利用CRISPR-Cas9技术编辑OsBADH2基因改良优质恢复系桂恢852的香味品质

【目的】利用CRISPR-Cas9技术编辑桂恢852的甜菜碱醛脱氢酶基因(OsBADH2),以期快速改良广西优质恢复系桂恢852的香味品质,为广西香稻新种质的创制提供亲本资源及技术参考。【方法】以广西优质非香型水稻桂恢852为材料,对其OsBADH2蛋白的序列特征、保守结构域、保守基序、系统发育进化等进行分析,再根据CRISPR-GE网站信息挑选合适的靶位点,分别构建OsBADH2基因第1、2外显子的双突载体pLM62和第7外显子的单突载体pLM63。利用CRISPR-Cas9技术和水稻遗传转化技术靶向敲除桂恢852的OsBADH2基因,获取不同类型的osbadh2突变体。以桂恢852为对照,通过咀嚼法鉴定突变体osbadh2是否具有香味。最后,通过农艺性状测定和单因素方差分析,判断OsBADH2基因突变是否影响农艺性状。【结果】OsBADH2基因序列全长为6268 bp,包含15个外显子和14个内含子,其编码区(CDS)为1512 bp,编码503个氨基酸残基,具有1个典型的Aldedh结构域(第16~485位氨基酸),属于醛脱氢酶,其蛋白序列与结构相对保守。通过OsBADH2氨基酸序列的BLAST比对分析,分别获得水稻的3个高相似性蛋白和拟南芥的4个高相似性蛋白,其中水稻OsBADH1、OsBADH2、OsALDH2B2、OsALDH2C1及拟南芥BADH1、BADH2、AL2C4均属于ALDH-SF(Aldehyde dehydrogenase superfamily)超家族成员。OsBADH2与OsBADH1为旁系同源基因,与拟南芥中BADH1和BADH2为直系同源基因。在桂恢852的遗传背景下成功获得4种突变类型且不含T-DNA的纯合突变体株系(osbadh2-1~osbadh2-4)。这4种突变类型均会使OsBADH2基因发生移码突变,导致翻译过程提前终止,破坏OsBADH2蛋白的原有结构和功能,导致4个osbadh2突变体株系的稻米产生香气。4个osbadh2突变体株系的株高、有效穗数、穗长、结实率、千粒重、长宽比与桂恢852野生型间无显著差异(P>0.05),但osbadh2-2突变体与osbadh2-4突变体的结实率存在极显著差异(P<0.01)。【结论】桂恢852的4个osbadh2突变体株系均具有香味品质,且综合农艺性状与野生型无显著差异,表明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术能快速定向改变水稻品种的目标性状,极大缩短了育种年限。

基于CRISPR-Cas9技术建立CSE1L基因敲除C2C12细胞

为研究染色体分离样蛋白1(chromosomesegregation 1-like,CSE1L)在小鼠骨骼肌发育中的作用,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建CSE1L基因敲除的C2C12细胞系。针对小鼠CSE1L的第3外显子设计3组sgRNA,构建sgRNA表达质粒(连接绿色荧光蛋白,green fluorescent protein,GFP)和Cas9质粒(连接红色荧光蛋白,red fluorescent protein,RFP)共转染C2C12细胞,筛选高切割效率的sgRNA;将转染该sgRNA和Cas9的C2C12细胞进行流式细胞分选,获取共表达红、绿双色荧光蛋白的细胞,并用DNA测序进行鉴定。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(Western-blot)鉴定其分子特征。最后分别利用CCK-8、细胞周期以及凋亡实验对CSE1L敲除细胞系活力和凋亡进行检测。结果显示,小鼠成肌细胞中CSE1L基因mRNA和蛋白水平表达量都显著降低(P<0.01),提示CSE1L基因敲除成功。该基因缺失导致C2C12细胞变细长、细胞活力在72 h显著下调,细胞周期停滞、凋亡增加。成功构建了CSE1L基因敲除的细胞系,并研究了小鼠骨骼肌细胞生长发育相关功能,为探索CSE1L基因功能提供细胞模型,并为后续基因编辑敲除鼠制备奠定基础。

