青藤碱可有效抑制白细胞介素1β介导的髓核细胞凋亡

背景:椎间盘退变是导致脊柱退行性疾病的基础,然而目前尚无有效的治疗药物。目的:探讨青藤碱是否可以抑制白细胞介素1β诱导的髓核细胞凋亡及其分子机制。方法:采用胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法体外培养大鼠髓核细胞,并绘制细胞生长曲线,采用CCK-8法筛选合适的青藤碱药物浓度。将髓核细胞分为对照组、青藤碱组、白细胞介素1β组、青藤碱+白细胞介素1β组、锌原卟啉(血红素氧合酶1抑制剂)组、锌原卟啉+青藤碱组、锌原卟啉+白细胞介素1β组、青藤碱+锌原卟啉+白细胞介素1β组。分别检测各组髓核细胞增殖活性、活性氧含量、凋亡率及血红素氧合酶1的表达情况。结果与结论:①体外培养的大鼠髓核细胞呈现多角形、三角形、短楔形等形态,其呈现“S”型曲线生长,接种第1-3天生长缓慢,第4-6天生长迅速,第七八天生长速度缓慢,进入“平台期”,细胞数量不再增加;②当青藤碱的浓度≤80μmol/L时,髓核细胞的增殖活性不会受到显著影响(P>0.05);③白细胞介素1β可以显著降低髓核细胞的增殖活性,增加活性氧含量,导致细胞凋亡(P<0.01);④当采用青藤碱干预后,不仅可以促进血红素氧合酶1的表达(P<0.05),而且可以抑制白细胞介素1β诱导的髓核细胞增殖活性降低、活性氧含量和凋亡率增加(P<0.05),其作用可被锌原卟啉逆转(P<0.01)。

黄芪甲苷经由miR-125a-5p/NLRP1轴减轻椎间盘突出髓核细胞损伤

目的在白介素-1β(IL-1β)诱导退变的人髓核细胞中,探究黄芪甲苷对miR-125a-5p及其靶基因介导的信号通路的作用,揭示黄芪甲苷(astragaloside IV,AS-IV)对髓核细胞增殖、凋亡以及炎症反应的影响。方法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-125a-5p和核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体蛋白1(nucleotide oligomerization domain(NOD)-like receptor protein 1,NLRP1)在椎间盘突出患者髓核组织中的表达,用IL-1β诱导髓核细胞退变,在20、50和80μg·mL^(-1)黄芪甲苷干预浓度下检测miR-125a-5p和NLRP1的表达,在IL-1β和80μg·mL^(-1)黄芪甲苷处理的髓核细胞中单独或共同转染miR-125a-5p模拟物和NLRP1过表达质粒,然后分别检测细胞增殖、凋亡和炎症因子分泌情况,蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞中信号通路相关蛋白p56和p38的磷酸化水平。结果椎间盘突出(lumbar disc herniation,LDH)患者的髓核组织中miR-125a-5p表达下调,NLRP1表达上调。黄芪甲苷促进IL-1β处理的髓核细胞中miR-125a-5p表达,减少NLRP1表达以及p56和p38蛋白的磷酸化水平。黄芪甲苷促进髓核细胞增殖,减少凋亡和炎症反应。结论黄芪甲苷通过上调miR-125a-5p表达,抑制NLRP1的表达和NF-κB/MAPK信号通路,减少IL-1β诱导的髓核细胞损伤。

YAP通过促进自噬抑制髓核细胞胞外基质分解代谢

目的探讨YAP对椎间盘髓核细胞的作用及其可能机制。方法收集重庆医科大学附属第一医院2021年3月至2022年7月接受腰椎手术患者的相对正常和退变的椎间盘组织,采用免疫组化和Western blot检测YAP在人椎间盘髓核组织中的表达差异。体外培养人原代髓核细胞,通过IL-1β处理诱导髓核细胞退变,将实验分为对照组、IL-1β组、IL-1β+LV-YAP组、IL-1β+YAP-siRNA组和IL-1β+LV-YAP+3-MA组。采用Western blot检测细胞外基质分解代谢及自噬水平变化。最后建立大鼠椎间盘退变模型,利用MRI、阿利新蓝染色及免疫组化检测YAP和LC3的表达及椎间盘退变情况。结果YAP在退变椎间盘组织的表达水平明显低于相对正常的椎间盘组织(P<0.05)。体外细胞实验结果显示,IL-1β+LV-YAP组显著提高IL-1β诱导的髓核细胞中CollagenⅡ、Aggrecan和LC3-Ⅱ的蛋白表达(P<0.05),降低MMP-3和MMP-13的蛋白表达(P<0.05),而IL-1β+YAP-siRNA组则表现出完全相反的作用。而予以自噬抑制剂3-MA预处理后明显降低IL-1β+LV-YAP组中GFP-LC3阳性颗粒数量和CollagenⅡ、Aggrecan、LC3-Ⅱ蛋白表达(P<0.05),且提高MMP-3和MMP-13的蛋白表达(P<0.05)。进一步在体内构建大鼠椎间盘退变模型,YAP过表达促进LC3表达和抑制椎间盘退变。结论YAP过表达通过促进人髓核细胞自噬抑制细胞外基质降解,从而延缓椎间盘退变。

