48份水稻骨干材料香味及Badh2变异类型的鉴定

为促进香稻育种,明确水稻重要种质资源中香味基因的存在情况,本研究将传统香味鉴定方法(KOH浸泡法)与分子标记技术相结合,对48份水稻骨干材料的香味及香味基因Badh2变异类型进行鉴定。结果表明,在48份供试材料中,利用KOH浸泡法检测到具有香味的材料有44份;利用香味基因Badh2的7种等位基因变异类型功能标记检测到含有香味的材料有43份,其中,有41份为纯合香型,2份为杂合型,等位基因Badh2-E2的变异类型有37份,等位基因Badh2-E7的变异类型有6份,未检测到等位基因Badh2-E4-5、Badh2-E12、Badh2-E13、Badh2-UTR和Badh2-Pro的变异类型。通过比较KOH浸泡法与分子标记技术,发现仅有1份材料检测结果不同,明水香稻(X23)用KOH浸泡法检测出具有香味,但本研究所用的Badh2的7种等位基因变异类型功能标记却未检测出含有香味,说明该材料可能属于Badh2其他已报道的或新的等位基因变异类型,也可能是含有新的香味基因。

转BADH基因玉米的获得及其耐盐性

利用花粉管通道技术将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入玉米,以提高玉米的耐盐性.对1 286株转化玉米进行PCR检测,共有16株呈阳性,转化率为1.2%.Southern Blot进一步证明BADH基因已经整合到玉米基因组.将阳性植株的后代(T3)用含1.2%NaCl的Hogland营养液每日1次浇灌,14 d后对玉米叶片的相对电导率和叶绿素含量进行测定.结果表明在同样的盐胁迫条件下,转基因植株所受到的盐伤害明显较对照植株轻,说明转入的BADH基因可以提高玉米的耐盐能力.

甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因转化小麦及其表达

采用基因枪法将山菠菜甜菜碱醛脱氢酶 (BADH)基因导入小麦 (TriticumaestivumL .)品种 ,并且得以表达。该基因由玉米Ubi1启动子控制。在盐胁迫条件下 ,多数转基因植株叶片的BADH活性比受体亲本提高 1～ 3倍 ,部分植株相对电导率比亲本明显低 ,表明转基因植株的细胞膜在胁迫时有受损较轻倾向。PCR和Southern杂交分析证实外源BADH基因已插入小麦基因组 ,平均转化频率为 4.1%。

大豆BADH基因的生物信息学、多样性及功能分析

为研究大豆中甜菜碱醛脱氢酶(BADH)在大豆中的分子机理及生物多样性,通过基因序列同源比对搜索到两个与水稻同源的大豆BADH基因,利用Phytozome、Netphosk 3.0 Server等网站及数据库对其进行生物信息学分析,结合已有的重测序数据分析1 598份大豆种质中BADH基因序列的多态性,并测定突变体的2AP含量。结果表明:大豆中有两个与水稻BADH基因同源性较高的基因序列Gm06g186300和Gm 05g0330550,基因全长分别为3 959和6 008 bp,编码蛋白均属于稳定蛋白质,二者同源性高达90%。两个蛋白的氨基酸数目、分子量和等电点等非常相似;亲水性和磷酸化位点分布较一致,均无跨膜结构域,在细胞核出现的可能性最大,且二者进化关系极其相近;α螺旋和无规则卷曲是两者的主要成分,BADH1和BADH2有1个共同的结构域Pfam-Aldedh,且分布大致相同。对1 598份大豆种质BADH基因序列突变位点进行分析,有29份材料BADH2基因发生6个碱基序列突变导致了移码突变,这种突变可能与大豆的芳香性表型有关。对BADH1及BADH2在大豆不同部位的基因表达量分析发现各部位的表达量相差很大,均以根部表达量最高,可能与根部较高的抗旱能力有关。

利用CRISPR/CAS9技术编辑水稻香味基因Badh2

【目的】香稻作为一类特殊的水稻群体,以其清香可口的品质特性备受消费者的欢迎。到目前为止,水稻中的香味主要受第8染色体上编码甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2控制。【方法】通过CRISPR/CAS9技术对中花11的香味基因Badh2进行编辑。【结果】获得转基因T_0代植株并对其所衍生的T_1代20个单株进行了鉴定分析,获得了一个剔除了载体骨架且第1外显子上插入一个碱基T的突变体材料。该材料中Badh2 RNA水平显著下调;利用GC-MS技术测定野生型及突变体材料籽粒2-乙酰-1-吡咯啉含量,结果表明突变体材料中的香味物质显著增加;此外,我们还对野生型及T_2代香型植株水稻产量及稻米蒸煮食味品质进行了考查及测定分析,发现除分蘖数及结实率呈现出显著差异外(P<0.05),其余各项指标在两组材料间都无显著差异。【结论】通过CRISPR/CAS9技术成功地对水稻香味基因进行了编辑,可为香稻育种提供丰富的理论指导,加快香稻的育种进程。

