新型鸭肝炎病毒的分离鉴定

对从广东地区流行鸭肝炎病例中分离到的1株病毒(命名为"GD株")进行了鸭胚(DE)传代培养。DE2～DE6代鸭胚毒的ELD50在10-5.17/0.2mL～10-6.38/0.2mL之间。DE6代毒回归雏鸭后可以产生与1型鸭肝炎病毒(DHV)相同的临床症状和解剖病变。鸭肝组织毒对4日龄、8日龄和16日龄雏鸭的LD50分别为10-6.5/0.5mL、10-5.38/0.5mL和10-4.83/0.5mL。病毒对氯仿、乙醚和胰酶不敏感,能够耐受pH3.0酸处理,62℃30min不能被完全灭活。病毒核酸类型鉴定为RNA病毒。生物学和理化学特性鉴定结果表明,GD株为强毒DHV。使用标准1型DHV阳性血清进行的交叉中和试验和交叉被动保护试验表明,GD株病毒在抗原性上与1型DHV无关。对DHV抗原相关的VP1基因序列分析和同源性比较表明,GD株与DHV-1的VP1核苷酸序列同源性为69.82%,氨基酸序列同源性为71.77%。GD株属于一种在我国流行的新型DHV强毒(暂命名为"CN-DHV")。

新型鸭肝炎病毒的分离及初步鉴定

从北京和广西发病鸭群中分离到 2株病毒 ,分别编号为B株和G株 ,病毒大小约 40nm ,无囊膜。血清中和试验表明 ,2株病毒为同一血清型 ,与 1、3型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒无血清学相关性。人工感染试验表明 ,G株对雏鸭具有很强的致病性 ,可引起典型的鸭肝炎病变 ,但死亡率随雏鸭日龄的增长而明显下降 ;B株病毒不能致死正常雏鸭 ,但雏鸭经过环磷酰胺处理后 ,感染B株病毒可引起雏鸭死亡 ,死亡鸭肝肿胀。

鸭肝炎病毒Ⅰ型VP3基因的克隆及原核表达

参照鸭肝炎病毒Ⅰ型(DHV-Ⅰ)的基因组序列设计并合成了1对引物。通过RT-PCR方法扩增获得了DHV-Ⅰ病毒161/79/V结构蛋白VP3基因,并将VP3基因片段插入pGEX-6p-1表达载体,转化E.coli Rosetta-gami(DE3)pLysS。SDS-PAGE分析表明,经用0.1mmol/LIPTG于16℃诱导表达后,菌体裂解产物有特异的、分子质量约52ku的目的蛋白条带。Western-blotting检测表明,表达产物与DHV-Ⅰ阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。

新型鸭肝炎病毒实验感染雏鸭的组织病理学

以“新型鸭肝炎病毒”实验感染雏鸭 ,对感染雏鸭的组织病理变化进行了观察。结果表明 ,接毒后 2 4～ 48h为感染鸭死亡高峰 ,试验发病的死亡率为 80 %;感染雏鸭肝、脾、胰、肾的组织病理变化分别表现为出血性、坏死性肝炎 ,坏死性脾炎 ,胰局灶性坏死及肾小叶的异嗜性粒细胞浸润。肝、肾组织的脂肪染色结果表明 ,肝脏有脂肪蓄积 ,而肾脏未见有脂肪蓄积。

鸭肝炎病毒分子流行病学分析

为了解我国鸭病毒性肝炎(DH)的流行情况,本研究用标准DH病毒(DHV)Ⅰ型(DHV-1)抗血清和新型DHV(N-DHV)抗血清对国内分离的7株DHV进行了血清中和试验。结果表明,PLK株和YB3株为DHV-1;YB1、YB2、YB5、HY2和HY3株为N-DHV。同时,对国内分离的9株病毒的抗原相关VP1基因进行RT-PCR扩增和测序,对VP1基因的核苷酸与推导的氨基酸序列分析的结果表明,3株DHV-1的氨基酸序列同源性为95%左右,6株N-DHV的氨基酸同源性为98%左右;DHV-1分离株与N-DHV分离株间氨基酸同源性为72%～77%。参照同属微RNA病毒的人肠病毒的血清型分型标准,通过对DHV VP1基因序列同源性比较,判定9株病毒的血清型。依据VP1基因序列同源性进行的血清型分型结果与根据抗原性鉴定进行的血清型分型结果一致。同血清型病毒株间的VP1基因变异很小,表明DHV的抗原性稳定。同型不同毒株间VP1基因的差异可以导致病毒在致病力、细胞感染能力等方面的差异。研究结果表明,目前我国存在DHV-1和N-DHV两种独立的血清型,但尚未见血清亚型的流行。