活性维生素D改善高糖诱导髓核细胞损伤及机制研究

目的探讨活性维生素D对高糖诱导髓核细胞炎症、氧化应激、自噬和凋亡的影响。方法分别于正常糖(正常糖组)和高糖(高糖组)环境下培养体外人椎间盘髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs),首次培养及加入活性维生素D后,分别检测髓核细胞炎症、氧化应激、自噬和凋亡情况。其中,采用ELISA试剂盒检测IL-1β、TNF-α及H_(2)O_(2),蛋白免疫印迹Western blotting(WB)检测SOD、Caspase3和Atg5、Atg12、LC3等指标。结果与正常糖组相较,高糖组髓核细胞炎症反应及氧化应激增强、细胞自噬降低、凋亡增多,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与加入活性维生素D前相较,正常糖组髓核细胞生物特征变化无明显统计学意义(P>0.05),高糖组髓核细胞氧化应激及炎症反应减弱,自噬增强,细胞凋亡减弱,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与高糖+维生素D组相比,加入p38MAPK抑制剂和NF-κB抑制剂可以显著抑制维生素D导致的生化指标变化,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论活性维生素D通过激活p38MAPK和NF-κB信号通路增强高糖环境下髓核细胞自噬并抑制炎症和凋亡来保护髓核细胞,延缓椎间盘退变。

不同氧浓度下髓核细胞中PI3K/Akt/HIF-1α信号通路表达对延缓椎间盘退变的意义

背景:椎间盘退变是一种由于细胞凋亡、氧化应激、炎症反应等多种因素共同作用导致的疾病,目前认为其核心在于髓核细胞退变与凋亡,然而具体病理机制尚不明确。目的:通过探究不同氧浓度下髓核细胞中磷脂酰激醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α)信号通路的表达及髓核细胞凋亡情况,明确不同氧浓度下髓核细胞的生物学特性,探讨椎间盘退变的机制。方法:取人正常及退变髓核细胞,取第2代细胞用于影像学鉴定,取第3代细胞分别采用37℃、空气、100%湿度环境,100μmol/L CoCl_(2)浓度的Leibovitz’s培养基、100μmol/L H_(2)O_(2)浓度的10%胎牛血清培养基构建常氧、低氧及氧化应激环境,将细胞分为正常髓核细胞+低氧环境、正常髓核细胞+常氧环境、正常髓核细胞+氧化应激环境、退变髓核细胞+低氧环境、退变髓核细胞+常氧环境、退变髓核细胞+氧化应激环境6组;采用CCK-8法检测细胞活力及增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR、Western-blot检测PI3K、AKT、HIF-1α的蛋白及mRNA表达情况。结果与结论:①在不同的氧浓度下,正常及退变髓核细胞的增殖率随氧浓度升高而下降,凋亡率随氧浓度升高而上升(P<0.05),以正常髓核细胞+低氧环境为对照组,细胞正常与否对凋亡率影响极为显著(P<0.001),氧浓度对髓核细胞增殖率与凋亡率影响极为显著(P<0.001),细胞是否退变与氧浓度二者交互作用对髓核细胞增殖率与凋亡率影响显著(P<0.05)。②在不同的氧浓度下,正常髓核细胞中低氧环境下PI3K、AKT、HIF-1α的蛋白及mRNA表达最高,氧化应激环境下其次,常氧环境下最低;退变髓核细胞中3项指标的蛋白和mRNA表达随氧浓度升高而下降;正常髓核细胞中PI3K、Akt的蛋白、mRNA表达均显著高于退变髓核细胞(P<0.05)。以正常髓核细胞+低氧环境为对照组,髓核细胞正常或退变及氧浓度对上述3项指标的蛋白和mRNA表达影响均极为显著,二者交互作用对3项指标的蛋白和mRNA表达影响极为显著(P<0.001)。③结果表明,髓核细胞的增殖、凋亡与氧浓度和细胞自身功能状态密切相关,PI3K/Akt/HIF-1α信号通路在不同细胞功能状态及不同氧浓度环境下具有拮抗调节作用,其机制可能与PI3K/Akt信号通路被激活,并翻译转录HIF-1α,从而维持活性氧自由基代谢平衡有关。该通路对于抑制氧化应激,拮抗髓核细胞凋亡,进而延缓椎间盘退变具有重要意义。