转BADH基因苜蓿T1代遗传稳定性和抗盐性研究

采用分子生物学检测和不同浓度的NaCl对转BADH基因苜蓿T1代2个株系进行遗传稳定性和抗盐性研究。结果表明,2个株系的T1代PCR阳性植株和阴性植株分离比例都符合孟德尔遗传规律;在0.8%NaCl胁迫下,转基因植株Northern杂交表达量明显增加,BADH酶活性和甜菜碱含量分别比对照植株增加2-4和4-5倍;不同浓度NaCl胁迫下转基因株系脯氨酸和可溶性糖含量、抗氧化酶活性都显著高于对照植株,而电导率和丙二醛含量显著低于对照植株。表明转入的BADH基因可以稳定遗传,转基因苜蓿植株耐盐性明显高于对照。

转BADH基因玉米植株的获得及其耐盐性分析

采用超声波辅助花粉介导植物转基因方法,将甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因导入玉米自交系郑58,获得了耐盐性强的转基因玉米植株。经卡那霉素抗性初筛、PCR扩增、Southern blot分析,证明BADH基因已导入转化植株并整合到其基因组中。用不同浓度的NaCl溶液对T2代转基因玉米植株与对照进行盐胁迫处理,结果表明,转BADH基因玉米植株表现出一定的抗逆性,生长状况明显优于对照；根据非转化苗对 NaCl 的反应以及生长状况,确定250 mmol L^–1 NaCl溶液为玉米幼苗耐盐性筛选的适宜浓度；依据此临界浓度下形态指标和生理生化指标的测定结果,与对照相比,转基因植株的株高提高10.94%-25.70%,鲜重增加8.62%-18.20%,干重增加9.00%-18.18%,相对电导率降低37.21%-58.14%,叶绿素含量增加15.89%-90.65%,超氧化物歧化酶（SOD）活性提高64.92%-148.29%,丙二醛（MDA）含量减少26.97%-48.05%。综上所述,转入甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因提高了玉米的耐盐性。这是首例将BADH基因导入优良玉米自交系郑58的报道。超声波辅助花粉介导法是一种经济、高效、实用和无基因型依赖性的植物基因转化方法。

BADH/pepB双价基因无选择标记表达载体转化苜蓿的初步研究

选用公农1号紫花苜蓿，以5～7d苗龄的无菌子叶为外植体，通过农杆菌介导法将含有甜菜碱醛脱氢酶（BADH）和酸性蛋白酶（pepB）双价基因的无选择标记表达载体导入苜蓿子叶中，并用含有Na2CO3和NaHCO3碱性盐溶液的培养基进行筛选，得到抗盐碱转化植株。碱性盐浓度48mmol／L宜于子叶愈伤诱导，有利于转化植株的获得。对转化植株进行PCR检测，初步证明目的基因序列已经整合到苜蓿基因组中。移栽成活的13棵碱性盐抗性植株经PCR检测有3棵植株呈阳性。

干旱胁迫下不同抗旱性小麦BADH表达及甜菜碱含量的变化

根据已发表的几种植物的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的AA同源保守区设计了1对简并引物,通过RT PCR方法从小麦叶片中扩增出BADHcDNA的中间序列,共72 3bp ,编码2 4 0个氨基酸。Northern杂交表明,扬花期遭受轻度水分胁迫时,抗旱性较强(旱丰970 3)与抗旱性较弱(山农2 15 95 3)的2小麦品种叶片中BADH基因的表达没有明显差异;灌浆期中度水分胁迫时,其表达水平明显增加,且旱丰970 3的表达量略高于山农2 15 95 3;乳熟期较严重土壤水分胁迫条件下,抗旱性强的品种BADH的表达量明显高于抗旱性弱的品种。3个生育期中,BADH活性和甜菜碱含量的变化与BADH表达呈现相同的趋势,均是先增加后降低,旱丰970 3的BADH活性与甜菜碱含量均高于山农2 15 95 3。这可能是旱丰970 3对干旱胁迫具有较强抗性的主要原因之一。