新型鸭肝炎病毒流行病学调查及免疫防治试验

本试验通过鸭胚尿囊腔接种,对我国部分省市采集的死于疑似鸭病毒性肝炎的病鸭肝组织进行病原分离,获得9个病毒分离株。这些分离株对10日龄鸭胚的致死率为100%,人工感染6日龄雏鸭的致死率为0~100%不等。死亡鸭呈角弓反张姿势,剖检可见肝脏肿大,有出血点或出血斑。将9株分离株经鸭胚传至第5代,收集鸭胚尿囊液毒测定这些毒株的ELD50为10-7.32/0.2 ml^10-3.5/0.2 ml不等。用鸡抗1型DHV及新型DHV的血清进行中和试验,结果表明:有7株为新型DHV,有2株为1型DHV。对实验室早期分离的新型鸭肝炎病毒B株经过鸭胚传代致弱后,收集鸭胚尿囊液毒稀释成不同倍数对1日龄雏鸭进行免疫,并于10日龄时用新型鸭肝炎强毒进行攻毒保护试验,结果B20株在20倍稀释时,保护率达100%。采集免疫的雏鸭血清,中和试验测定血清的效价,雏鸭在免疫后可检测到中和抗体,第10天时抗体水平达到高峰,然后呈逐渐下降趋势。结果表明,B株经过鸭胚传代致弱后在毒力下降的同时仍保留一定的免疫原性,可以作为疫苗的候选株。

7株鸭肝炎病毒分离株及疫苗株的全基因组序列测定与变异分析

为了分析中国鸭肝炎病毒(DHV)的遗传变异和进化关系,作者测定了中国不同地区分离的7株DHV及1株疫苗株的全基因组序列,并与公布的40株DHV序列进行比较分析。结果发现VP1变异程度较大,高变区主要集中在180-194位和213-219位;不同毒株的潜在N-糖基化位点存在较大差异。多数基因的进化分析均表现出一致的结果,测序的8个毒株均分布在同一个遗传谱系,属基因A型,与基因B型和基因C型遗传距离较远,不在同一分支上。而JYZ02株与R85952株的遗传距离最近,属同一个亚支,提示JYZ02株可能由毒株R85952演化而来。结合氨基酸序列相似性分析和代表毒株的血清交叉中和试验结果,表明近年分离并测序的上述7个毒株未发生抗原变异。从多毒株进化分析结果可以看出,血清1型DHV仍是我国流行的优势血清型。

鸭肝炎病毒的研究进展

鸭肝炎病毒是一种高致死性、高传播性的病毒性传染病病原,临床主要引起急性肝炎,主要侵害3周龄以内的雏鸭,尤以1周龄内的雏鸭为甚,病死率高达100%。20世纪以来,鸭肝炎已成为危害中国养鸭业最为严重的疫病之一,给养鸭业带来了巨大的经济损失。作者对鸭肝炎病毒的发生与分布、病原学、基因组学、诊断与防治等方面进行了综述。

2007～2009年华南地区鸭肝炎病毒流行病学调查及分离株的VP1基因变异分析

为了分析华南地区鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)的遗传进化情况,本试验对2007～2009年华南地区各鸭场发病雏鸭进行DHV的病原学检测以及VP1基因扩增、克隆和测序,并运用生物信息学软件对VP1基因进行了序列分析。结果表明:所分离的R、SS1、ZJ株为DHV-A、VP1 DHV-A参考毒株核苷酸序列相似性分别为93.8%～100%、93.7%～99.6%、91.7%～98.9%,氨基酸序列相似性分别为94.5%～100.0%、94.1%～99.2%、95.0%～99.2%。其余15株DHV-C分离病毒株与台湾新型DHV核苷酸和氨基酸序列相似性均在71.4%～72.0%和78.2%～79.0%之间,与韩国新型DHV相似性在94.0%～95.1%和91.6%～93.3%之间,与国内分离的新型DHV相似性均在97.9%～100.0%和97.5%～100.0%之间。VP1氨基酸序列比对分析表明:VP1的高变区主要分布在46～64、95～149、180～223位,尤其是C′末端,存在点突变或连续变异。在第145～146位,15株新型DHV毒株比3株Ⅰ型DHV多2个氨基酸(G和G)。小RNA病毒科的VP1蛋白中保守的RGD基序,在DHV中分别显示为SGD和QSD。结果表明,危害华南地区鸭场的DHV已经发生变异,且存在两种基因型毒株的流行。