中药单体促髓核细胞自噬缓解椎间盘退变的研究进展

椎间盘退变是临床常见疾病,髓核与髓核细胞是椎间盘中主要的病变组织与细胞类型。髓核细胞受病理因素影响而加速衰老或出现代谢障碍时,髓核稳态被破坏,这导致了椎间盘退变的发生发展。自噬是细胞在病理环境下降解受损细胞器与异常蛋白质以维持正常生理功能的途径之一,能促进细胞自我调节以抵御致病因素影响。椎间盘退变时,髓核细胞处于应力失衡与代谢障碍的异常环境中,促进髓核细胞自噬可清除有害代谢产物累积、延缓细胞老化,这有助于维持髓核与椎间盘的健康生理状态。随着中医药治疗椎间盘退变疾病相关研究的不断深入,大量提取自传统中草药的单体成分被发现可以促进髓核细胞自噬以缓解椎间盘退变。根据最新的研究进展,讨论了髓核细胞的自噬与椎间盘退变的关联,共获取了14种在促进髓核细胞自噬以缓解椎间盘退变领域展现出潜力的中药单体,并将其作用机制归纳为以下4种:促自噬抑制髓核细胞凋亡、促自噬拮抗髓核细胞氧化应激、促自噬抑制髓核细胞外基质降解和促自噬促进髓核细胞外基质大分子合成,以期为中药单体调节髓核细胞自噬从而缓解椎间盘退变的研究提供新的思路与参考。

苦参碱对椎间盘退变大鼠髓核细胞凋亡的影响

背景:髓核细胞凋亡是引发椎间盘退变的主要病理基础,炎症和过氧化反应是导致髓核细胞凋亡的重要因素。研究表明苦参碱具有抗氧化、衰老、炎症和细胞凋亡等作用,可作为治疗椎间盘退变的潜在药物。目的:观察苦参碱调节环状GMP-AMP合成酶-干扰素基因刺激因子(cGAS-STING)信号通路对椎间盘退变大鼠髓核细胞凋亡的影响。方法:①将处于对数生长期的大鼠髓核细胞分6组处理:除对照组外,模型组、苦参碱低剂量组、苦参碱高剂量组、空载组、苦参碱高剂量+cGAS过表达组采用氧糖剥夺建立椎间盘退变细胞模型,造模同时苦参碱低剂量组、苦参碱高剂量组分别给予0.4,0.8 mmol/L苦参碱处理,空载组转染空载质粒,苦参碱高剂量+cGAS过表达组给予0.8 mmol/L苦参碱处理并转染cGAS过表达质粒。处理24 h后,检测细胞活性与凋亡,细胞内活性氧、超氧化物歧化酶、肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平,以及细胞内凋亡蛋白、cGAS-STING通路蛋白表达。②将60只SD大鼠随机分为6组,每组10只:除对照组外,模型组、苦参碱低剂量组、苦参碱高剂量组、空载组、苦参碱高剂量+cGAS过表达组建立椎间盘退变模型;造模12周后,苦参碱低剂量组、苦参碱高剂量组分别灌胃给予60,120 mg/kg苦参碱(1次/d),空载组尾静脉注射空载质粒(2次/周),苦参碱高剂量+cGAS过表达组灌胃给予120 mg/kg苦参碱+尾静脉注射cGAS过表达质粒,连续治疗3周。给药结束后取材,检测细胞凋亡,活性氧、超氧化物歧化酶、肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平,以及凋亡蛋白、cGAS-STING通路蛋白表达。结果与结论:①与对照组比较,模型组细胞活性、超氧化物歧化酶水平降低(P<0.05),细胞凋亡率、活性氧含量、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平及cGAS、STING、cleaved caspase-3和Bax蛋白表达升高(P<0.05);苦参碱可呈剂量依赖性地改善上述因细胞造模造成的各指标变化(P<0.05),而cGAS过表达可部分拮抗高剂量苦参碱的改善作用。②在动物实验中获得了与体外细胞实验类似的结果。③结果表明,苦参碱可通过阻断cGAS-STING信号传导抑制炎症和氧化应激反应,进而减轻椎间盘退变大鼠髓核细胞凋亡、提升其活性。