逆境下转BADH基因小麦甜菜碱醛脱氢酶活性表达与甜菜碱积累

对盐、旱逆境下转BADH基因小麦品系99T6的生长发育、甜菜碱醛脱氢酶活性及甜菜碱积累等进行了研究分析,结果表明,转BADH基因株系在盐逆境下具有明显的生长优势,耐盐能力达到100mmol/L;电导率和质膜相对透性表明转基因株系抗膜损伤能力增强;甜菜碱醛脱氢酶活性的增强和甜菜碱积累的增加,说明转基因株系的盐旱逆境抗性是通过甜菜碱积累这一长期、持久的方式解除渗透胁迫,而不是通过脯氨酸积累这种临时的应急反应;以甜菜碱作为靶标性状采用基因工程方法提高植物盐旱耐性是可行的。

转BADH基因水稻幼苗抗盐性研究

以转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因水稻品系52-7的受体亲本中花8号、旱作品种开系7和陆稻白珍珠为对照,分别用含0、5、7 g?L-1NaCl的水稻专用营养液培养水稻幼苗,对转BADH基因水稻品系52-7的抗盐性及其机理进行研究.结果表明:在正常培养条件下,转基因水稻幼苗比对照品种长势旺,根系活力强,可溶性糖和叶绿素含量高,抗氧化酶SOD和POD活性高.在盐胁迫条件下,水稻幼苗生长减慢,根冠比值减小,根系活力增强;膜透性和丙二醛(MDA)含量增加,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性提高;脯氨酸和可溶性糖含量升高,叶绿素含量下降,蛋白质分解加强;且随着盐浓度的升高各指标变化幅度增加.与对照品种比较,转基因水稻幼苗在盐胁迫下的生长量和根冠比较大,电解质相对渗出率和MDA含量较低,蛋白质和叶绿素分解较少,表现出较强的抗盐性.盐胁迫下转基因水稻幼苗比对照品种具有更高的脯氨酸和可溶性糖含量以及SOD和POD活性,使其抗盐性强.

CMO与BADH双基因表达载体构建及在烟草中的表达

目的将甜菜碱合成关键酶CMO与BADH基因构建到同一表达载体中。方法用转基因方法将该表达载体导入植物体内,完善植物体内的甜菜碱合成途径,提高植物的抗旱性和耐盐性。以pC1303质粒为基础,构建了均由35S启动子驱动的CMO基因和BADH基因的植物双基因表达载体pC35SC35SB1303。利用冻融法将其导入农杆菌LBA4404中,通过农杆菌介导法分别将CMO基因、BADH基因以及该双基因表达载体导入烟草中。结果PCR检测和Northern杂交分析表明,外源基因已整合到受体植物基因组中并正常表达。结论对转基因植株及对照植株甜菜碱含量的检测结果表明,转双基因植株的甜菜碱含量明显高于转BADH基因植株、转CMO基因植株及对照植株。

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh2

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T0代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T1代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295μg·g-1,极显著(P<0.01)高于非转基因对照(0.046μg·g-1)。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。

转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因小麦的耐盐耐旱性

采用室内模拟盐、旱胁迫,结合田间实际测定的方法,对基因枪法获得的转BADH基因小麦多个株系的不同世代材料进行了耐盐、耐旱性鉴定。结果表明,在旱、盐胁迫条件下,转BADH基因小麦在种子萌发、幼苗生长、根系发育以及质膜保护等方面均比受体品种(对照)具有明显的优势;在田间生长条件下的转基因株系,其叶片蒸腾强度比对照明显降低,而离体叶片失水速率与对照没有明显差别。

转BADH基因水稻叶片气孔特征的扫描电镜观察研究

用扫描电镜研究了3个转BADH基因水稻品系52-7、51-15和51-22叶片的气孔特征,观察发现52-7具有少气孔性和小气孔性,气孔不具明显的边缘优势效应;而51-15和51-22不具这些特性。52-7叶片的气孔特征能增强其保水能力,加强代谢和运输,促进植株的生长发育,提高单株籽粒产量;BADH基因的表达能提高52-7、51-15和51-22的耐旱性,达到高产。