3株鸭肝炎病毒Ⅰ型结构基因VP1的克隆及序列分析

通过RT-PCR方法扩增鸭肝炎病毒DHV-1：161/79/V、YH、HN株的VP1基因的核苷酸序列。系统发育分析表明,3株病毒与已发表的DHV-1结构基因VP1核苷酸和氨基酸的同源性分别为92.7%~96.9%和95.4%~96.6%,与DHV-1变异株核苷酸和氨基酸序列的相似性均分别低于75%和88%,表明3株病毒属于DHV-1,与变异株是不同的血清型。强毒DHV-1：161/79/V的VP1蛋白第49和第183位氨基酸为T和H,弱毒DHV-1：YH、HN为S和Q,推测这2处位点的改变可能与病毒的强弱有关 DHV-1和其变异株的VP1蛋白均没有保守的RGD序列 变异株N-DHV：90D、04G在第50和51位比DHV-1多2个氨基酸（Q和D）,在第147和185位各缺失1个氨基酸（E和L）,而在变异株DHV：AP-03337、AP-04009、AP-04114、AP-04203的第145和146位比DHV-1多了2个氨基酸（G、G） 不同血清型的鸭肝炎病毒在46-64位、95-149位、180-223位抗原指数差别较大,推测这些位点的改变可能影响病毒的生物学特性。

鸭肝炎自然病例与鸭肝炎病毒人工发病病例组织病理学观察

到目前为止 ,对鸭肝炎Ⅰ型作组织病理学研究的工作可分为下列几种 :鸡鸭肝炎Ⅰ型标准毒株人工发病雏鸭肝、脾、脑等多种器官作组织病理学观察 ;对鸭肝炎Ⅰ型野外病例肝、脾、脑等作组织病理学观察 ;对鸭肝炎Ⅰ型人工感染鸡胚肝脏等几种脏器作组织病理学观察等。国外Sandhu等还对鸭肝炎Ⅰ型变异株感染雏鸭作组织病理学观察。本文报道了对珠江三角洲有变异倾向的鸭肝炎Ⅰ型自然病例和 6株野毒人工发病病例的组织病理学观察结果 ,观察包括肝、脾、胰、脑、心、肺、肾、腺胃、小肠、法氏囊等 10种脏器 ,并对各器官的病变进行具体描述与统计。为国内外研究DHVⅠ型变异株感染的组织病理学研究提供了更丰富详实的资料。

鸭肝炎病毒基因组3′末端序列的克隆和分析

用3′RACE和RT-PCR扩增并克隆鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）Ⅰ型毒株C80和Ⅰ型变异株E63的3′末端序列。分析结果显示,C80株和E63株基因组3′末端均包含1 359 nt的3D、终止密码子TGA、长314nt的3′UTR,而poly（A）尾分别含18个A和19个A。由2株DHV 3D核苷酸序列所推导的3D蛋白均含453个氨基酸,均包含KDELR、DxxxxD、GxxCSGxxxTxxxNS、YGDD和FLKR等小RNA病毒RNA聚合酶的特征基序,该结果进一步证实Ⅰ型DHV属于小RNA病毒科的成员。两株DHV与小RNA病毒科9个已知属之间3D蛋白的氨基酸序列同源性为16%-37%,介于属间3D蛋白的氨基酸序列同源性范围（18%-60%）之内;此外,Ⅰ型DHV的3′UTR在小RNA病毒科是最长的。用3D蛋白进行进化分析的结果表明,Ⅰ型DHV可能属于小RNA病毒科的一个独立的病毒属。

鸭肝炎病毒诱导雏鸭细胞凋亡的研究

以鸭肝炎病毒 (DHV)强毒株背部皮下接种 7日龄健康雏鸭 ,研究其不同时期诱导淋巴细胞及其他细胞凋亡的能力。结果表明 ,DHV能引起试验鸭淋巴细胞明显凋亡 ,维持时间较短 ,在 36 h达到高峰。揭示该病毒致病机理与淋巴细胞凋亡从而引起的免疫抑制相关。除淋巴细胞外 ,肝、肾、脑等器官的细胞凋亡不明显 ,与对照组无显著差异。

鸭肝炎病毒的分离鉴定及其理化和生物学特性初步研究

通过鸡胚尿囊腔接种,对山东省滨州地区采集的死于疑似鸭病毒性肝炎(DVH)的病鸭肝组织进行病原分离,获得1株病毒。动物试验结果表明,该病毒分离株的致死率高达80%。经过临床症状观察、剖检病理变化、理化特性试验、中和试验、RT-PCR鉴定和动物致病性试验等鉴定为Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV),命名为BZ-Ⅰ株。该研究为有效预防DVH提供了较为有用的试验数据。