miR-365通过靶向调控SIRT1对髓核细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨miR-365对髓核细胞增殖、凋亡的影响及其与细胞沉默信息调节因子1(SIRT1)的靶向关系。方法选取人髓核细胞,正常培养的纳入对照组,用脂多糖(LPS)刺激细胞模拟椎间盘变性的纳入LPS组。将质粒转染细胞,然后用LPS处理,记为miR-365组、si-miR-365组、miR-NC组、NC组、SIRT1组、Vector组、si-SIRT1组、Scramble组、si-miR-365+si-SIRT1组、si-miR-365+Scramble组、miR-365+WT-SIRT1组、miR-NC+WT-SIRT1组、miR-365+MUT-SIRT1组及miR-NC+MUT-SIRT1组。检测LPS、miR-365、SIRT1对髓核细胞增殖、凋亡的影响,TargetScan在线网站预测miR-365与SIRT1结合位点,双荧光素酶报告实验验证miR-365与SIRT1的靶向关系。结果细胞上清液白细胞介素(IL)-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量及细胞miR-365水平LPS组均高于对照组(P<0.01),SIRT1蛋白、基因mRNA水平低于对照组(P<0.01)。LPS处理的髓核细胞增殖能力降低、凋亡增加。上调miR-365能够抑制LPS处理的髓核细胞的增殖活性、促进凋亡、降低SIRT1表达,下调miR-365可得到相反的结果。上调SIRT1能够促进LPS处理的髓核细胞的增殖活性、抑制凋亡,下调SIRT1可得到相反的结果。敲低SIRT1可逆转miR-365对髓核细胞增殖、凋亡的影响。miR-365负性调控SIRT1表达。结论miR-365通过靶向调控SIRT1而影响髓核细胞增殖、凋亡,为椎间盘退变的防治提供了新靶点。

圣愈汤对IL-1β诱导的髓核细胞凋亡和炎症反应的影响及其机制研究

目的探讨圣愈汤对白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)处理髓核细胞凋亡及炎症反应的影响及其潜在作用机制。方法将25只雄性SD大鼠分别给予生理盐水,低、中、高剂量圣愈汤(9 g/kg、18 g/kg和36 g/kg)以及阳性药物(尼美舒利分散片,0.18 mg/kg)灌胃,连续给药14 d,收集血清。(1)分离培养原代髓核细胞,10 ng/ml的IL-1β处理构建髓核细胞退变模型。圣愈汤含药血清和阳性药物含药血清处理髓核细胞24 h,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力,末端标记法(Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)和比色法分别检测细胞凋亡和胱天蛋白酶3(caspase-3)活性,酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测IL-6和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)水平。免疫印迹法检测Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、核转录因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)。(2)将细胞分为对照组、模型组(经10 ng/ml的IL-1β处理)、圣愈汤含药血清高剂量组(经10 ng/ml的IL-1β和高剂量圣愈汤含药血清处理)、Kdo2脂质(KLA)组(经TLR4激动剂KLA、IL-1β和高剂量圣愈汤含药血清处理)。免疫印迹检测TLR4、NF-κB和cleaved caspase-3蛋白表达,免疫荧光检测TNF-α和IL-6表达。结果与对照组比较,模型组髓核细胞活力降低,髓核细胞凋亡率、Caspase-3活性以及TNF-α和IL-6水平升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。模型组髓核细胞中TLR4和NF-κB蛋白水平均较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,各剂量圣愈汤含药血清组和阳性药物组髓核细胞活力升高,细胞凋亡率和Caspase-3活性降低,TNF-α和IL-6水平减少,TLR4与NF-κB蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。KLA有效减弱圣愈汤含药血清对IL-1β处理髓核细胞TLR4、NF-κB、cleaved caspase-3、TNF-α和IL-1β蛋白表达的抑制作用,差异有统计学意义(P<0.01)。结论圣愈汤能够抑制退变髓核细胞凋亡和炎症反应,其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路活化有关。

机械刺激对髓核细胞的作用与椎间盘退变关系的研究进展

椎间盘退变是受多种因素影响的复杂退行性疾病,其机制仍需深入探索。机械刺激对椎间盘内的髓核细胞具有显著影响,对理解退变机制和寻找治疗策略具有重要意义。本文从动物模型、新材料、细胞骨架、细胞通路、线粒体损伤和衰老等方面进行总结,深入挖掘机械刺激对髓核细胞的作用和影响,为腰椎间盘退行性疾病提供更有效、更安全的治疗方案。