CRISPR-Cas9技术在肿瘤耐药基因筛选中的研究进展

耐药是使用肿瘤分子靶向药物治疗肿瘤面临的主要问题,目前筛选耐药基因常用策略主要为功能性基因筛选。近年来,CRISPR-Cas9基因编辑技术因具有精准、简便、高效的特点,在肿瘤相关基因的功能学研究中被广泛应用。本文就CRISPR-Cas9文库筛选技术的原理和在功能性基因筛选方面的应用进行了综述,同时对该技术的应用前景进行了展望。

利用CRISPR-Cas9技术构建S100A8基因敲除的CNE2细胞系

目的利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建S100A8基因敲除的CNE2稳定细胞系。方法通过慢病毒转染,构建可以稳定表达Cas9蛋白的CNE2细胞株。针对S100A8基因作用的功能区域,设计靶向S100A8基因的g RNA,构建Lentiguide-Puro-sg重组质粒并转化stbl3感受态细胞,筛选出重组子后通过测序验证g RNA的有效性。测序鉴定后将Lentiguide-Puro-sg重组载体通过转染试剂转染CNE2细胞系。通过嘌呤霉素进行阳性单克隆筛选,通过Western Blot检测S100A8基因的表达。结果测序结果显示LentiGuide-Puro-sg载体构建成功;Western Blot结果显示转染过LentiGuide-Puro-sg重组载体的细胞的S100A8不表达。结论利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了S100A8基因敲除的CNE2细胞,为后续继续研究S100A8基因在鼻咽癌细胞中的作用机制和功能奠定了基础。

基于CRISPR-Cas9技术构建gpr41基因敲除的RAW264.7细胞系

采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建G-蛋白偶联受体41(gpr41)基因敲除的RAW264.7细胞系。利用慢病毒转染,构建稳定表达Cas9蛋白的巨噬细胞株。针对gpr41基因作用的功能区域,设计靶向gpr41基因的向导RNA(gRNA),构建pLenticrisprV2重组质粒转化DH5α感受态细胞,筛选出重组子测序验证gRNA的有效性。鉴定成功的pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重组质粒采用转染试剂转染巨噬细胞系RAW264.7。筛选阳性单克隆细胞株,Western blot检测gpr41基因的表达。测序结果证实pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重组质粒构建成功;Western blot筛选出重组质粒pLenticrisprV2-gpr41-gRNA3转染RAW264.7细胞13号单克隆株的GPR41蛋白不表达。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了gpr41基因敲除的巨噬细胞株,为研究gpr41基因在RAW264.7细胞中的作用机制奠定基础。

CRISPR-Cas9技术在作物中研究进展

基因编辑技术CRISPR-Cas9系统的出现,为基因功能研究和作物改良提供了技术支持。本文就CRISPR-Cas9技术背景、发展等做了简要说明,综述了CRISPR-Cas9技术在基因敲除、定点整合和调控转录的应用中的原理、特点与前景,同时总结了针对CRISPR-Cas9技术缺点改进的最新研究成果,重点介绍了此技术在作物中应用情况,并对其在作物中的应用前景进行了展望。

CRISPR-Cas9技术在遗传性疾病基因治疗中的研究进展

CRISPR-Cas9是一种能够降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫防御系统。CRISPR/Cas9系统被开发成为新一代的基因编辑技术,其特点是构建相对简单、成本相对较低,可灵活快速地用于基因敲除、基因增补等操作。CRISPR/Cas9技术在人类遗传病治疗中具有重大的潜在意义,已被广泛应用于遗传病相关研究中。我们简要综述了近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术在地中海贫血、杜氏肌营养不良、帕金森症、Crygc基因突变引发的白内障、囊性纤维化、α1抗胰蛋白酶缺乏症、遗传性酪氨酸血症、血友病等遗传性疾病基因治疗中的研究进展。

CRISPR-Cas9技术原理及其在猪的应用研究新进展

成簇间隔短回文重复序列(CRISPR-Cas9)技术是研究细菌和古生菌重复序列得到的可抵抗病毒或质粒入侵获得性免疫防御技术,是一种由sgRNA指导Cas蛋白对目的基因定性定向编辑的技术。文章介绍CRISPR-Cas9技术原理和功能,整理CRISPR-Cas9技术对猪生产性能的影响,综述在猪抗病育种中的应用以及器官移植相关的最新研究。

