,减少细胞凋亡,减轻炎症损伤,其机制可能与抑制PI3K/AKT通路有关。

雷帕霉素对人腮腺间充质干细胞放疗防护作用的研究

目的研究雷帕霉素对人腮腺间充质干细胞(parotid mesenchymal stem cells,PMSCs)在放疗后的防护作用。方法雷帕霉素处理人PMSCs后接受放疗,观察其增殖、凋亡、成骨分化能力及细胞外基质中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的变化。结果放疗会造成人PMSCs的增殖率下降、凋亡率升高、成骨分化能力下降。PMSCs加入雷帕霉素后接受放疗,增殖率下降、凋亡率升高、成骨分化能力下降等现象均得到改善。放疗可以使细胞外基质中Ⅰ型胶原增高,Ⅲ型胶原没有变化。提前加入雷帕霉素无法影响细胞外基质中的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原。结论放疗导致人PMSCs的干性降低、细胞外基质中I型胶原堆积。放疗前使用雷帕霉素可以改善PMSCs在放疗后干性降低的现象。

雷帕霉素上调NIX表达保护劳力性热射病大鼠肺功能

目的探讨雷帕霉素(Rapa)对劳力性热射病(EHS)大鼠肺功能的保护作用及其机制。方法将60只健康雄性SD大鼠随机分为对照组(Ctrl)、雷帕霉素组(Rapa)、EHS组和EHS+雷帕霉素干预组(EHS+Rapa),每组15只。建立EHS模型后,测量大鼠直肠温度变化。取动脉血进行血气分析,伊文氏蓝(EB)染色测定肺血管通透性,HE染色观察大鼠肺组织病理学改变,原位末端转移酶标记法(Tunel)观察大鼠肺组织凋亡,透射电镜下观察大鼠肺Ⅱ型上皮细胞中线粒体的形态,Western blot方法测定大鼠肺组织中NIX和微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达,并计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,免疫荧光双标观察肺组织中LC3与Tom20的共定位情况。结果EHS和EHS+RAPA组大鼠核心温度均显著升高至42℃以上,雷帕霉素改善EHS大鼠肺血管通透性和氧合,减轻肺组织病理损伤和细胞凋亡。透射电镜下,雷帕霉素保护了EHS大鼠肺Ⅱ型上皮细胞中的线粒体形态。Western blot和免疫荧光结果显示,雷帕霉素干预上调EHS大鼠肺组织中NIX水平,增加LC3Ⅱ/LC3I比值,增强LC3和Tom20在肺组织中的相互结合。结论雷帕霉素通过上调NIX激活线粒体自噬,从而减轻EHS导致的肺损伤,保护肺功能。

雷帕霉素洗脱椎动脉支架治疗重度椎动脉起始部狭窄的临床效果观察

目的探讨雷帕霉素药物洗脱椎动脉支架治疗重度椎动脉起始部狭窄(OVAS)的临床效果及术后支架内再狭窄率。方法回顾性选取2020年11月至2022年5月于我院就诊行支架成形手术治疗的重度OVAS患者共96例,包括观察组(48例)和对照组(48例),观察组给予植入雷帕霉素洗脱椎动脉支架,对照组给予植入外周球囊扩张金属裸支架,观察对比围手术期基本情况、随访期间并发症发生情况和术后支架内再狭窄率。结果两组患者均成功植入支架,围手术期均未发生短暂性脑缺血发作(TIA)、支架脱落或断裂、椎动脉或支架相关脑卒中等并发症。两组患者手术植入的支架长度及支架管径均无明显差异(P>0.05),两组患者术前血管狭窄率及术后血管残余狭窄率差异均不显著(P>0.05),术后两组患者的残余狭窄率均小于20%。术后随访患者(12.33±5.82)个月,观察组和对照组患者椎动脉或支架相关的脑卒中发生率分别为0%和4.17%,无明显差异(P>0.05)。观察组47例和对照组45例患者头晕、眩晕等症状均较前改善,均未再发后循环TIA,均未发现支架相关血栓事件。观察组患者的支架植入术后再狭窄发生率(10.42%)明显低于对照组(29.17%,P<0.05)。结论雷帕霉素洗脱椎动脉支架能安全有效地治疗重度OVAS,且能减少术后支架内再狭窄率。