髓核细胞退变模型建立的研究进展

髓核细胞(NPCs)退变模型对研究椎间盘退变(IVDD)病理机制和治疗策略有着重要意义。对于退变严重的NPCs,往往较难贴壁生长,而轻度退变的细胞,虽可体外培养,但难有显著的实验结果,因此通过不同的诱导手段构建有效的退变细胞模型,不仅可以提升实验的可信度,更能增加实验数据的说服力。目前有较多诱导NPCs退变的方法,但模型建立缺乏统一标准,且无系统性的总结。因此,本文将从诱导NPCs退变的方式、方法、模型效果评价指标等方面展开综述,并从物理、化学和生物工程等方面对不同建模方式进行了分类总结,旨在为筛选、评价有效的退变细胞模型建立方法,探究IVDD治疗机制等研究提供参考。

异常流体剪切力通过cGAS-STING信号通路参与髓核细胞的凋亡、炎症与自噬

目的探讨异常流体剪切力诱导髓核细胞(NPC)凋亡、炎症和自噬的作用及其可能的机制。方法对NPC加载24 dyn/cm^(2)流体剪切力,时间分别为0、60、90、120、150 min。使用细胞骨架染色研究流体剪切力对细胞骨架及细胞形态的影响;使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷染色验证NPC的增殖能力;用线粒体膜电位变化评估流体剪切力对线粒体的损伤效应;用赫斯特染色研究凋亡与流体剪切力的关系;用丹酰戊二胺染色研究自噬与流体剪切力的关系;探究细胞培养基酸碱度的变化,验证流体剪切力与炎症的关联;使用蛋白质印迹法研究cGAS-STING相关蛋白(cGAS、STING、TBK1)、炎症相关蛋白(肿瘤坏死因子-α、COX-2)、凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)以及自噬蛋白(IL3-Ⅰ/Ⅱ、p62)的变化。结果作为一种细胞间的机械刺激,24 dyn/cm^(2)强度的流体剪切力可造成NPC形态由梭形转变为多边形,细胞骨架发生重组,细胞增殖能力下降,培养基酸性增强,线粒体JC-1多聚体减少、单体增加;同时,细胞内肿瘤坏死因子-α、COX-2、Bax蛋白表达量上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增加,p62、Bcl-2降解增加,出现凋亡、炎症、自噬以及线粒体损伤;加载24 dyn/cm^(2)的流体剪切力可以激活NPC内的cGAS-STING信号通路,且与时间呈正相关关系,120 min时强度最高。使用cGAS抑制剂RU.521可以减缓24 dyn/cm^(2)流体剪切力造成的NPC的凋亡、炎症、自噬以及线粒体损伤。结论流体剪切力诱导的NPC凋亡、炎症和自噬与cGAS-STING信号通路激活相关,抑制cGAS-STING信号通路的激活可以缓解异常流体剪切力造成的细胞损害。

XIST对椎间盘退变大鼠髓核细胞增殖及细胞外基质合成的影响及其机制

目的探讨X染色体失活特异转录本(XIST)对椎间盘退变(IDD)大鼠髓核细胞增殖及细胞外基质合成的影响及其机制。方法体外分离培养SD大鼠椎间盘髓核细胞,随机分为对照组、模型组、XIST敲低组、空载质粒组、XIST敲低+miR-132-3p敲低组,除对照组外其余各组细胞以白细胞介素(IL)-1β诱导建立IDD细胞模型。分别处理各组椎间盘髓核细胞后,采用qRT-PCR检测大鼠椎间盘髓核细胞中XIST、miR-132-3p的表达;MTS法和EdU染色检测大鼠椎间盘髓核细胞增殖能力;ELISA测定椎间盘髓核细胞培养液中IL-6、IL-18水平;Western blotting检测大鼠椎间盘髓核细胞细胞外基质标志蛋白Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)、蛋白聚糖(Aggrecan)的表达;双荧光素酶报告基因实验检测大鼠椎间盘髓核细胞中XIST对miR-132-3p的靶向调控。采用椎间盘内注射IL-1β诱导建立IDD大鼠模型,分为假手术组、模型组、XIST敲低组、空载质粒组、XIST敲低+miR-132-3p敲低组,每组12只。分别处理各组大鼠后,采用qRT-PCR检测大鼠椎间盘组织中XIST、miR-132-3p的表达;TUNEL染色检测大鼠椎间盘组织髓核细胞凋亡情况;番红O染色观察大鼠椎间盘软骨组织形态;ELISA测定大鼠血清炎性因子IL-6、IL-18水平;Western blotting检测大鼠椎间盘组织中CollagenⅡ、Aggrecan的表达。结果与对照组(细胞)/假手术组(大鼠)相比,模型组大鼠椎间盘髓核细胞及椎间盘组织中XIST表达,椎间盘组织髓核细胞凋亡率,以及椎间盘髓核细胞培养液和血清中IL-6、IL-18水平升高(P<0.05),髓核细胞活力、增殖率,以及髓核细胞和椎间盘组织中miR-132-3p、CollagenⅡ、Aggrecan蛋白表达降低(P<0.05);与模型组相比,XIST敲低组大鼠椎间盘组织髓核细胞凋亡率,椎间盘髓核细胞培养液和血清中IL-6、IL-18水平,以及髓核细胞和椎间盘组织中XIST的表达降低(P<0.05),髓核细胞活力、增殖率,以及髓核细胞和椎间盘组织中miR-132-3p、CollagenⅡ、Aggrecan蛋白表达升高(P<0.05);下调miR-132-3p可减弱敲低XIST对IL-1β诱导的椎间盘损伤和软骨基质流失的改善作用。XIST可靶向下调大鼠髓核细胞中miR-132-3p的表达。结论敲低XIST可能通过上调miR-132-3p而抑制炎症,从而抑制IDD髓核细胞凋亡,促进其增殖及细胞外基质合成。