碱蓬SgBADH的克隆与分析及植物表达载体构建

为研究碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因的功能,采用同源克隆方法,从碱蓬(Suaeda glauca(Bunge)Bunge.)中克隆到BADH全长c DNA,命名为Sg BADH,并对其序列结构和表达特性进行分析。生物信息学分析发现,Sg BADH编码500个氨基酸的亲水性蛋白,预测亚细胞定位于叶绿体。基因表达分析发现Sg BADH基因受Na Cl和ABA诱导表达,预示Sg BADH基因可能在碱蓬对盐胁迫的反应中起重要作用。本研究同时构建了Sg BADH植物表达载体并转化EHA105农杆菌,为进一步研究BADH基因的功能和碱蓬的耐盐分子机制奠定了基础。

耐盐柳树BADH基因克隆及表达分析

根据毛果杨(Populus trichocarpa)甜菜碱醛脱氢酶BADH基因设计了1对引物,采用同源克隆法从耐盐柳树(Salix)L0911中扩增出BADH基因的1个开放阅读框架,其核甘酸序列全长1 539 bp,推测的氨基酸序列全长为512个氨基酸残基。该氨基酸序列与毛果杨PtBADH2、胡杨PeBADH2编码的同源性分别为95.83%、95.03%,与水稻的同源性为71.68%。说明BADH基因相对保守。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析结果表明L0911BADH基因的表达是受盐胁迫诱导的,说明BADH基因与盐胁迫存在紧密关联。

新疆大叶紫花苜蓿BADH基因转化体系的研究

以新疆大叶苜蓿(Medicago sativa‘Xinjiang Daye')叶片作为转化受体,利用农杆菌介导法将从梭梭(Haloxylon ammodendron)中获得的甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)转化紫花苜蓿,研究选择剂卡那霉素对愈伤组织分化的影响,并采用正交试验设计优化了影响紫花苜蓿转化的4个主要因子,建立了农杆菌介导的紫花苜蓿高效转化体系,获得了转基因植株。结果表明:卡那霉素在愈伤组织分化培养时的上限浓度以50 mg·L^(-1)为宜;转化过程中当浸染时间为5 min,菌液浓度OD_(600)为0.2,外植体预培养6 d,共培养后清洗外植体的头孢雷素(Cef)浓度为800 mg·L^(-1)是最佳转化方案,抗性芽分化率达到65.5%;4个因子中菌液浓度对转化率影响最大,清洗外植体的Cef浓度和浸染时间影响次之,外植体预培养时间的影响最小。经PCR和RT-PCR检测,初步证明了BADH基因已经整合到紫花苜蓿中,转化率为16.0%。

转BADH基因水稻幼苗抗旱性研究

为了研究转BADH脱氢酶基因水稻的抗旱性,以受体亲本中花8和水稻旱作品种开系7及陆稻品种白珍珠作对照,于塑料营养钵中培养幼苗至五叶期进行干旱胁迫,测定了转BADH基因水稻品系52-7,51-15幼苗的生理生化变化。结果表明,干旱胁迫下,水稻幼苗细胞膜透性增加,膜脂过氧化产物MDA含量以及氨基酸、可溶性糖和游离脯氨酸含量提高,可溶性蛋白质含量降低,POD活性提高。但52-7和51-15细胞膜透性较小,MDA积累较少,蛋白质、氨基酸含量的变化幅度较小,可溶性糖、游离脯氨酸含量的增加幅度较大,POD和SOD活性较高。52-7,51-15与中花8具有相同的POD同工酶谱,与开系7和白珍珠有差异。干旱胁迫诱导中花8产生3条新酶带而与开系7和白珍珠相同,其他各品种酶谱不变。52-7和51-15的抗旱性强于对照品种。

豫南香稻品种Badh2基因功能标记的检测及应用

【目的】香稻中香味的产生是由于水稻第8染色体上面Badh2基因的功能缺失而导致2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)前体物质的增多,进而2AP积累使稻米产生香气。【方法】本研究利用Badh2基因开发的7个功能标记,针对豫南地区16份香稻品种进行了检测与分析。【结果】4份香稻品种属于第2外显子突变类型,2份香稻品种属于第4~5外显子突变类型,5份香稻品种属于第7外显子突变类型;并没有发现Badh2基因启动子区及第12~14外显子突变类型的香稻品种。【结论】通过Badh2基因功能标记的检测与分析,本研究鉴定了豫南香稻品种对应的突变类型,为利用分子标记辅助选择培育优质香稻新品种奠定基础。