基于mRNA高通量测序初探雷帕霉素联合鞭毛蛋白体外抑制4T1乳腺癌细胞的机制

目的:利用mRNA高通量测序初步探讨雷帕霉素(Rapa)联合鞭毛蛋白(FliC)体外抑制4T1乳腺癌细胞的机制。方法:将4T1乳腺癌细胞分为对照(control)组、Rapa组、FliC组、Rapa+FliC组等4组,CCK-8法与流式细胞术检测细胞活力、凋亡的变化情况。同时,通过mRNA高通量测序,对差异表达基因(DEGs)进行KEGG通路分析;此外,通过STRING分析Rapa+FliC组与Rapa组两组间的DEGs,构建DEGs的蛋白相互作用(PPI)网络、筛选Hub基因。结果:CCK-8和流式细胞术检测结果显示,Rapa+FliC对4T1乳腺癌细胞的活力抑制率和凋亡率都显著高于Rapa和FliC(P<0.05)。转录组测序结果显示,Rapa组和control组之间共有579个DEGs,主要富集于PI3K/Akt等信号通路;FliC组和control组之间的DEGs主要富集于Nod样受体等信号通路;Rapa+FliC组与Rapa组之间共有150个DEGs,主要富集于mTOR等信号通路。从PPI网络中,成功筛选出Atm、Itga2等10个Hub基因。结论:Rapa+FliC可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路,在体外抑制4T1乳腺癌细胞活力,促进细胞凋亡;Atm和Itga2基因可能是两者联合作用的关键基因。

疑似雷帕霉素药物洗脱支架术后Kounis综合征1例

库尼斯综合征(kunis syndrome,KS)主要表现为胸痛、心电图明显缺血变化的冠脉内局部炎症反应伴有嗜酸性粒细胞显著升高。Kounis综合征可导致患者反复发作心绞痛,诱发支架内血栓形成,导致心力衰竭、猝死,尽早识别有助于改善预后。

雷帕霉素对慢性肾衰竭大鼠主动脉平滑肌细胞钙化及自噬的影响

目的探讨雷帕霉素抑制剂对慢性肾衰竭平滑肌细胞(VSMC)钙化的影响机制。方法取33只雄性昆明大鼠自由饮用2%葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液共7 d,普通饮水14 d。随机选取3只大鼠取肾脏组织进行病理学检查,其余30只随机分为模型组、CRF+I组和CRF+I+3-甲基腺嘌呤(MA)组,每组10只。观察各组相关生化指标变化;苏木素-伊红(HE)染色检测大鼠肾脏组织形态;茜素红染色及细胞钙沉积量检测钙化结节情况;免疫印迹检测大鼠主动脉上α-平滑肌肌动蛋白(SMA)和runt相关转录因子(Runx)2蛋白表达(血管平滑肌标志物和成骨指标)、自噬相关蛋白(Beclin)1和微管相关蛋白轻链(LC)3Ⅱ/LC3Ⅰ及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路蛋白;免疫组化检测大鼠主动脉上α-SMA和Runx2蛋白表达(血管平滑肌标志物和成骨指标);透射电镜观察VSMC内自噬体水平。结果与模型组比较,CRF+I组p-mTOR蛋白表达明显降低,自噬体增加,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclinl、α-SMA蛋白表达明显升高,成骨指标Runx2蛋白表达明显降低(均P<0.05);利用3-Ma抑制自噬后,自噬体减少,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclinl、α-SMA蛋白表达明显降低,成骨指标Runx2蛋白水平明显升高(均P<0.05)。结论雷帕霉素抑制剂对大鼠CRF具有一定疗效,其机制可能与雷帕霉素抑制剂对激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/mTOR通路的调控,从而促进自噬,减弱VSMC钙化有关。