X线诱导大鼠椎间盘髓核细胞体外衰老模型的构建及评价

目的:建立一种由X线诱导的大鼠椎间盘髓核细胞体外衰老模型并对其进行验证评价。方法:选取12只清洁级成熟SD大鼠,取其腰段椎间盘髓核做体外细胞培养,将培养好的髓核细胞按照接受X线照射剂量随机分为0Gy组(对照组)、5Gy组、10Gy组、15Gy组。随后通过细胞形态学观察、β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、细胞增殖检测(cell counting kit-8,CCK-8)、流式细胞术(flow cytometry,FCM)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测、免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测、蛋白印迹实验(Western blot,WB)、1,9-二甲基亚甲基蓝(1,9-dirnethyl-methylene blue,DMMB)比色法检测等实验方法,观察比较不同组别髓核细胞衰老程度和增殖情况,检测衰老相关基因、蛋白和相关因子的表达情况。结果:随着接受X线辐射剂量的增大,髓核细胞在形态学上逐渐表现出典型的衰老特征,并且衰老程度与射线剂量呈正相关,SA-β-Gal测定显示对照组、5Gy组、10Gy组、15Gy组髓核细胞阳性百分比分别是15%、41%、88%和77%。CCK-8实验显示随着辐射剂量的增加,髓核细胞增殖率逐渐降低,第5天10Gy组髓核细胞恢复增殖,而15Gy组髓核细胞仍无增殖表现,FCM证实其细胞仍存在活性,而当辐射剂量提升至20Gy,髓核细胞早期凋亡率骤增。IF及PCR检测均显示衰老基因p16、p21的表达随着髓核细胞接受辐射剂量的增加而逐渐增强,同时聚集蛋白聚糖碎片(aggrecan fragmentation)在WB实验中的表达也逐渐增强。以上实验结果提示15Gy为适宜辐射剂量,再次将15Gy组与对照组比较,CCK-8显示第9天15Gy组髓核细胞依然无增殖表现,PCR检测aggrecan fragmentation的表达15Gy组明显高于对照组(P<0.05)。基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3以及炎症因子IL-6、IL-8在PCR及IF中的表达,15Gy组也明显高于对照组(P<0.05)。结论:X线能诱导体外平面培养的大鼠髓核细胞衰老,接受15Gy辐射量的髓核细胞衰老程度明显且稳定,可作为理想的髓核细胞衰老模型。

蛇床子素通过NF-kB信号通路调控退变髓核细胞的细胞外基质表达、炎症反应及凋亡

目的 研究蛇床子素对退变髓核细胞的细胞外基质表达、炎症反应和凋亡的作用及其潜在机制。方法 采用氧糖剥夺(Oxygen Glucose Deprivation, OGD)培养建立退变髓核细胞模型,将细胞分为:对照组(正常培养)、OGD组(OGD培养)、蛇床子素组(OGD培养+蛇床子素处理)、PDTC组(OGD培养+NF-κB通路抑制剂PDTC处理)和蛇床子素+PDTC组(OGD培养+蛇床子素+PDTC处理)。采用Western blot检测细胞中Ⅱ型胶原(Collagen typeⅡ,Col2al)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、P65和p-P65蛋白表达,ELISA法检测细胞培养液中炎性因子血清白细胞介素-1β(interleukin-1 β,IL-1β),白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 与对照组比较,OGD组细胞中Col2al、Aggrecan蛋白相对表达水平明显降低,细胞培养液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高,细胞凋亡率明显升高,细胞中p-P65蛋白表达明显升高;与OGD组比较,蛇床子素组和PDTC组细胞中Col2al、Aggrecan蛋白相对表达水平明显升高,细胞培养液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低,细胞凋亡率明显降低,细胞中p-P65蛋白表达明显降低,而蛇床子素+PDTC组上述指标改变最为明显。结论 蛇床子素可能通过抑制核因子激活的B细胞的κ轻链增强(nuclear factorκB,NF-κB)信号通路的活性,促进退变髓核细胞的细胞外基质合成、抑制退变髓核细胞的炎症反应和凋亡。