CRISPR-Cas9技术在细菌中的研究进展及应用

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)最早发现于绝大多数细菌和古细菌中,帮助其防御和抵抗噬菌体和外来质粒的入侵。近年来,随着对该系统结构及功能的逐步深入认识和研究,CRISPR-Cas9技术已经发展成为一种简易高效的基因组定点编辑手段,但是在使用过程中仍存在一些问题。本文重点介绍了CRISPR-Cas9系统功能和分类,在细菌基因编辑中的应用和问题以及应对措施。

基于CRISPR-Cas9技术的鸡成纤维细胞系全基因组敲除文库的建立与初步应用

CRISPR-Cas9已被广泛证实是高效强大的第三代基因编辑工具。高通量且系统无偏的靶向全基因组水平编辑技术的应用对充分理解基因功能具有重要的意义。基于CRISPR-Cas9技术的大规模筛选方法已在哺乳动物研究领域取得重要进展,尽管鸡全基因组测序的工作已完成,但至今尚未有关于禽类CRISPR-Cas9文库的研究,严重限制了对其基因功能的解析。本研究利用CRISPR-Cas9技术构建鸡成纤维细胞系(DF-1)细胞全基因组敲除文库,并利用新城疫病毒(NDV)感染DF-1文库细胞,经过高通量测序筛选到sgRNA富集程度排名前10的影响NDV复制的关键宿主因子。该研究首次构建了鸡CRISPR-Cas9文库筛选模型,为进一步研究家禽免疫学、病毒学等提供强大高效的工具。

CRISPR-Cas9技术的发展与临床应用前景

CRISPR-Cas系统作为细菌、真菌体内的适应性免疫系统用以抵御外来噬菌体的感染。经过改造的CRISPR-Cas9已成为继ZFN、TALEN之后的第三代基因编辑技术。在CRISPR-Cas9基础上衍生的CRISPRi、CRISPRa等系统可以实现暂时抑制、激活或改变基因表观遗传学修饰的功能。相比传统基因编辑技术,CRISPR-Cas9具有效率高、操作简便、价格低等优势,因而在基因制备动物模型,治疗感染性疾病、遗传性疾病以及癌症等方面均有广阔的应用前景。本文主要对CRISPR-Cas9技术的发展与临床应用进展进行综述。

CRISPR-Cas9技术在非肿瘤性血液病中的应用

近来随着CRISPR-Cas9精确基因组编辑系统的出现,血液学疾病研究的方法学取得了革命性的进展。CRISPR-Cas9技术被证实可用于去除和纠正基因或突变,并在人类细胞中引入位点特异性治疗基因。因此,该系统介导的基因治疗已经成为遗传性血液疾病治疗的理想方法,并且有望在不久的将来通过纠正致病突变来缓解疾病相关症状。在人类使用CRISPR-Cas9介导的基因校正之前,必须确定具有高效率和特异性的适当的递送系统,同时须建立应用具有可控安全性的技术和道德准则。该文对CRISPR-Cas9技术在非肿瘤性血液学疾病中的应用现状、当前挑战和未来方向进行了综述和讨论。

CRISPR-Cas9技术在植物次生代谢物生产中的研究进展

基因编辑(gene editing)技术可以对目的基因进行定点插入、敲除和置换。基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术是继锌指核酸酶和转录激活样效应物核酸酶之后的第3代基因编辑技术。近年来,CRISPR-Cas9系统作为研究的热点被广泛应用于医学、药学、植物学、动物学和微生物学等领域,但其在植物次生代谢物领域的应用还处于探索时期。阐述了基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的发展历程、工作原理和几种常用的基因编辑方法及其应用实例,总结了CRISPR-Cas9技术在对植物次生代谢产物研究方面的应用。利用CRISPR-Cas9系统可对植物基因组进行定点敲除、突变和插入,以达到提高植物次生代谢物含量、改良作物品质和提高植物抗性等目的。该技术已在植物次生代谢物生物合成关键酶基因的编辑等方面显示出越来越重要的作用。