新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为了解新型鸭肝炎病毒(N-DHV)的变异情况,本实验从广西、河南、山东临床发病鸭体内分离到3株病毒。通过RT-PCR检测为N-DHV。将分离株进行鸭胚传代培养,并测定鸭胚毒的ELD50为10-3.29/0.2 mL～10-4.65/0.2 mL。以1型和N-DHV阳性血清分别与分离株进行血清交叉中和试验,结果表明,Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)阳性血清对分离株无保护性。动物回归试验表明,分离株致死雏鸭的临床症状和病变与DHV-1相同,分离株的致死率为30%～70%。将分离株接种鸡胚,不产生任何病变,在鸡胚成纤维细胞中连续传5代后,细胞产生明显、规律的病变。扩增3株分离株的VP1基因,并进行氨基酸序列比对,结果表明3个分离株与DHV-C的同源性最高,与DHV-A的同源性最低,并存在氨基酸的插入和缺失。本实验表明3个分离株与韩国N-DHV属于同一血清型。

新型鸭肝炎病毒感染雏鸭血液生化指标的动态变化

用新型鸭肝炎病毒人工感染9日龄健康樱桃谷雏鸭,对感染雏鸭的临床症状、病理变化进行观察,并测定了感染雏鸭在接种后12、24、48、96、168 h和14 d时血糖、谷草转氨酶、谷丙转氨酶等13项血液生化指标。结果表明:血清葡萄糖含量(G lu)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)均降低,仅总蛋白在接毒后24 h有一过性升高;血清谷草转氨酶(A ST/GOT)、谷丙转氨酶(ALT/GPT)的活性升高;胆碱酯酶(CHE)仅在接毒后12 h明显升高。碱性磷酸酶(ALP)在接毒后12、24和96 h表现出明显变化,其中接毒后12 h和96 h呈降低状态,接毒后24 h升高。血清尿酸(UA)的浓度在接毒后168 h降至最低值,以后便恢复正常。血清肌酐(CRE)的含量在接毒后12 h降低,随后在24 h升高,其他时间无变化。血清钙(C a)、磷(P)变化无明显规律。血清α-淀粉酶(-αAm y lase)活性在整个试验期间无明显变化。说明新型鸭肝炎病毒感染雏鸭血清葡萄糖、总蛋白、白蛋白含量和谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性的变化规律与患1型鸭肝炎雏鸭的变化规律相一致。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒鉴别RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中公布的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和实验室分离到的Ⅰ型鸭病毒性肝炎ZJ株、Ⅰ型鸭病毒性肝炎R株所测序列（GenBank登录号分别为EU841005和EF585200）以及新型鸭肝炎病毒全基因组序列，应用PrimerPrimier5．0软件，在序列保守区域分别设计了2对鉴别引物，成功建立了Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒的鉴别RT—PCR检测方法。结果表明：该方法能从Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒中扩增到与预期相符的471bp条带，从广东佛山分离到的新型鸭肝炎病毒FS株中扩增到705bp的条带，设计的2对引物能够特异性地检测出Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒，特异性好；分别能够检测出模板含量为0．8ng／μL和1．0ng／μL的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒。因此，该方法可用于Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭病毒性肝炎临床样品的鉴别诊断和分子流行病学调查。

应用胶体金免疫电镜技术检测鸭肝炎病毒

本研究应用胶体金免疫电镜技术和直接电镜（ＤＥＭ）、免疫电镜（ＩＥＭ）比较观察了鸭肝炎病毒（ＤＨＶ）ＱＬ＿７９弱毒株和Ｒ＿８５９５２标准强毒株。ＱＬ＿７９株和Ｒ＿８５９５２株的形态结构是一致的，球形，大小为２０～４０ｎｍ。胶体金免疫电镜技术可作为检测ＤＨＶ的常规方法，具有简便、快速、灵敏、直观等特点。

国内新型鸭肝炎病毒基因组3′末端的序列特点

为揭示国内新型鸭肝炎病毒（DHV）基因组3′末端的序列特点,用3′RACE和RT-PCR克隆DHV分离株C-GY株的基因组3′末端序列,并以GenBank中已知全序列的22株DHV作为参照,进行比较分析。结果表明,C-GY株基因组3′末端包含1 359 nt的3D、终止密码子TAA3、66 nt的3′UTR和15 nt的poly（A）。与其他DHV相同之处：C-GY的3D蛋白含453个氨基酸,亦包含小RNA病毒RNA聚合酶的5个特征基序。C-GY的3′UTR长度与台湾新型DHV相同,仅比韩国新型缺少1个C,但比DHV血清1型（DHV-1）长52 nt。分析3D和3′UTR核苷酸序列,可见C-GY与16株DHV-1之间同源性为75%～77%和66%～68%、与2株台湾新型DHV之间为80%和91%、与4株韩国新型之间为96%～97%和96%～97%,表明C-GY与韩国新型DHV具有相近的遗传关系,C-GY株与本实验中参考DHV属于小RNA病毒科的同一个未命名的新属,而且C-GY属于DHV的基因C型,也说明新型DHV与DHV-1的基因组3′末端存在较高的序列变异性。