METTL14介导ACSL4的m6A甲基化在髓核细胞铁死亡和细胞衰老中的作用

目的探究METTL14介导ACSL4的m6A甲基化在髓核细胞铁死亡和细胞衰老中的作用。方法采用市售人髓核细胞,利用叔丁基氢过氧化物复制细胞模型,分别复制METTL14过表达和敲除的稳转细胞株。通过分光光度法检测细胞内亚铁离子、MDA、GSH、GPX4水平,流式细胞术检测ROS和细胞线粒体膜电位,采用β-半乳糖苷酶染色评估细胞衰老情况。同时进行了甲基化RNA免疫共沉淀结合实时荧光定量聚合酶链反应(MeRIP-qRT-PCR)和RNA稳定性实验,探究METTL14对ACSL4表达的调控作用。结果METTL14过表达在髓核细胞中导致显著的铁过载(P<0.05)、ROS相对表达量升高(P<0.05)、MDA水平增加(P<0.05),以及GSH与GPX4水平下降(P<0.05),同时降低线粒体膜电位(P<0.05),从而促进了细胞衰老。通过MeRIP-qRT-PCR和RNA稳定性实验发现METTL14调控ACSL4的表达,并影响其mRNA的稳定性。挽救实验进一步证实METTL14通过调控ACSL4促进髓核细胞衰老的机制。结论METTL14通过介导ACSL4的m6A甲基化过程促进髓核细胞的铁死亡和衰老,为深入理解髓核细胞相关疾病的发病机制提供新的视角和治疗靶点。

柠檬苦素通过调节凋亡及氧化应激减轻高糖对髓核细胞的损伤作用

目的 探索柠檬苦素(Limonin)对高糖(HG)诱导的髓核(NP)细胞损伤的保护机制。方法 将人髓核细胞分为空白对照组(0μmol·L^(-1),Ctl组)、HG组(200 nmol·L^(-1))、Limonin(50μmol·L^(-1))+HG组(200 mmol·L^(-1))。使用CCK-8检测不同浓度(50、100、200、300 mmol·L^(-1))HG处理24 h后细胞存活率,检测不同浓度(12.5、25、50、100、200μmol·L^(-1))Limonin处理24、48 h后细胞存活率;Western blot检测凋亡相关指标Bcl-2、Bax表达水平,氧化应激相关指标Nrf2表达水平,以及AKT、p-AKT蛋白表达水平;Nrf2检测核转位水平;TUNEL法检测细胞凋亡水平。结果 CCK-8结果显示,不同浓度(50、100、200、300 mmol·L^(-1))HG对NP细胞活力有不同的影响,与Ctl组相比,在HG浓度200 mmol·L^(-1)时,NP细胞活力下降(P<0.05);在300 mmol·L^(-1)时出现大量死亡的情况(P<0.01),所以选用200 mmol·L^(-1)HG进行后续实验。与Ctl组相比,不同浓度(12.5、25、50、100、200μmol·L^(-1))Limonin与NP细胞共培养24 h时,200μmol·L^(-1)时细胞活力下降(P<0.05);在48 h时,当Limonin浓度在100μmol·L^(-1)时NP细胞活力下降(P<0.05),200μmol·L^(-1)时细胞活力下降(P<0.05),因此选用50μmol·L^(-1)浓度进行后续实验。Western blot结果显示,与Ctl组相比,HG处理后的髓核细胞出现损伤,主要表现为凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2表达上调(P<0.01),氧化应激相关蛋白Nrf2表达下调(P<0.05),信号通路相关蛋白p-AKT/AKT表达下调(P<0.05),经Limonin处理后Bax/Bcl-2表达下调(P<0.01);Nrf2表达上调(P<0.05);p-AKT/AKT表达上调(P<0.05)。Nrf2染色结果显示,Ctl组NP细胞中Nrf2在细胞质内保持相对高水平阳性表达,HG诱导损伤后,NP细胞质内Nrf2阳性表达水平较低,细胞总数减少(P<0.05)。Limonin干预后能够明显增强HG诱导损伤后Nrf2的核转位情况(P<0.01)。TUNEL染色结果显示,与Ctl组相比,HG组阳性细胞数量增加(P<0.01);与HG组相比,Limonin+HG组在经过Limonin处理后,HG诱导NP细胞凋亡的作用减弱,阳性细胞数量减少(P<0.01)。结论 Limonin通过激活AKT/Nrf2信号通路减轻了HG对髓核细胞的损伤,抑制了HG引起的髓核细胞的凋亡与氧化应激。