基于CRISPR-Cas9技术构建TET2基因敲除的鸡胚成纤维细胞系

为研究甲基胞嘧啶双加氧酶2(tet methylcytosine dioxygenase 2,TET2)及其介导的羟甲基化修饰在调控天然免疫反应中的作用,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建TET2基因敲除的鸡胚成纤维细胞系。针对鸡TET2 mRNA的2种剪接变体的共有CDS序列设计4组sgRNA,构建sgRNA表达质粒,连同Cas9-T2A-GFP质粒共转染DF-1细胞,筛选高切割效率的sgRNA;将转染该sgRNA的DF-1细胞,进行流式细胞分选,获取表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的细胞,再通过有限稀释法筛选单克隆细胞,并用DNA测序进行鉴定。单克隆敲除细胞扩大培养后,Western blot和Dot blot检测TET2蛋白的表达水平和羟甲基化(5hmC)水平。DNA测序结果表明,TET2-gRNA-2靶位点附近分别发生2和28 bp的缺失突变,引起TET2蛋白移码突变,将该细胞株命名为DT-6。DT-6细胞传代15次以上,细胞形态稳定。Western blot结果显示,与DF-1细胞相比,DT-6细胞几乎不表达TET2蛋白。Dot blot结果显示,与DF-1细胞相比,DT-6细胞全基因组羟甲基化水平显著降低。利用CRISPR-Cas9技术成功构建了敲除TET2基因的鸡胚成纤维细胞系,为研究鸡TET2及其介导羟甲基化修饰参与调控天然免疫反应的途径和分子机制奠定基础。

CRISPR-Cas9技术在医药领域中的应用

CRISPR-Cas9是存在于细菌和古细菌中的一种抵御噬菌体或质粒侵染的获得性免疫防御系统,它由成簇规律间隔短回文重复基因序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和Cas(CRISPR-associated)蛋白组成。天然的II型CRISPR系统已经被改造成第三代基因编辑工具,将单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)和作为DNA内切酶的Cas9蛋白导入细胞内,即可在基因组特定位置上进行基因编辑。由于CRISPR-Cas9具有简便高效、脱靶效应低等特点,目前已被广泛应用在动物、植物、微生物的生理和病理研究以及药物研发等领域。本文着重讲述了CRISPR-Cas9的作用机制以及它在医药领域中的应用,包括构建生物模型、疾病治疗、药物靶点筛选和CRISPR与免疫疗法的联合应用。

基于CRISPR-Cas9技术构建小鼠胚胎干细胞双荧光标记细胞系

目的构建p53-EGFP、Nanog-mcherry双荧光标记细胞系,对小鼠胚胎干细胞内p53、Nanog蛋白表达水平进行实时、定量追踪。在此基础上,初步探讨p53在小鼠胚胎干细胞中的作用。方法利用CRISPR-Cas9基因敲入系统分别将外源荧光蛋白表达基因插入到p53、Nanog基因组终止密码子后方,实现p53-EGFP、Nanog-mcherry融合表达。通过荧光强度分析,克隆形成能力检测等方法探索p53在小鼠胚胎干细胞中的作用。结果本研究成功构建了小鼠胚胎干细胞p53-EGFP、Nanog-mcherry双荧光标记细胞系,进一步发现p53蛋白表达在小鼠胚胎干细胞间具有异质性,且能调控Nanog蛋白表达的异质性。此外,p53蛋白表达量与小鼠胚胎干细胞克隆形成能力有关。结论基于CRISPR-Cas9基因敲入技术构建的双荧光标记细胞系中荧光强度的变化可以在活细胞状态下代表小鼠胚胎干细胞内相应蛋白表达水平,p53可通过其在小鼠胚胎干细胞群体间异质性表达参与小鼠胚胎干细胞转录调控网络中,并一定程度影响其自我更新能力。

利用CRISPR-Cas9技术编辑Badh2基因创制优质香型籼稻三系不育系

稻米香味是水稻的重要食味品质之一,其主要受第8染色体上编码甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制,该基因突变可导致香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量增加从而促进香味的产生。本研究以三明市农业科学研究院自主选育的优质籼型杂交稻保持系明太B为受体,利用CRISPR-Cas9技术对其Badh2基因进行编辑和敲除。获得2个T0代转基因纯合突变体植株并对其衍生的48个T1代单株进行鉴定和分析,获得1个不含转基因载体骨架且在第2外显子插入单个碱基T的纯合突变体株系明太B-badh2。利用半定量PCR和qRT-PCR技术以及气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测Badh2基因相对表达量和2-AP含量;同时采用农业行业标准(NY/T1433-2014)推荐的48对水稻SSR引物进行指纹图谱分析。结果表明,该株系Badh2基因RNA表达水平显著下调;籽粒中香味物质2-AP的含量显著增加;指纹图谱分析发现,仅1对引物Rm571在野生型和突变体之间鉴定到等位变异,两组材料遗传差异较小。此外,本研究还对野生型和突变体T2代植株表型性状、稻米蒸煮食味品质和外观品质指标进行了考察和测定分析。结果表明,所有指标在两组材料间均无显著差异。进一步采用测交和回交转育方法并结合Badh2位点测序分析,成功选育获得了其对应的纯合香型三系不育系明太A-badh2。通过与恢复系明恢703、明恢3009测配,其组合产量与国家审定品种明太优703、明太优3009相近且表现出较强的超标优势。此外,通过与香型恢复系明恢1831测配后发现其组合籽粒中香味物质2-AP含量极显著高于对照组合明太A/明恢1831。因此,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,可对水稻香味基因Badh2进行精准定向编辑和敲除,实现对水稻香味性状的改良,为创制香型籼稻不育系提供理论指导,从而加快香型杂交稻育种进程。

CRISPR-Cas9技术修饰乳酸杆菌的研究进展

乳酸杆菌是一种具有促进人类健康的菌株,在食品工业中具有悠久的使用历史。近年来,基因编辑技术成为了开发利用微生物的有效工具。其中,成簇规律性间隔短回文(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相关因子(CRISPR-associated,Cas)所组成的CRISPR-Cas9技术由于步骤简便、效率高且准确性高等优势,已经被广泛地运用于基因编辑的研究中。将CRISPR-Cas9技术应用于乳酸杆菌将促进对其本身生理特性及其促进人体健康分子机制的研究,从而推动下一代具有定制功能乳酸杆菌的开发。本文综述了部分乳酸杆菌在食品加工中的应用以及CRISPR-Cas9技术在乳酸杆菌中的应用进展,旨在为国内乳酸杆菌生物工程化的研究与开发提供一些思路。

CRISPR-Cas9技术介导蔬菜作物遗传改良研究进展

在植物中,CRISPR-Cas基因组编辑技术是一种改变基因功能并改良作物品种的新技术。与传统育种相比,CRISPR-Cas是一种操作简单、低成本、高效精准的技术,并且脱靶风险较低。蔬菜作物富含膳食纤维、维生素和矿物质,对人类健康至关重要。然而,随着气候环境的变化,生物和非生物胁迫对蔬菜的生产构成严重威胁,影响品质和产量。在综述中,概述了CRISPR技术发展史、CRISPR-Cas工具箱的组成、现有Cas蛋白的变体、CRISPR-Cas元件转化到植物中的方法以及基因编辑系统在蔬菜作物遗传改良应用中的具体案例,最后提出了CRISPR-Cas技术在蔬菜育种中的挑战和应用前景。

利用CRISPR-Cas9技术编辑ZmSh2基因创制超甜玉米新种质

选取玉米ZmSh2基因,利用CRISPR-Cas9技术构建基因编辑载体pBUE411-ZmSh2,以玉米C01未成熟的幼胚组织为受体,利用农杆菌介导法将目的基因转入到玉米幼胚中,以草铵膦为选择剂进行筛选获得ZmSh2基因编辑的突变体株系。通过表型观察发现,编辑的纯合突变体材料明显比对照玉米自交系C01褶皱,使用手持式糖度仪检测突变体植株的甜度可达到25%。结果表明,利用CRISPR-Cas9技术能够创制出超甜玉米新种质材料,为CRISPR-Cas9介导玉米其他性状定向遗传改良提供了重要的理论和实践依据。