线粒体在髓核细胞中的作用

随着我国人口老龄化进程的加速,脊柱退行性疾病特别是椎间盘退变(intervertebral disc degenera⁃tion,IVDD)的发病率正逐年上升[1]。退行性椎间盘疾病(degenerative disc diseases,DDD)包括椎间盘突出、椎管狭窄、椎体不稳等,不仅可导致严重腰痛,还可能引起神经压迫,给患者造成极大的精神和经济压力,同时也给医疗系统带来沉重的负担[2]。

动态黏弹性力学微环境调控髓核细胞功能和促进髓核再生的作用与机制研究

目的将黏弹性水凝胶与动态压缩载荷结合,共筑髓核细胞动态力学微环境,深入研究髓核细胞的力-生物学行为及促进髓核再生效果,为治疗椎间盘退变提供新的思路。方法制备力学性能可调的黏弹性水凝胶并进行生物相容性、微观结构和多尺度力学性能检测。进一步检测髓核细胞在不同黏弹性水凝胶表面的增殖、活力、黏附、铺展和迁移情况。在负载细胞的黏弹性支架上施加动态压应变,检测髓核特异性代谢标志物的表达。最后构建大鼠髓核摘除模型后在椎间盘中注射水凝胶,于术后4周和8周进行影像学和组织学检测,评估髓核再生效果。结果制备出初始弹性模量相似、黏弹性不同的水凝胶,分别为快、中、慢应力松弛组。3组均具有良好的生物相容性和多孔结构,其中快松弛组具有与天然髓核相似的黏弹性以及较好的变形恢复能力,同时能显著促进髓核细胞的增殖、活力、骨架铺展和迁移。5%的动态应变能够促进髓核细胞合成代谢、降低分解代谢;快松弛水凝胶能够保护在高应变(20%)下的细胞损伤。在动物水平,黏弹性水凝胶植入后能有效维持椎间盘结构完整性,促髓核再生,减缓椎间盘的退变。结论低应变的动态压缩与黏弹性支架协同作用,能更好调节髓核细胞功能,促进髓核再生修复。

TGM2过表达的骨髓间充质干细胞外泌体抑制乳酸介导的髓核细胞氧化应激性凋亡

目的探究转谷氨酰胺酶2(transglutaminase2,TGM2)过表达的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源外泌体在乳酸介导的髓核细胞氧化应激性凋亡中的作用及机制。方法选用20只6周龄雄性SD大鼠[体质量(350±50)g]用于提取髓核细胞。利用乳酸构建原代髓核细胞氧化应激性凋亡模型;利用慢病毒载体在BMSCs中过表达TGM2蛋白,提取外泌体并进行鉴定;后为验证TGM2过表达的外泌体抗髓核细胞氧化应激性凋亡潜在机制,利用流式细胞术对髓核细胞活性氧水平进行检测,Western blot、免疫荧光对髓核细胞Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase3、磷酸化PI3K、磷酸化Akt、核内Nrf2、胞质Nrf2、HO-1蛋白表达水平及Nrf2核内荧光表达情况进行检测,分为4组(n=3):对照组、乳酸处理组、乳酸+对照外泌体组、乳酸+TGM2过表达外泌体组,评估髓核细胞的氧化应激性凋亡程度及PI3K/Akt/Nrf2通路变化情况。结果10 mmol/L乳酸能够更好的诱导髓核细胞氧化应激性凋亡(P<0.05);对照BMSCs组和TGM2过表达BMSCs组均可产生外泌体且能够稳定过表达TGM2(P<0.05,P<0.01);且相较于乳酸处理组,乳酸+TGM2过表达外泌体组和乳酸+对照外泌体组的髓核细胞均表现为凋亡率降低(P<0.05),活性氧水平下降(P<0.05),乳酸+TGM2过表达外泌体组抗凋亡、活性氧蓄积效果更好(P<0.05),髓核细胞内Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表达均下降(P<0.05),Bcl-2蛋白水平均增高(P<0.05),PI3K、Akt磷酸化程度均增强(P<0.05),Nrf2核内表达均增加,抗氧化应激因子HO-1表达均增多,乳酸+TGM2过表达外泌体组抗凋亡及PI3K/Akt/Nrf2通路激活程度更强(P<0.05)。结论TGM2过表达的BMSCs外泌体可抑制乳酸介导的髓核细胞氧化应激性凋亡,其机制可能与PI3K/Akt/Nrf2通路激活有关。